羅成 蘇斌 高燕妮

(聯(lián)勤保障部隊第九二○醫(yī)院腫瘤內科,云南 昆明 650032)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一〔1〕,主要治療方法包括根治性切除和化學療法。由于腫瘤復發(fā)和轉移的頻率很高,肝癌患者的預后仍然很差,其5年生存率低于25%〔2〕。因此,進一步了解肝癌進展的分子機制,尋找用于肝癌診斷的新型生物標志物和確定有效的治療靶標十分迫切。環(huán)狀RNA(circRNA)普遍存在于哺乳動物細胞中,是單鏈RNA的共價閉合連續(xù)環(huán)型,并調節(jié)基因表達〔3〕。CircRNA可以充當競爭性內源性RNA(ceRNA),通過直接與微小RNA(miRNA)結合來海綿化其靶標miRNA,調節(jié)其活性〔4〕。circRNA在幾種癌癥組織中異常表達,其在腫瘤發(fā)生中的關鍵作用已得到證明〔5〕。Hsa_circ_0023404,一種新型鑒定的circRNA,據(jù)報道在非小細胞肺癌組織及細胞系中的表達均上調,通過調節(jié)miR-217/鋅指E盒結合同源盒蛋白(ZEB)1軸促進非小細胞肺癌的增殖、遷移和侵襲〔6〕。hsa_circ_0023404通過調節(jié)miR-136/轉錄因子(TF)CP2/Hippo/Yes相關蛋白(YAP)途徑在宮頸癌中發(fā)揮致癌作用〔7〕。長度約為22 nt的miRNA是生物過程中的重要介體,它們通過抑制翻譯或直接降解目標mRNA來負調控基因表達〔8〕。miR-153在肝癌組織和細胞系中表達下調,對肝癌細胞具有抗遷移和抗侵襲的能力〔9〕。miR-153通過靶向Snail抑制肝癌細胞的上皮向間充質轉化〔10〕。然而,hsa_circ_0023404的分子功能及其潛在的下游miRNA靶基因在肝癌發(fā)病機制中的作用尚未得到探索?；诖?本研究考察hsa_circ_0023404在肝癌組織中的表達及對肝癌細胞HCC9204增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響,通過探討hsa_circ_0023404與miR-153之間靶向關系,旨在闡明其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 收集2016年3月至2017年6月于聯(lián)勤保障部隊第九二○醫(yī)院的39例手術切除的肝癌及鄰近的非腫瘤標本(癌旁組織)。排除收集前接受化學療法或放射療法的患者。樣本均在患者同意下收集并簽名知情同意,經(jīng)病理學確診為肝癌。實驗方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

肝癌細胞HCC9204(上海晶抗生物工程有限公司),Trizol試劑、Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司),TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems),One Step PrimeScript cDNA試劑盒(德國Qiagen),Roswell Park Memorial Institute RPMI1640培養(yǎng)基、結晶紫(北京Solarbio),si-NC、si-hsa_circ_0023404、miR-NC、miR-153模擬物、anti-miR-NC、miR-153抑制劑(上海GenePharma),細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8(上海Beyotime),膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(美國BioVision),pGL3 Basic報告載體、雙螢光素酶測定系統(tǒng)(美國Promega),Quick Change Lightning試劑盒(美國Stratagene)。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 應用Trizol試劑從肝癌組織和癌旁組織中分離總RNA。cDNA的合成使用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(miR-153)及One Step PrimeScript cDNA試劑盒(hsa_circ_0023404)進行。使用Applied Biosystems GeneAmp 7500系統(tǒng)一式3份進行qRT-PCR確定hsa_circ_0023404表達。同時,進行TaqMan MicroRNA分析評估m(xù)iR-153 表達。GAPDH被用作hsa_circ_0023404的內源參考基因,而U6被用作miR-153的加載對照。使用2-ΔΔCt方法計算hsa_circ_0023404、miR-153 mRNA相對表達。引物如下：has-circ_0023404正向：5′-CTGGTGCAGTGGAAGCAGAG-3′,反向：5′-CGACCCTCCATTGCTCTTCT-3′;miR-153正向：5′-TTGCATAGTCACAAA AGTGAT-3′,反向：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;GAPDH正向：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,反向：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′;U6正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,反向：5′-ACGC TTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.3細胞培養(yǎng)與分組 將肝癌細胞HCC9204在RPMI1640培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清(FBS),在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。肝癌細胞HCC9204分為si-NC組(轉染si-NC),si-hsa_circ_0023404組(轉染si-hsa_circ_0023404),miR-NC組(轉染miR-NC),miR-153組(轉染miR-153模擬物),si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組(共轉染si-hsa_circ_0023404和anti-miR-NC),si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組(共轉染si-hsa_circ_0023404+miR-153抑制劑)。使用Lipofectamine 2000將這些質粒按照分組轉染到肝癌細胞HCC9204中。轉染后48 h,收獲細胞,根據(jù)1.2中qRT-PCR測定hsa_circ_0023404和miR-153表達,并用于以下研究。

1.4CCK-8測定 將肝癌細胞HCC9204以2×103個細胞/孔接種在96孔板中,并在含有10% FBS的培養(yǎng)基中生長24 h。細胞HCC9204以1.3中不同分組轉染后,將10 μl CCK-8溶液添加到每個孔中,并將細胞在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育2 h。使用Bio-Rad分光光度計讀取每個孔在450 nm處的吸光度(OD)值,以(1-OD實驗組/OD對照組)×100%計算抑制率(%)。

1.5平板克隆實驗 將肝癌細胞HCC9204以2×103個細胞/孔接種在6孔板中,并在含有10% FBS的培養(yǎng)基中生長。14 d后,將細胞HCC9204用甲醇固定,結晶紫染色,統(tǒng)計集落(>50個細胞)的形成數(shù)。

1.6流式細胞術 肝癌細胞HCC9204(5×105個細胞)根據(jù)制造商的說明步驟,用Annexin V-FITC和PI進行染色,并于流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.7Western印跡 收獲肝癌細胞HCC9204并在RIPA緩沖液中裂解提取總蛋白。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離50 μg的蛋白,并將其轉移到硝酸纖維素膜上。然后,將膜與抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、抗Bcl-2相關X蛋白(Bax)、抗E-鈣黏蛋白(cadherin)、抗N-cadherin和抗GAPDH(對照)一抗在4 ℃孵育12 h。之后,將二抗與膜一起孵育。電化學發(fā)光(ECL)底物用于可視化蛋白條帶,在成像系統(tǒng)和Image LabTM軟件v5.2.1通過光密度分析法對蛋白條帶進行定量。

1.8Transwell測定 在8.0 μmol/L孔膜的Transwell小室進行測定。侵襲實驗：將肝癌細胞HCC9204(1×105個細胞)重懸于200 μl不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中,然后用基質膠包被頂室中。將500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基作為化學吸引劑添加到底部腔室中。溫育后24 h后,用棉簽輕輕移出Transwell膜上表面的細胞,并用甲醇固定Transwell膜下表面的細胞,用0.5%結晶紫染色,并在倒置顯微鏡下計數(shù)侵襲的細胞。遷移實驗：Transwell頂室未用基質膠包被,其余步驟相同。

1.9雙熒光素酶報告實驗 在生物信息學預測軟件Circular RNA Interactome中預測hsa_circ_0023404與miR-153的靶向結合。擴增含有miR-153預測結合位點的野生型(wt)has-circ_0023404序列,并亞克隆到pGL3 Basic報告載體中,生成wt-circ_0023404。使用Quick Change Lightning試劑盒進行定點誘變,以構建has-circ_0023404的突變型(mut)序列,并生成mut-circ_0023404。用wt-circ_0023404,mut-circ_0023404與miR-153模擬物、陰性對照miR-NC轉染肝癌細胞HCC9204。轉染后48 h收集細胞,并按照制造商的說明使用雙螢光素酶測定系統(tǒng)進行分析。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1hsa_circ_0023404和miR-153在肝癌中的表達 39例肝癌組織中hsa_circ_0023404表達量(5.40±0.37)明顯高于癌旁組織(1.00±0.11),miR-153表達量(0.26±0.05)明顯低于癌旁組織(1.00±0.10;t=71.86、12.057,均P=0.000)。

2.2干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204增殖凋亡的影響 如圖1、表1所示,在肝癌細胞HCC9204中轉染si-hsa_circ_0023404以干擾hsa_circ_0023404表達,發(fā)現(xiàn)si-hsa_circ_0023404組hsa_circ_0023404表達量明顯低于si-NC組(P<0.05),提示成功干擾hsa_circ_0023404。與si-NC組相比,si-hsa_circ_0023404組細胞HCC9204的miR-153表達量、抑制率明顯增加,集落形成數(shù)明顯減少,凋亡率和Bax蛋白表達明顯升高,Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)。

表1 干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204增殖凋亡的影響

1～2：si-NC組,si-hsa-circ_0023404組

2.3干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204遷移、侵襲的影響 如表2、圖2、圖3所示,細胞HCC9204中干擾hsa_circ_0023404后,si-hsa_circ_0023404組遷移和侵襲細胞數(shù)低于si-NC組,而E-cadherin蛋白表達量高于si-NC組,N-cadherin蛋白表達量低于si-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表2 干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204遷移侵襲的影響

圖2 干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204遷移、侵襲的影響(結晶紫染色,×200)

1～6：si-NC組、si-hsa-circ_0023404組、miR-NC組、miR-153組、si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組、si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組圖3 兩組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

2.4hsa_circ_0023404和miR-153靶向關系的驗證 如圖4、表3所示,Circular RNA Interactome(生物信息學預測軟件)中預測到hsa_circ_0023404和miR-153的靶向結合位點。miR-153模擬物與wt-hsa_circ_0023404共轉染時細胞HCC9204的熒光活性明顯低于miR-NC與wt-hsa_circ_0023404共轉染時(P<0.05),miR-153模擬物或miR-NC與mut-hsa_circ_0023404共轉染時,細胞HCC9204的熒光活性不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖4 hsa_circ_0023404和miR-153的互補序列

2.5miR-153對細胞HCC9204增殖凋亡的影響 如圖5、表4所示,在肝癌細胞HCC9204中轉染miR-153模擬物,結果顯示,miR-153組miR-153表達量和抑制率較miR-NC組高,集落形成數(shù)較miR-NC組低,凋亡率和Bax蛋白表達較miR-NC組高,Bcl-2蛋白表達量較miR-NC組低,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表4 miR-153對細胞HCC9204增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

1～2：miR-NC組,miR-153組

2.6miR-153對細胞HCC9204遷移侵襲的影響 如圖3、表4、圖6所示,miR-153組較miR-NC組減少細胞HCC9204的遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù),增加E-cadherin蛋白表達,降低N-cadherin蛋白表達,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

圖6 miR-153對細胞HCC9204遷移侵襲(結晶紫染色,×200)的影響

2.7抑制miR-153可逆轉干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204增殖凋亡的影響 如圖7、表5所示,si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組細胞HCC9204的miR-153表達量和抑制率較si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組低,集落形成數(shù)較si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組高,凋亡率和Bax蛋白表達較si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組低,Bcl-2蛋白表達量較si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組高,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表5 抑制miR-153可逆轉干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204增殖凋亡的影響

1～2：si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組,si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組

2.8抑制miR-153可逆轉干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204遷移侵襲的影響 如圖3、表6、圖8所示,si-hsa_circ_0023404+anti-miR-153組細胞HCC9204的遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)高于si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組,E-cadherin蛋白表達量低于si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組,N-cad-herin蛋白表達量高于si-hsa_circ_0023404+anti-miR-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表6 抑制miR-153可逆轉干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204遷移侵襲的影響

圖8 抑制miR-153可逆轉干擾hsa_circ_0023404對細胞HCC9204遷移侵襲(結晶紫染色,×200)的影響

3 討 論

肝癌的臨床特征是侵襲性,預后差和治療機會有限,發(fā)病率和死亡率仍然很高〔11〕。更重要的是對肝癌的分子發(fā)病機制和治療靶標知之甚少。因此,了解肝癌的致病過程及其調控機制對肝癌的管理具有重要意義。

異常表達circRNA在肝癌發(fā)生和進展起著至關重要作用,可以調節(jié)腫瘤細胞惡性行為,包括癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡〔12〕。有研究已經(jīng)確定hsa_circ_0023404是腫瘤發(fā)生中的關鍵調節(jié)因子〔6〕。與相鄰的正常組織相比,宮頸癌組織中circRNA hsa_circ_0023404顯著上調,與患者的預后不良有關。在功能上,敲低hsa_circ_0023404可以顯著抑制增殖,阻滯細胞周期進程并抑制宮頸癌中的細胞遷移和侵襲〔7〕。hsa_circ_0023404通過海綿miR-5047,進而調節(jié)血管內皮生長因子(VEGF)A基因的表達和自噬信號傳導途徑,促進宮頸癌轉移和對順鉑的化學耐藥性〔13〕。hsa_circ_0023404高表達預示著非小細胞肺癌總體生存期短,敲低hsa_circ_0023404可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。盡管已經(jīng)開始闡明hsa_circ_0023404在腫瘤發(fā)生中的作用,但目前尚不了解hsa_circ_0023404在肝癌病理進展中的表達及其調控機制。研究結果表明,hsa_circ_0023404在肝癌進程中起致癌作用,并可能成為肝癌的潛在預后生物標志物和有希望的治療靶標。

miR-153在各種癌癥中異常表達,并在腫瘤發(fā)生中起關鍵作用〔14,15〕。在人膀胱移行細胞乳頭瘤細胞(RT4)進行的功能獲得研究表明,miR-153在膀胱癌中具有抗侵襲、抗遷移作用〔16〕。在宮頸癌細胞系中的功能研究表明,Hela、C-33A細胞中miR-153過表達負調節(jié)人多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉移酶(GALNT)7表達,從而減弱細胞增殖、遷移和侵襲,表明miR-153具有抑癌活性〔17〕。在人喉鱗狀細胞癌細胞中,miR-153敲低通過靶向人蝸牛同源物1(果蠅)樣1蛋白(SNAI1)抑制PCI-13細胞的遷移和侵襲〔18〕。miR-153在非小細胞肺癌中通過靶向SRC促癌基因抑制細胞生長和轉移,并促進細胞凋亡〔19〕。此外,與正常肝上皮細胞和相匹配的正常肝組織相比,miR-153在肝癌細胞系和組織表達明顯下調。miR-153異位表達抑制了肝癌細胞的遷移和侵襲能力,而抑制miR-153可以挽救這種抑制作用〔20〕。本研究數(shù)據(jù)再次支持了上述觀點,即miR-153在肝癌組織中低表達,且充當抑癌因子,抑制肝癌細胞HCC9204的增殖、侵襲和侵襲及誘導凋亡。

眾所周知,circRNA可以結合其靶向的miRNA,并作為ceRNA發(fā)揮作用,從而抑制這些miRNA并抑制其活性〔21〕。Hsa_circ_0023404充當miR-136海綿,以增加基質金屬蛋白酶13的表達并抑制軟骨細胞外基質的形成〔22〕。但是,尚未探討miR-153在hsa_circ_0023404介導的肝癌細胞惡性生物學行為中的潛在作用。本研究發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0023404靶向肝癌細胞中的miR-153,因為miR-153過表達減輕了wt-hsa_circ_0023404調節(jié)的熒光素酶活性,而干擾hsa_circ_0023404提高了肝癌細胞HCC9204中miR-153的表達。更重要的是,抑制miR-153后,逆轉了干擾hsa_circ_0023404對肝癌細胞HCC9204惡性行為的影響。這些發(fā)現(xiàn)可能為circRNA-miRNA網(wǎng)絡上,hsa_circ_0023404靶向miR-153以調控肝癌進程的分子調控途徑提供新的見解。

綜上,hsa_circ_0023404在肝癌組中被上調,干擾其表達可以減弱肝癌細胞的增殖和轉移,同時促進凋亡。此外,hsa_circ_0023404通過靶向miR-153來增強肝癌細胞的惡性行為。