高莉 宋令崗

(滕州市中心人民醫(yī)院心血管內(nèi)三科,山東 滕州 277500)

心肌纖維化(MF)是高血壓心臟病患者不可避免的并發(fā)癥,與多種心血管疾病密切相關(guān),如缺血性心肌病、擴張型心肌病、肥厚型心肌病和血管性心臟病〔1,2〕。因此,開發(fā)新的策略和(或)藥物來預防或逆轉(zhuǎn)MF已成為治療心臟病的關(guān)鍵。高血壓MF的發(fā)生涉及多種因素,其中血管緊張素(Ang)Ⅱ是最重要的因素〔3〕,作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的效應物,Ang Ⅱ可通過促進細胞外基質(zhì)(ECM)沉積來誘導纖維化〔4〕。大量證據(jù)表明,高血壓期間發(fā)生全身和局部RAS的過度激活,導致心臟組織中Ang Ⅱ顯著增加,過量的Ang Ⅱ可刺激成纖維細胞增殖、分化為肌成纖維細胞和膠原蛋白分泌〔5,6〕。研究表明,Ang Ⅱ誘導的高血壓MF需轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的參與〔7〕,TGF-β1是誘導成纖維細胞增殖、分化和膠原合成的最強促纖維化因子之一〔8〕。Ang Ⅱ可通過上調(diào)TGF-β1表達和隨后激活TGF-β1/Smad信號通路來誘導MF〔9〕。表明調(diào)控TGF-β1/Smad信號通路在高血壓MF中具有重要意義。

MicroRNAs(miRs)是高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA,長度約為23個核苷酸,通過抑制多個靶標mRNA的翻譯或裂解來負調(diào)節(jié)信使RNA(mRNA)的表達〔10〕。在miRs中,miR-145在心血管系統(tǒng)中大量表達,具有多種功能,有證據(jù)表明,miR-145是治療高血壓的潛在靶點〔11〕,并且可以保護心肌細胞免受過缺氧誘導的細胞凋亡〔12〕,還可減輕心臟缺血/再灌注損傷〔13〕;在心肌梗死中,miR-145過表達可顯著改善心臟纖維化和心臟功能,減弱心臟重構(gòu)〔14,15〕。另有研究顯示,TGF-β1活性受miR-145調(diào)節(jié),在心肌梗死模型和Ang Ⅱ處理的心臟成纖維細胞中,miR-145下調(diào),并可通過調(diào)節(jié)TGF-β1活性來促進MF并惡化心臟功能〔16〕。然而,miR-145在高血壓MF中的具體作用仍不清楚。因此,本研究選擇自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為動物模型,觀察miR-145的表達及其對高血壓大鼠MF的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只SHR,12只Wistar大鼠,均為SPF級,雄性,體質(zhì)量(250～300)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證為SCXK(京)2019-0009。將所有大鼠放在可控制的光照下保持12 h明暗交替,溫度(20±2)℃,相對濕度為45%～60%,可以自由獲取食物和水。

1.2主要試劑及儀器 TGF-β1重組細胞因子(HY-P70648)購自美國MedChemExpress公司;重組腺相關(guān)病毒血清型(rAAV)9載體攜帶miR-145 mimic(rAAV9-miR-145 mimic)基因及其陰性對照(rAAV9-mimic NC)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)引物購自上海GenePharm公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑(C0105)、RIPA裂解緩沖液(P0013B)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(P0010)均購自碧云天生物科技公司;Masson三色染色試劑盒(G1340)購自北京Solarbio公司;大鼠肌酸激酶同工酶MB(CK-MB,ml059533)、心肌肌鈣蛋白(cTn)I(ml059111)、Ang Ⅱ(ml058803)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;兔源一抗TGF-β1(ab215715)、Smad2(ab40855)、p-Smad2(ab188334)、Smad3(ab40854)、p-Smad3(ab52903)、Smad7(ab216428)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ,ab260043)、Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ,ab278080)、β-actin(ab8227)及二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)均購自英國Abcam公司。

NanoDrop 2000分光光度計(美國Thermo Scientific);ABI 7500 RT-qPCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司);iMark680多功能酶標儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司);BX61電動顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3動物分組及干預 按照隨機數(shù)字表法將SHR分為模型組、rAAV9-mimic NC組、rAAV9-miR-145 mimic組、TGF-β1組、rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組,每組12只;另設(shè)12只Wistar大鼠為對照組。rAAV9-mimic NC組通過尾靜脈注射rAAV9-mimic NC(2×1011個載體基因組顆粒/每只大鼠);rAAV9-miR-145 mimic組尾靜脈注射rAAV9-miR-145 mimic(2×1011個載體基因組顆粒/每只大鼠),TGF-β1組經(jīng)尾靜脈給予TGF-β1(1.25 μg/kg)〔17〕,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組大鼠經(jīng)尾靜脈給予rAAV9-miR-145 mimic(2×1011個載體基因組顆粒/每只大鼠)和TGF-β1(1.25 μg/kg),對照組和模型組尾靜脈注射生理鹽水,rAAV9-mimic NC和rAAV9-miR-145 mimic的注射時間為1次/w,實驗周期為21 d,共注射3次;TGF-β1注射時間為1次/d,共注射21次。

1.4血壓檢測 于治療前1 d和治療第7、14、21天采用Softtron BP-98A智能無創(chuàng)鼠尾動脈血壓計在上午的固定時間段測量清醒、安靜狀態(tài)下大鼠尾部動脈收縮壓。測量1次/w,每次測3遍取均值。

1.5血清心肌酶和血漿Ang Ⅱ水平檢測 實驗結(jié)束時,大鼠禁食過夜后腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,腹主動脈取血,靜置后以3 000 r/min離心15 min,分離血清,按照試劑盒說明書的操作檢測血清中CK-MB、cTnI水平。另將2 ml血樣收集到添加有抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)的負壓管中,通過在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min來分離血漿,通過ELISA法測定血漿Ang Ⅱ水平。

1.6左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)檢測 取血完成后,取出大鼠心臟并用冰冷的生理鹽水沖洗。濾紙干燥后,解剖左心室并稱重計算LVMI,其定義為左心室重量與體質(zhì)量之比(mg/g)。

1.7心肌組織病理學變化 取大鼠心肌左心室組織,分為三部分,兩部分置于-80 ℃冰箱中保存,分別用于RT-qPCR和Western印跡實驗;最后一部分用4%多聚甲醛固定,梯度酒精脫水,石蠟包埋,切片。進行HE染色和Masson染色觀察心室組織病理學變化,并在光學顯微鏡下觀察膠原蛋白的沉積,計算膠原容積分數(shù)(CVF)。在Masson染色切片中,心肌細胞被染成紅色,而膠原蛋白被染成藍色,細胞核染成黑色。每個樣品選擇3個視野,用Image-Pro Plus6.0軟件分析每個顯微視野中膠原蛋白染成藍色的區(qū)域占總面積的百分比,即CVF。

1.8免疫組織化學染色檢測心室組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達 取1.7項下制備的石蠟塊,切3 mm厚的切片,二甲苯脫蠟,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,微波修復15 min,加入3% H2O2孵育10 min,再次清洗后,用10%山羊血清封閉30 min,然后將切片與Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ一抗(1∶150)在4 ℃下孵育過夜,然后與二抗在室溫下孵育2 h。在光學顯微鏡下觀察,每個樣品隨機選擇3個視野,拍照后用Image-Pro Plus6.0軟件計算積分光密度(IOD)以測量Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達水平。

1.9RT-qPCR檢測心肌組織miR-145、TGF-β1、Smad3、Smad2和Smad7的mRNA的表達 取出-80 ℃冰箱的部分左心室組織。使用Trizol試劑提取總RNA。使用分光光度計對總RNA進行定量檢測。按照試劑盒制造商的說明進行逆轉(zhuǎn)錄,收集cDNA用于RT-qPCR擴增。反應體系(20 μl)：cDNA(200 ng/μl)2 μl,SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)10 μl,上下游引物(引物序列見表1)各0.4 μl,ddH2O 7.2 μl。反應條件：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,進行40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法將miR-145的相對表達歸一化為U6,將TGF-β1、Smad3、Smad2和Smad7的mRNA表達歸一化為β-actin。引物序列為：miR-145：上游：5′-TGTCCAGTTTTCCCAGGAATC-3′,下游：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′;TGF-β1上游：5′-CTAATGGTGGACCGCAACAAC-3′,下游：5′-C ACTGCTTCCCGAATGTCTGA-3′;Smad3上游：5′-C CTCCTGGCTACCTGAGTGAAGAT-3′,下游：5′-GCTGTAGGTCCAAGTTATTGTGTGC-3′;Smad7上游：5′-TTGTGTCCTGTGTGTCTCGTTCTTT-3′,下游：5′-TG ACTCTTGCTTCCCGTTTTTGTAT-3′;Smad2上游：5′-TCACAGCCATCATGAGCTCAAGG-3′,下游：5′-TCACAGCCATCATGAGCTCAAGG-3′;U6上游：5′-CCTGCTTCGGCAGCACAT-3′,下游：5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′;β-actin上游：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,下游：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

1.10Western印跡檢測心肌組織TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白的表達 用RIPA裂解緩沖液提取左心室組織總蛋白,用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。用5%脫脂牛奶封閉后,將膜與TGF-β1(1∶1 000)、Smad3(1∶3 000)、p-Smad3(1∶2 000)、Smad2(1∶2 000)、p-Smad2(1∶1 000)、Smad7(1∶500)和β-actin(1∶4 000)的一抗在4 ℃下孵育過夜,然后用辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。電化學發(fā)光(ECL)顯色,使蛋白可視化。用Image-Pro Plus6.0分析蛋白質(zhì)條帶灰度,并以β-actin為內(nèi)參蛋白,計算目的蛋白相對表達水平。

1.11統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8.0和SPSS22.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血壓變化比較 治療前,與對照組比較,其余各組SHR收縮壓均顯著升高(均P<0.05);在治療第14、21天時,與模型組相比,rAAV9-mimic NC組收縮壓無明顯變化(P>0.05),rAAV9-miR-145 mimic組收縮壓顯著下降(P<0.05),TGF-β1組收縮壓顯著上升(P<0.05);與rAAV9-miR-145 mimic組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組收縮壓顯著上升(P<0.05);與TGF-β1組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組收縮壓顯著下降(P<0.05);見表1。

2.2各組血清心肌酶和血漿Ang Ⅱ水平 與對照組相比,模型組血清CK-MB、cTnI和血漿Ang Ⅱ水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,rAAV9-mimic NC組上述指標水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),rAAV9-miR-145 mimic組上述指標水平顯著降低,TGF-β1組上述指標水平顯著升高(P<0.05);與rAAV9-miR-145 mimic組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組上述指標水平顯著升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組上述指標水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清CK-MB、cTnI、血漿Ang Ⅱ水平LVMI、CVF比較

2.3各組LVMI比較 與對照組相比,模型組LVMI顯著升高(P<0.05);與模型組相比,rAAV9-mimic NC組LVMI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),rAAV9-miR-145 mimic組LVMI顯著下降,TGF-β1組LVMI顯著升高(P<0.05);與rAAV9-miR-145 mimic組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組LVMI顯著升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組LVMI顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.4各組心肌組織病理學變化 HE染色和Masson染色結(jié)果顯示,對照組心肌細胞排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰,心肌肌束間有少量膠原沉積;模型組心肌細胞增大、排列紊亂,細胞間隙增寬,間隙有大量纖維結(jié)締組織增生,有明顯的炎性細胞浸潤和大量藍色膠原纖維沉積,CVF較對照組顯著增加(P<0.05);與模型組相比,rAAV9-mimic NC組心肌病理損傷和纖維化程度無明顯變化,rAAV9-miR-145 mimic組心肌細胞排列紊亂、結(jié)締組織增生和炎性細胞浸潤情況明顯改善,心肌細胞膠原沉積明顯減少,CVF顯著降低(P<0.05),而TGF-β1組心肌病理損傷程度加重,膠原沉積增加,CVF顯著增加(P<0.05);與rAAV9-miR-145 mimic組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組心肌損傷和纖維化程度有所加重,CVF顯著增加(P<0.05);與TGF-β1組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組心肌損傷和纖維化程度有明顯改善,CVF顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1。

2.5各組心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達比較 與對照組相比,模型組Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,rAAV9-mimic NC組Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),rAAV9-miR-145 mimic組Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達水平顯著下降,TGF-β1組Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達水平顯著升高(P<0.05);與rAAV9-miR-145 mimic組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達水平顯著升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 各組心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ表達比較

2.6各組心肌組織miR-145、TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA表達比較 與對照組相比,模型組miR-145、Smad7 mRNA表達顯著降低,TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達顯著升高(P<0.05);與模型組相比,rAAV9-mimic NC組上述指標表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),rAAV9-miR-145 mimic組miR-145、Smad7 mRNA表達顯著升高,TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達顯著降低(P<0.05),TGF-β1組miR-145、Smad7 mRNA表達顯著降低,TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達顯著升高(P<0.05);與rAAV9-miR-145 mimic組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組miR-145、Smad7 mRNA表達顯著降低,TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達顯著升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組miR-145、Smad7 mRNA表達顯著升高,TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組心肌組織miR-145、TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA表達比較

2.7各組心肌組織TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白表達比較 與對照組相比,模型組TGF-β1蛋白表達、p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3比值顯著升高,Smad7蛋白表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,rAAV9-mimic NC組上述蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),rAAV9-miR-145 mimic組TGF-β1蛋白表達、p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3比值顯著降低,Smad7蛋白表達顯著升高(P<0.05),TGF-β1組Smad7蛋白表達顯著降低,TGF-β1蛋白表達、p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3比值顯著升高(P<0.05);與rAAV9-miR-145 mimic組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組Smad7蛋白表達顯著降低,TGF-β1蛋白表達、p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3比值顯著升高(P<0.05);與TGF-β1組相比,rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組Smad7蛋白表達顯著升高,TGF-β1蛋白表達、p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3比值顯著降低(P<0.05)。見表5、圖3。

1～5：對照組、模型組、rAAV9-mimic NC組、rAAV9-miR-145 mimic組、TGF-β1組、rAAV9-miR-145 mimic+TGF-β1組圖3 各組心肌組織TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白表達

表5 各組心肌組織TGF-β1/Smad通路相關(guān)蛋白表達比較

3 討 論

TGF-β是一種多功能細胞因子,由多種細胞合成,調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化及ECM的合成,在纖維化的形成過程中起關(guān)鍵作用。TGF-β有3種亞型,其中TGF-β1是主要的促纖維化因子,Ang Ⅱ可上調(diào)TGF-β1,進而激活TGF-β1/Smad信號通路,促進心臟成纖維細胞增殖和膠原合成,進而導致MF〔9〕。研究發(fā)現(xiàn),許多miRs可通過調(diào)控TGF-β1在MF中發(fā)揮重要作用,如miR-128-3p〔18〕、miR-195〔19〕、miR-9〔20〕。miR-145已被證明在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用,具有改善MF、保護心臟的作用,可能代表一種新的潛在藥理學治療靶點。本研究結(jié)果說明,SHR中miR-145水平的降低可能與高血壓大鼠MF有關(guān),提示上調(diào)miR-145可減輕高血壓大鼠MF,但潛在的心臟保護機制仍未闡明。

TGF-β1被證明是miR-145的下游靶點,據(jù)報道,在慢性腎病中,miR-145的敲低可加重TGF-β1誘導的腎纖維化〔21〕;在Ang Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞中,miR-145的表達下調(diào),并可通過調(diào)節(jié)TGF-β1活性來促進MF并惡化心肌梗死后的心臟功能〔16〕。Smads蛋白家族在將TGF-β1信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用。心肌細胞中的TGF-β1通過結(jié)合并激活Ⅱ型TGF-β受體,導致Smad2/Smad3復合物磷酸化并與細胞質(zhì)中的Smad4結(jié)合形成三聚體轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi),Smad2/3復合物進入細胞核,激活α-SMA和膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄,進一步促進心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞分化,引起MF〔22,23〕;而Smad7是TGF-β1/Smads信號通路的負調(diào)節(jié)因子,可抑制Smad2、Smad3的磷酸化,從而抑制MF〔24〕。本研究結(jié)果顯示,TGF-β1可激活Smad2和Smad3,降低Smad7的表達,上調(diào)Collagen I和Collagen Ⅲ,加重高血壓大鼠MF程度;而在TGF-β1干預的基礎(chǔ)上,上調(diào)miR-145,可明顯抑制TGF-β1/Smad2/3的激活,上調(diào)Smad7的表達,進而減輕高血壓大鼠MF;并且在miR-145 mimic干預的基礎(chǔ)上,上調(diào)TGF-β1的表達,可顯著逆轉(zhuǎn)miR-145過表達對TGF-β1/Smad通路和高血壓大鼠MF的抑制作用,提示miR-145的過表達可能通過抑制TGF-β1/Smad通路的激活對高血壓大鼠發(fā)揮抗MF作用。