李江寧 楊昕 唐波

(長沙市第三醫(yī)院,湖南 長沙 410015)

大腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病率可居世界第三,而直腸癌是其一個分支,早期通常都可治愈,但多數(shù)患者就診時都已到中晚期,導致預后并不理想,嚴重威脅患者生命安全〔1〕。因此,探尋一種新型、有效的治療靶點,對直腸癌早診斷、早治療具有積極意義〔2〕。但傳統(tǒng)的手術及放化療治療弊端明顯,所以直腸癌的治療都是醫(yī)學領域困擾的臨床難題〔3〕。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟的復雜過程,但大量研究表明,新生血管的生成在其中發(fā)揮著不可或缺的作用,其可為腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移提供必需的營養(yǎng)〔4〕。微血管密度(MVD)是反映新生血管生成的核心指標,研究發(fā)現(xiàn),其可直接反映腫瘤局部生成血管能力及血供;而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是促血管新生的重要因子,在癌癥血管新生中發(fā)揮著重要作用,故以此為靶點進而抗腫瘤血管生成是目前臨床治療癌癥的主要方向之一〔5〕。中醫(yī)在治療直腸癌方面具有廣闊的前景〔6〕。荔枝核總黃酮(TFL)是我國傳統(tǒng)中藥荔枝核的主要藥用成分,具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用,對結(jié)腸癌、肝癌、肺癌均有一定抑制作用。研究表明,TFL在前列腺癌中可發(fā)揮顯著療效,可有效抑制細胞增殖并促進細胞凋亡〔7〕。目前TFL對直腸癌作用機制尚不明確,本文探討TFL對直腸癌裸鼠瘤體體積、微血管密度及VEGF表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 動物材料：本實驗選取廣州弗爾博生物科技有限公司提供的24只SPF級SD雄性裸鼠〔合格證書為：SCXK(粵)2019-0003〕,平均體質(zhì)量18～20 g,單籠喂養(yǎng),模仿12 h晝夜交替,常溫下進行無菌自由進食、飲水2 w,按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗。

1.2儀器與試劑 直腸癌細胞(CM0764,上海淳麥生物科技有限公司);莪術醇(SND-1456,滁州仕諾達生物科技有限公司);TFL(ZC16081016,南京草本源生物科技有限公司);光學顯微鏡(E100,上海睿通生物科技有限公司);蘇木素、伊紅染液(C1411、C1422,北京普利萊基因技術有限公司);SP試劑盒(IC-SP-b,上海鈺博生物科技有限公司);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(IH-0892R,上海雅吉生物科技有限公司);牛血清白蛋白(BSA,YT0230-2,北京伊塔生物科技有限公司);RIPA裂解液、全蛋白抽提試劑盒(C1053、P1250,北京普利萊基因技術有限公司);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(RTD6116,上海高創(chuàng)化學科技有限公司);電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(KFS099-LUR,北京百奧萊博科技有限公司);CD34抗體(061A151.01,北京匯智和源生物技術有限公司);VEGF抗體(FNab09933,武漢菲恩生物科技有限公司);檸檬酸鹽緩沖液(0.01M,pH6.0,ZKP0789,深圳子科生物科技有限公司);GAPDH抗體(KL-KT-005616,上海柯雷生物科技有限公司)。

1.3分組與模型制備 選取24只SPF級SD裸鼠,隨機分為正常(A)組、模型(B)組、莪術醇(C)組、TFL(D)組,每組6只。B、C、D組第1天腹腔注射偶氮甲烷(10 mg/k),2.5%葡聚糖硫酸鈉連續(xù)飲水1 w,間隔給予蒸餾水2 w,重復二磺叔丁基氮(DSS)/蒸餾水飲水2個循環(huán),每天觀察腫瘤生長情況,當出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)時,則視為建模成功,A組不建立該模型,同期灌胃同體積生理鹽水。建模成功后,C組灌胃80 mg/kg莪術醇,D組灌胃200 mg/kg荔枝核總黃酮,兩組均1次/d,持續(xù)3 w,A、B組同期灌胃同體積生理鹽水。

1.4血流動力學監(jiān)測 建模成功后對各組在裸鼠左側(cè)股動脈連續(xù)監(jiān)測平均動脈壓(MAP)、心率(HR),給藥21 d后,對各組監(jiān)測其MAP和HR。

1.5標本采集 各組裸鼠在實驗結(jié)束后腹腔注射400 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死,取直腸組織及腫瘤瘤塊,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后直腸組織放入冰箱中密封保存以備后續(xù)實驗,各組裸鼠瘤體清洗去除周圍多余組織后,最長徑及最短橫涇進行測量,按照體積=(長徑×短徑2)/2的公式計算瘤體體積。

1.6裸鼠直腸組織病理檢測 取各組直腸組織,常規(guī)石蠟包埋、切片后脫蠟復水,蘇木素-伊紅(HE)染色后,脫水、透明、中性樹膠封片后,光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.7裸鼠MVD檢測 采用免疫組化法對直腸組織中MVD特異性標志物CD34進行檢測,按照SP試劑盒進行實驗。取各組直腸組織進行組織切片后,用二甲苯進行脫蠟20 min,進行2次,再用乙醇進行梯度浸泡,沖凈并擦干,用過氧化氫溫室孵育10 min,PBS沖洗3次后用檸檬酸鹽緩沖液進行微波熱修復,在37 ℃,2%BSA條件下封閉30 min,按說明書用封閉液稀釋一抗(1∶100),加入稀釋的CD34一抗,4 ℃冰箱過夜后洗膜;加入稀釋的生物素標記的二抗(1∶100),37 ℃水浴30 min;洗膜后,加入稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素的三抗(1∶100)37 ℃水浴30 min,用DAB進行顯色,PBS洗滌3次后用蘇木素復染,中性樹膠封片后,光學顯微鏡觀察,MVD用5個400倍隨機視野下的血管數(shù)的平均值表示。

1.8裸鼠VEGF蛋白表達檢測 Western印跡法檢測裸鼠直腸組織VEGF蛋白表達。取各組直腸組織,RIPA裂解液裂解10 min,離心20 min,取上清液,二喹啉甲酸(BCA)法測定后電泳,電泳后轉(zhuǎn)膜1.5 h,封閉2 h,加入稀釋的VEGF一抗(1∶1 000),4 ℃搖床孵育過夜后洗膜;加入稀釋二抗(1∶5 000),37 ℃輕搖孵育 2 h,洗膜后,用ECL熒光試劑盒測定結(jié)果,計算與GAPDH比值求得其蛋白的相對表達含量。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS23.0進行單因素方差分析或重復測量方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組血流動力學監(jiān)測 各組治療前后MAP、HR變化均無明顯差異(P>0.05);各組MAP、HR也無明顯差異(P>0.05),見表1。

表1 各組MAP、HR比較

2.2各組裸鼠瘤體體積 與B組〔(4.91±0.23)cm3〕比較,C、D組裸鼠瘤體體積〔(2.01±0.35)、(0.95±0.22)cm3〕均明顯縮小(F=563.300,P<0.001),且D組比C組縮小顯著(P<0.05),見圖1。

2.3各組HE染色 A組直腸組織結(jié)構完整,腺腔內(nèi)含豐富的杯狀細胞且排列規(guī)則,B組直腸結(jié)構遭到明顯破壞,黏膜肌薄而不完整,杯狀細胞急劇減少且有大量癌細胞浸潤,核仁明顯,排列紊亂,與B組比較,C、D兩組病理結(jié)構明顯改善,且D組比C組改善明顯,見圖2。

圖2 各組裸鼠直腸組織結(jié)構(HE染色,×400)

2.4各組裸鼠直腸組織MVD及VEGF蛋白表達 與A組比較,B組直腸組織中MVD及VEGF蛋白表達顯著升高(P<0.05);與B組比較,C、D兩組直腸組織中MVD及VEGF蛋白表達顯著降低,且D組比C組變化顯著(P<0.05),見圖3、表2、圖4。

圖3 各組裸鼠直腸組織中MVD(DAB,×400)

圖4 各組裸鼠直腸組織中VEGF蛋白表達

表2 各組裸鼠直腸組織MVD及VEGF蛋白表達比較

3 討 論

直腸癌在我國已躍居常見惡性腫瘤前五位,因此探尋一種有效的治療手段就顯得尤為重要〔8,9〕。荔枝核作為傳統(tǒng)中藥,國內(nèi)外專家對其進行了深入研究,且已在抗腫瘤方面取得了較大進展〔10,11〕。

本研究發(fā)現(xiàn),TFL對血流動力學無顯著影響,但其對直腸癌具有顯著療效,可使裸鼠瘤體體積明顯縮小。莪術醇是從我國傳統(tǒng)中藥莪術中提取的單體成分,又名姜黃醇,其在抗炎、抗氧化、抗菌、抑制血管生成等方面發(fā)揮著重要作用;而TFL屬于黃酮類化合物,是中藥荔枝核的提取物,其主要作用為抗氧化,但其也具有抗癌、抗病毒等作用,同時有研究表明,其對細胞凋亡也有雙向調(diào)節(jié)作用〔12〕。而直腸癌是我國患病率、死亡率最高的疾病之一,每年的增長速度大約為世界平均水平的2倍〔13〕。對于直腸癌大鼠,TFL可能是通過調(diào)控細胞凋亡相關蛋白通路及自噬相關蛋白通絡,來促進細胞凋亡與自噬,從而抑制氧自由基的產(chǎn)生,減少 DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化等,進而達到抵御化學致癌物、機體慢性炎癥等致癌因素,阻礙腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、惡化等階段的目的,最終預防并遏制腫瘤繼續(xù)形成。盧青等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),TFL對結(jié)腸癌具有很好療效,可顯著抑制結(jié)腸癌HT29細胞系增殖,降低NF-κB及白細胞介素等炎性因子的表達,這與本文結(jié)果類似。

本研究表明,TFL可有效改善MVD。MVD 是評估腫瘤組織血管形成狀態(tài)的重要指標,多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者的預后都與MVD密切相關〔15〕。研究表明,直腸癌的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成密切相關,因此,如何抑制腫瘤新生血管生成已經(jīng)成為目前臨床治療直腸癌的重要研究方向之一。腫瘤新生血管主要是通過腫瘤細胞誘導的微血管生長及腫瘤血液循環(huán)的建立而生成,其在腫瘤微環(huán)境中具有重要地位,是腫瘤增殖生長、侵襲轉(zhuǎn)移的必需條件〔16〕。TFL可能是通過抑制血管內(nèi)皮細胞有絲分裂,來抑制內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、出芽并降低血管通透性,從而破壞腫瘤血液循環(huán)的建立,最終到達抑制新生血管生成、降低MVD表達的目的。唐廣義等〔17〕研究發(fā)現(xiàn),對于大腸癌裸鼠,益氣健脾抗癌法可顯著降低裸鼠MVD表達,并促進大腸癌細胞凋亡,說明其可有效控制大腸癌血管形成,這與本文結(jié)果類似。

本研究發(fā)現(xiàn),TFL可顯著抑制新生血管生成。VEGF是新生血管生成的最重要促進因子,其主要由于腫瘤代謝微環(huán)境改變所導致的促血管生成因子和血管生成抑制因子失衡,而過表達于腫瘤細胞,進而啟動腫瘤血管生成〔18〕。近年來,腫瘤新生血管生成越來越受到廣大醫(yī)學專家及學者的關注,有研究表明,腫瘤如果要進一步增長,其必學建立自己的血供,因此新生血管生成必不可少〔19〕。TFL可能是通過抑制血管“小窗”的形成,抑制間質(zhì)膠原蛋白酶、基質(zhì)降解蛋白酶等蛋白酶的表達,抑制一系列信號通路的激活,從而抑制血管基底膜的降解及細胞外基質(zhì)的降解,降低微小血管的通透性,最終達到抑制血管生成,切斷腫瘤供血、供氧,抑制腫瘤形成的目的。李奕璇〔20〕研究發(fā)現(xiàn),白花丹醌可顯著降低結(jié)腸癌中MVD、VEGF、VEGFR2的表達水平,說明白花丹醌是通過調(diào)控VEGF/VEGFR2信號通路來抑制結(jié)腸癌血管生成,這與本文結(jié)果類似。綜上,TFL對直腸癌具有顯著療效,其可顯著降低直腸癌裸鼠瘤體體積,改善MVD,降低VEGF表達。