俞文豪 康小紅

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤放射治療一病區(qū),河南 衛(wèi)輝 453100)

肺癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第二位,同時(shí)肺癌死亡率居惡性腫瘤的首位〔1〕。大多數(shù)肺癌患者早期沒有明顯癥狀,出現(xiàn)癥狀就診時(shí)多數(shù)已屬于晚期。手術(shù)、放化療、靶向治療和免疫治療等治療方法雖然可以改善病情,但患者總體預(yù)后仍較差〔2〕。因此,進(jìn)一步研究肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找潛在的預(yù)測標(biāo)志物和靶點(diǎn)具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用〔3〕。LINC01410是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,研究表明,其高表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如LINC01410參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移〔4〕;LINC01410促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖、侵襲和放療抵抗〔5〕;此外,LINC01410介導(dǎo)胃癌細(xì)胞的血管生成和轉(zhuǎn)移〔6〕。然而,LINC01410在肺癌發(fā)生發(fā)展中的潛在機(jī)制尚不清楚。本文擬研究LINC01410對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖、侵襲與遷移的影響,并探討其可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人肺正常上皮細(xì)胞株BEAS-2B購于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心。人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9、A549、H1975、HCC827均購于北京中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。0.25%胰蛋白酶、杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和青鏈霉素雙抗均購自美國HyClone公司。胎牛血清(FBS)購自美國Clark公司。慢病毒載體(LV-NC、LV-LINC01410)購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。Trizol試劑購自日本Takara公司。逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購于近岸蛋白科技有限公司。基質(zhì)膠及Transwell小室均購于美國Corning公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購于自索萊寶公司。白細(xì)胞介素(IL)-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自達(dá)科為生物科技有限公司。Western印跡檢測所需一抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)3和p-STAT3 均購自美國CST公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于索萊寶公司;電化學(xué)發(fā)光液購于武漢博士德工程有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱,人肺癌細(xì)胞A549、H1975、HCC827、PC-9及人肺正常上皮細(xì)胞BEAS-2B,用含10% FBS和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)。應(yīng)用0.25%胰蛋白酶消化傳代,選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞消化后,按照5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%時(shí),加入LV-NC、LV-LINC01410慢病毒載體(帶有綠色熒光蛋白)感染細(xì)胞。培養(yǎng)48 h,應(yīng)用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR檢測 LINC01410的表達(dá)水平。通過嘌呤霉素篩選,建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株A549-NC、A549-LINC01410。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 采用Trizo試劑抽提細(xì)胞的總RNA,然后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行PCR,具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。IL-6引物序列：正向引物5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′,反向5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′;LINC01410引物序列：正向引物5′-ACAGCCCTGAGTGAA-AAGTCC-3′,反向5′-ACAAGATGCCTTGGAGTGTCA-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物序列：正向引物5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′,反向5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。應(yīng)用2-ΔΔCt計(jì)算LINC01410和IL-6相對(duì)表達(dá)水平。

1.5MTT比色法檢測細(xì)胞活力 MTT將A549-NC、A549-LINC01410細(xì)胞常規(guī)消化后以3 000 個(gè)/孔鋪于96 孔板中,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),分為4組：24、48、72及96 h組(72 h及96 h組在48 h常規(guī)換液),每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔,每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml),繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去上清液,每孔加入150 μl DMSO,于490 nm 處用酶標(biāo)測定吸光度(OD)值。

1.6Transwell侵襲試驗(yàn) 將基質(zhì)膠按1∶6的比例稀釋,取稀釋后的基質(zhì)膠100 μl,均勻鋪在Transwell小室的底部。用0.25% 胰酶將A549-NC、A549-LINC01410細(xì)胞常規(guī)消化,應(yīng)用無血清DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105個(gè)/ml。200 μl細(xì)胞懸液加入上室,600 μl含10% FBS DMEM培養(yǎng)基加入下室,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h,取出小室。4%多聚甲醛溶液固定5 min,結(jié)晶紫染色15 min。 自然干燥后,用倒置顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照,應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室不需鋪基質(zhì)膠,余步驟同上。

1.7ELISA 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h后,收集A549-NC、A549-LINC01410細(xì)胞培養(yǎng)上清,1 200 r/min離心20 min,應(yīng)用人IL-6預(yù)制ELISA試劑盒檢測IL-6表達(dá)水平,詳細(xì)步驟參照說明書。

1.8Western印跡實(shí)驗(yàn) 將A549-NC、A549-LINC01410細(xì)胞接種于6孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h,棄上清,用預(yù)冷的PBS洗3次。每孔加入100 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)和磷酸酶抑制劑的裂解液,置于冰上,搖動(dòng)細(xì)胞板使細(xì)胞充分裂解30 min,4 ℃,12 000 r/min 離心15 min,取上清。BCA試劑盒定量、煮沸10 min變性,取30 μg蛋白上樣。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,用5%牛血清白蛋白V(BSA稀釋)的一抗4 ℃搖床過夜,二抗室溫孵育45 min,電化學(xué)發(fā)光液顯影,以GAPDH 為內(nèi)參,應(yīng)用Image J軟件分析目標(biāo)條帶灰度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS30.0軟件進(jìn)行獨(dú)立t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1人肺癌細(xì)胞株和人肺正常上皮細(xì)胞LINC01410表達(dá)量 與人肺正常上皮細(xì)胞BEAS-2B(1.00±0.08)相比,4種人肺癌細(xì)胞株(A549、PC-9、H1975、HCC827)中LINC01410 表達(dá)(分別為1.29±0.07、1.78±0.21、3.36±0.20、6.75±1.03)顯著上調(diào)(均P<0.05)。其中肺癌A549細(xì)胞中LINC01410表達(dá)水平明顯低于其他肺癌細(xì)胞株(均P<0.05)。本研究選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒后LINC01410的表達(dá) 倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果見圖1。qRT-PCR結(jié)果顯示,A549-LINC01410細(xì)胞中LINC01410 mRNA表達(dá)水平(96.44±10.76)明顯高于A549-NC細(xì)胞(1.01±0.19;t=15.36,P<0.05),提示轉(zhuǎn)染成功。

圖1 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒(×40)

2.3過表達(dá)LINC01410對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響 與A549-NC組相比,A549-LINC01410組在24、48、72和96 h的OD值明顯升高(均P<0.05),見表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖能力、p-STAT3蛋白、IL-6 mRNA及蛋白表達(dá)比較

2.4過表達(dá)LINC01410對(duì)A549細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A549-LINC01410組IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯高于A549-NC組(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示,與A549-NC組相比,A549-LINC01410組IL-6表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),見表1。

2.5過表達(dá)LINC01410對(duì)A549細(xì)胞p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 與A549-NC組相比,A549-LINC01410組p-STAT3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測兩組p-STAT3蛋白表達(dá)

2.6過表達(dá)LINC01410對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與A549-NC組〔(198.33±17.16)個(gè)〕相比,A549-LINC01410組遷移細(xì)胞數(shù)〔(303.67±15.31)個(gè)〕明顯增加(t=7.935,P=0.001)。與A549-NC組〔(61.67±5.03)個(gè)〕相比,A549-LINC01410組侵襲細(xì)胞數(shù)〔(110.00±15.72)個(gè)〕明顯增加(t=5.073,P=0.007),見圖3。

圖3 兩組細(xì)胞遷移及侵襲能力(結(jié)晶紫染色,×100)

3 討 論

肺癌是中國及世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。國家癌癥中心統(tǒng)計(jì)顯示,2015年中國肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位,其中新發(fā)病例約為 78.7 萬例,死亡病例約為63.1萬例〔7〕。近年來,隨著手術(shù)、放化療、靶向治療和免疫治療的開展,肺癌患者生存率有了明顯改善,但效果并不理想〔8〕,中國肺癌患者5年生存率僅為16.1%〔9〕。無限增殖、侵襲和局部遷移能力是惡性腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵性特征。相關(guān)研究〔10〕顯示,局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是晚期肺癌患者最主要的致死原因。因此,深入探究參與肺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)。

lncRNA 是一類長度>200核苷酸、不具備蛋白編碼潛能的RNA〔11〕。證據(jù)表明,lncRNAs參與細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等多種生物學(xué)過程〔12〕,其異常表達(dá)和突變與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及腫瘤分期密切相關(guān),例如,lncRNA雙同源盒A假基因(DUXAP)8促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移〔13〕;lncRNA尿路上皮癌相關(guān)基因(UCA)1可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移〔14〕;此外,lncRNA小核仁RNA宿主基因(SNHG)3促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移〔15〕。lncRNAs是一類新型的潛在生物標(biāo)志物和治療腫瘤的靶點(diǎn)。目前l(fā)ncRNA在肺癌中被廣泛研究,例如：lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1促進(jìn)肺癌腦轉(zhuǎn)移〔16〕;有證據(jù)表明,lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義基因RNA(HOTAIR)可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔17〕;此外,lncRNA細(xì)胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA(ANRIL)促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖,抑制凋亡〔18〕。總之,lncRNA的出現(xiàn)為肺癌早期診斷和靶向治療提供了新的模式。LINC01410作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,位于9號(hào)染色體的 62801465～62814286,全長 12 021 bp〔6〕。目前LINC01410在腫瘤中作用的報(bào)道僅限于骨肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等,例如：LINC01410參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,并且LINC01410與子宮內(nèi)膜癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)〔19〕;LINC01410促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲〔20〕,同時(shí)LINC01410的高表達(dá)可作為大腸癌診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)記物〔21〕;此外,LINC01410介導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔22〕。這些發(fā)現(xiàn)提示LINC01410可能在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移中起著重要作用,并且與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。

本研究結(jié)果提示,LINC01410過表達(dá)促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。研究表明,IL-6/STAT3信號(hào)通路在肺癌中具有重要的促進(jìn)作用,例如,間充質(zhì)干細(xì)胞通過激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)通路可以促進(jìn)肺癌的發(fā)生〔23〕;IL-6能通過誘導(dǎo)STAT3的活化促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展,阻斷IL-6能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖〔24〕;此外,IL-6/STAT3信號(hào)通路可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力〔25〕。本研究結(jié)果表明,肺癌A549細(xì)胞過表達(dá)LINC01410使 IL-6表達(dá)上調(diào)、STAT3活化。本研究推測LINC01410可能通過影響上調(diào)IL-6、激活STAT3表達(dá)來影響A549細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移,其具體機(jī)制有待分析。