呂佳 冀杰 邱波

(廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院眼科,廣東 廣州 510000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變屬糖尿病并發(fā)癥之一,視網(wǎng)膜病變嚴重影響患者視功能,是目前致盲率較高的疾病之一〔1〕。糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生后不僅僅表現(xiàn)為視網(wǎng)膜微血管病變,還表現(xiàn)為Müller細胞結(jié)構(gòu)、功能改變〔2〕。既往研究發(fā)現(xiàn),微小RNA(miR)家族參與糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生過程,miR-132屬于miR家族成員之一,研究認為其與糖尿病血管新生密切相關(guān),可能為誘發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變的因素〔3〕。本文探討過表達miR-132對糖尿病視網(wǎng)膜病變Müller細胞的保護作用及相關(guān)機制。

1 資料與方法

1.1研究動物 選取10只SPF級大鼠,8～10周齡,平均體質(zhì)量(215.35±20.26)g,由冠科生物技術(shù)(中山)有限公司提供,動物許可證號：SYXK(粵)2020-0240,在22～28 ℃、相對濕度為50%～60%的清潔環(huán)境下飼養(yǎng)7 d,明暗周期為12 h。本研究操作均嚴格參照實驗動物管理條例相關(guān)規(guī)定進行。

1.2糖尿病視網(wǎng)膜病變Müller細胞分離培養(yǎng) 參照文獻〔4〕構(gòu)建糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型,10只大鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)14 d,尾部靜脈注射50 mg/kg鏈脲佐菌素(美國Sigma公司),注射72 h后測定空腹血糖,當空腹血糖≥16.7 mmol/L時表明糖尿病建立成功。繼續(xù)飼養(yǎng)1 w后,對大鼠麻醉處理,頸部脫臼法處死,摘取眼球,在顯微鏡下剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜,均勻分為2等份,其中1等份做組織切片,行蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察視網(wǎng)膜病理變化,若視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞排列較為紊亂,神經(jīng)纖維層腫脹,毛細血管擴張淤血,則說明糖尿病視網(wǎng)膜病變模型建立成功(圖1)。建模成功后取建模成功的另外1等份視網(wǎng)膜,使用0.25%胰酶消化,消化10 min后使用400目篩網(wǎng)過濾、離心(1 000 r/min,離心5.5 min),棄除上清液后使用含10%胎牛血清的低糖DMEM對細胞密度進行調(diào)整,調(diào)整為3×106/L,接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中,當細胞密度為90%時做傳代培養(yǎng)(圖2),細胞貼壁生長,待細胞生長至第三代時,進行后續(xù)實驗。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜病變(HE染色,×200)

圖2 Müller細胞生長情況(×200)

1.3分組及轉(zhuǎn)染 查找miR-132序列,由上海市吉凱生物科技有限公司設(shè)計miR-132抑制物(miR-132 inhibitor,沉默)、miR-132模擬物(miR-132 mimic,過表達)。將所培養(yǎng)的第三代Müller細胞分為對照組、沉默組、過表達組,其中對照組不做任何處理,沉默組使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒做miR-132沉默(miR-132 inhibitor)轉(zhuǎn)染,過表達組做脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒miR-132過表達(miR-132 mimic)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后觀察各組細胞變化。

1.4miR-132轉(zhuǎn)染效率鑒定 取細胞,采用Trizol試劑提取細胞總RNA,測定RNA濃度,進行RNA反轉(zhuǎn)錄,之后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定miR-132轉(zhuǎn)染效率。采用Veriti7500 RT-PCR儀行PCR,反應(yīng)體系：0.5 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,2.5 μl 10×緩沖液,加蒸餾水至20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預變性10 min、95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 min,共進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算出需要檢測的miR-132表達量,每組數(shù)據(jù)各測3次,取平均值。miR-132上游引物：5′-TAACAGTCTACAGCCATGG-TCG-3′,下游：5′-CTTCTTGCGGTCTTGCCATTCC-3′;內(nèi)參β-Actin上游引物：5′-GCGAGAAGATGACCCACCACC-3′,下游：5′-ATGTCACGCACGATTTCCTATTA-3′。

1.5細胞存活情況評價 采用CCK-8法測定各組細胞存活率,取對數(shù)生長期細胞,將其接種于96孔板內(nèi),細胞濃度為2×107/L,37 ℃培養(yǎng),2 h后使用酶標儀記錄450 nm波長處的吸光值,取其中4孔光密度(OD)均值,計算各組細胞24、48、72 h存活率,細胞存活率(%)=(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD處理組)×100。

1.6細胞凋亡情況評價 采用TUNEL法檢測細胞凋亡率,在熒光顯微鏡下對細胞凋亡數(shù)進行觀察計數(shù),經(jīng)洗滌、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色封片后的細胞核分別呈現(xiàn)為陽性(綠色熒光)和陰性(藍色熒光),之后計算細胞凋亡率,細胞凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%,重復進行3次,取平均值。

1.7細胞腫瘤抑制因子(PTEN)/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路蛋白檢測 采用Western印跡檢測各組細胞中PTEN/PI3K/AKT通路蛋白p-PTEN、p-PI3K、p-AKT、p-促凋亡蛋白(Bad)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2表達量,將細胞做10 000 r/min離心10 min,提取上清液,做二喹啉甲酸(BCA)蛋白定性檢測,取50 μg蛋白,加入值2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中,100 ℃下加熱5 min促使蛋白變性。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、取膜,4 ℃在5%脫脂牛奶中固定、封閉1 h,以1∶1 000比例使用0.05%～0.10% TBST稀釋一抗,加入一抗后4 ℃孵育過夜,0.05%～0.10% TBST洗膜3次,加入1∶10 000的稀釋二抗,搖動孵育1 h,做0.05%～0.10% TBST洗膜,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,以GAPDH為內(nèi)參照,定量分析蛋白表達情況。一抗由武漢菲恩生物科技有限公司提供。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行方差齊性檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-132轉(zhuǎn)染效率鑒定 如表1所示,與對照組相比,沉默組miR-132表達顯著降低,過表達組miR-132表達顯著升高(P<0.05);與沉默組相比,過表達組miR-132表達顯著升高(P<0.05)。說明miR-132轉(zhuǎn)染成功。

表1 各組miR-132轉(zhuǎn)染效率鑒定、細胞存活及凋亡情況比較

2.2各組細胞存活情況對比 如表1所示,與對照組相比,沉默組各時間點細胞存活率明顯降低,過表達組各時間點細胞存活率明顯升高(P<0.05);與沉默組相比,過表達組各時間點細胞存活率明顯升高(P<0.05)。

2.3各組細胞凋亡情況對比 如表1、圖3所示,與對照組相比,沉默組細胞凋亡率明顯升高,過表達組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05);與沉默組相比,過表達組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

2.4各組細胞PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表達對比 如表2、圖4所示,與對照組相比,沉默組p-PTEN表達量升高,p-PI3K、p-AKT、p-Bad、Bcl-2表達量降低,過表達組p-PTEN表達量降低,p-PI3K、p-AKT、p-Bad、Bcl-2表達量升高,均有統(tǒng)計學差異(均P<0.05);與沉默組相比,過表達組p-PTEN表達量降低,p-PI3K、p-AKT、p-Bad、Bcl-2表達量升高,均有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。

表2 各組細胞PTEN/PI3K/AKT通路蛋白表達對比

3 討 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展過程中,糖尿病視網(wǎng)膜中的Müller細胞既存在增殖又存在凋亡表現(xiàn),在疾病發(fā)生早期,Müller細胞核結(jié)構(gòu)改變,并未有明顯的視網(wǎng)膜周細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞病理改變現(xiàn)象,但隨著疾病的進展,機體處于長期的高糖狀態(tài),此時Müller細胞表現(xiàn)為超微結(jié)構(gòu)改變和細胞器損傷〔5,6〕。研究發(fā)現(xiàn)〔7,8〕,在持續(xù)高糖環(huán)境下,視網(wǎng)膜Müller細胞明顯受到損傷,分析其原因可能與在機體長期處于高糖狀態(tài)下時有害物沉積至細胞中,進一步損傷細胞,最終降低Müller細胞存活率,促進其凋亡。

臨床研究發(fā)現(xiàn)〔9,10〕,miR參與機體多種病理生理過程,包括腫瘤形成、細胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)及心血管疾病、糖尿病等。臨床研究認為,多種miR參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)〔11〕,miR-12與葡萄糖代謝有關(guān)。研究顯示〔12〕,miR-132具有多重作用,miR-132介導了視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞對部分基因的調(diào)節(jié)。另外最近一項研究顯示〔13〕,miR-132在糖尿病視網(wǎng)膜病變中表達明顯降低,認為miR-132可能經(jīng)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1/3信號通路參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生,且MAPK1/3信號通路可能為保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞相關(guān)機制。上述研究均提示miR-132可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展過程。本文結(jié)果提示,過表達miR-132可能經(jīng)過抑制Müller細胞凋亡,促進存活而發(fā)揮保護作用。

PTEN/PI3K/AKT通路廣泛存在于各細胞中,其主要調(diào)控細胞增殖、凋亡等發(fā)揮其作用,研究顯示,當PTEN/PI3K/AKT通路激活后可促進細胞增殖,抑制凋亡,AKT可經(jīng)調(diào)節(jié)細胞周期,發(fā)揮促進細胞增殖的作用〔14,15〕。而PI3K在被激活后可產(chǎn)生較多的下游信號分子,促進信號傳導,而進一步增強其作用〔16～18〕。在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生過程中上述信號通路失活,當經(jīng)外界手段干預后,可激活此信號通路,而下游相關(guān)靶點因子表達被改變,最終改變視網(wǎng)膜病變,保護視網(wǎng)膜組織,可作為糖尿病視網(wǎng)膜病變治療靶點〔19〕。PTEN屬于PI3K/AKT通路中的負調(diào)節(jié)因子,其可促使PIP3磷酸化使其低表達,而抑制此信號通路活化,參與細胞凋亡過程〔20,21〕。研究顯示〔22〕,PTEN/PI3K/AKT通路中的PTEN參與糖尿病視網(wǎng)膜病變后感光器細胞凋亡,當其被抑制后可直接激活PI3K/AKT而抑制線粒體活化,最終發(fā)揮其抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡,阻礙疾病進展。鑒于上述背景,推測PTEN/PI3K/AKT通路與過表達miR-132抑制Müller細胞凋亡、促進存活相關(guān),分析細胞中各信號通路蛋白表達情況。本研究結(jié)果提示,過表達miR-132可能經(jīng)調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路,抑制PTEN表達,促進PI3K、AKT、Bad、Bcl-2表達而發(fā)揮保護Müller細胞的作用,表現(xiàn)為細胞存活率升高、凋亡率降低。

綜上,過表達miR-132具有保護糖尿病視網(wǎng)膜病變Müller細胞的作用,其作用機制可能與調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路、抑制細胞凋亡、增加存活率相關(guān)。