張一銘 王國華 孫一峰

(紹興市人民醫(yī)院血管疝外科,浙江 紹興 312000)

膿毒癥是一種高發(fā)病率,高病死率的疾病,其多累及血管內(nèi)皮,血管內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管功能,生理和病理生理過程中起著至關(guān)重要的作用,其內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙或損傷是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié),膿毒癥發(fā)生時(shí),相關(guān)毒素可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生損傷,最終導(dǎo)致膿毒癥患者各器官發(fā)生障礙〔1～3〕。內(nèi)毒素(LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分,可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞〔4〕。研究表明,長鏈非編碼RNA(LncRNA)參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的損傷過程〔5〕。心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MIAT)是一種與心血管疾病相關(guān)的LncRNA,研究報(bào)道急性冠脈綜合征患者外周血清中LncRNA MIAT表達(dá)水平顯著增高,是急性冠脈綜合征相關(guān)危險(xiǎn)因素,其可能參與血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)〔6〕。敲低LncRNA MIAT通過在動(dòng)脈粥樣硬化過程中調(diào)節(jié)miR-214-3p/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1信號傳導(dǎo)來減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔7〕。敲低LncRNA MIAT通過調(diào)控miR-330-5p/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)6/核因子(NF)-κB 軸抑制LPS誘導(dǎo)的敗血性心肌病炎癥和氧化應(yīng)激〔8〕。研究報(bào)道,敲低肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1通過調(diào)節(jié)miR-361-3p/SOCS3軸抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和凋亡〔9〕。說明LncRNA MIAT和miR-361-3p均參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和嚴(yán)重炎癥損傷,但其對氧化應(yīng)激損傷的影響尚未可知。本實(shí)驗(yàn)旨在研究LncRNA MIAT通過調(diào)控miR-361-3p對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs,上海冠導(dǎo)生物工程有限公司);DMEM培養(yǎng)基、LPS(美國Sigma公司);Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(大連寶生物);蛋白提取試劑盒、凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物);丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒(南京建成生物);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物)。

1.2細(xì)胞處理與分組 HUVECs常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中,用0.1 μg/ml的LPS處理細(xì)胞,記為LPS組,正常培養(yǎng)細(xì)胞作為對照(control)組;將LncRNA MIAT干擾表達(dá)載體及陰性對照、miR-361-3p模擬物及陰性對照轉(zhuǎn)染至HUVECs后用0.1 μg/ml的LPS處理,記為si-LncRNA MIAT+LPS組、si-NC+LPS組、miR-361-3p+LPS組、miR-NC+LPS組;將miR-361-3p抑制劑及陰性對照分別與LncRNA MIAT干擾表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HUVECs后用0.1 μg/ml的LPS處理,記為anti-miR-361-3p+si-LncRNA MIAT+LPS組、anti-miR-NC+si-LncRNA MIAT+LPS組。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測LncRNA MIAT和miR-361-3p的表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總RNA,并檢測RNA濃度,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用熒光定量試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH和U6為內(nèi)參,LncRNA MIAT和miR-361-3p表達(dá)水平用2-△△Ct法計(jì)算。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,用預(yù)冷PBS漂洗2次細(xì)胞,加500 μl的結(jié)合緩沖液后,先加10 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC),再加5 μl PI,避光孵育10 min;上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5Western印跡法檢測蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白,然后在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理蛋白樣品,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入Cleaved-caspase-3、β-actin抗體4 ℃孵育過夜,室溫加入二抗孵育2 h,顯影、定影。使用軟件并分析蛋白條帶灰度值。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測MDA含量和SOD、CAT活性 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞上清液,按試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測MDA含量、SOD活性、CAT活性。

1.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建含有miR-361-3p結(jié)合位點(diǎn)的 LncRNA MIAT野生型(WT)及突變型(MUT)報(bào)告基因載體,并分別與miR-361-3p或miR-NC共轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h后按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞后LncRNA MIAT和miR-361-3p的表達(dá)情況 與control組比較,LPS組血管內(nèi)皮細(xì)胞中LncRNA MIAT表達(dá)水平明顯升高,miR-361-3p表達(dá)水平明顯降低(P<0.001),見表1。

表1 LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中LncRNA MIAT和miR-361-3p的表達(dá)情況

2.2低表達(dá)LncRNA MIAT對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 與control組比較,LPS組LncRNA MIAT、Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA含量明顯升高,SOD和CAT活性明顯降低(P<0.05);與si-NC+LPS組比較,si-LncRNA MIAT+LPS組LncRNA MIAT、Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA含量明顯降低,SOD和CAT活性明顯升高(P<0.05),見圖1、圖2、表2。

1～4：control組,LPS組,si-NC+LPS組,si-LncRNA MIAT+LPS組圖1 低表達(dá)LncRNA MIAT對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 低表達(dá)LncRNA MIAT對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

表2 低表達(dá)LncRNA MIAT對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

2.3miR-361-3p高表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 與miR-NC+LPS組比較,miR-361-3p+LPS組Cleaved-caspase-3表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、MDA含量明顯降低,miR-361-3p表達(dá)、SOD活性和CAT活性明顯升高(均P<0.05),見表3、圖3。

1～4：miR-NC+LPS組,miR-361-3p+LPS組,anti-miR-NC+si-LncRNA MIAT+LPS組,anti-miR-361-3p+si-LncRNA MIAT+LPS組圖3 高表達(dá)miR-361-3p對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 高表達(dá)miR-361-3p對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.4LncRNA MIAT靶向調(diào)控miR-361-3p的表達(dá) Starbase預(yù)測顯示LncRNA MIAT和miR-361-3p有結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。miR-361-3p與LncRNA MIAT WT報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)(表4)。與si-NC組比較,si-LncRNA MIAT組LncRNA MIAT表達(dá)水平明顯降低,miR-361-3p表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與pcDNA-NC組比較,pcDNA-LncRNA MIAT組LncRNA MIAT表達(dá)水平明顯升高,miR-361-3p表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見表5。

圖4 starbase對LncRNA MIAT和miR-361-3p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 qRT-PCR檢測LncRNA MIAT和miR-361-3p的表達(dá)

2.5miR-361-3p低表達(dá)可以部分回復(fù)LncRNA MIAT低表達(dá)對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 與anti-miR-NC+si-LncRNA MIAT+LPS組比較,anti-miR-361-3p+si-LncRNA MIAT+LPS組miR-361-3p表達(dá)水平、SOD和CAT活性明顯降低,Cleaved-caspase-3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、MDA含量明顯升高(均P<0.05),見表6、圖5。

表6 低表達(dá)miR-361-3p可以逆轉(zhuǎn)LncRNA MIAT低表達(dá)對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

3 討 論

膿毒癥是指宿主對感染引起的危及生命的器官功能失調(diào),內(nèi)皮功能障礙對膿毒癥的發(fā)生發(fā)展起重要作用,而氧化應(yīng)激會(huì)改變多種內(nèi)皮細(xì)胞功能,與內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)的分子可以作為膿毒癥早期診斷和預(yù)后指標(biāo),為膿毒癥診斷治療提供新的思路〔10,11〕。研究報(bào)道LncRNA MIAT通過靶向miR-29a-5p促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激,從而加劇肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展〔12〕。含有l(wèi)ncRNA MIAT的血清細(xì)胞外囊泡可促進(jìn)誘導(dǎo)心房纖維化、炎癥和氧化應(yīng)激〔13〕。沉默LncRNA MIAT通過調(diào)節(jié)miR-147a/核因子-κB刺激活蛋白(NKAP)/NF-κB軸減輕了LPS誘導(dǎo)的肺上皮TC-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡〔14〕。抑制LncRNA MIAT可通過調(diào)節(jié)miR-204-5p/HMGB1軸減輕腦缺血后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔15〕。本研究結(jié)果表明,低表達(dá)LncRNA MIAT可抑制LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

研究報(bào)道,敲低lncRNA SNHG1通過通過海綿狀miR-361-3p調(diào)節(jié)ZNF217來減輕Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷〔16〕。本研究結(jié)果表明,過表達(dá)miR-361-3p可減輕LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了LncRNA MIAT靶向調(diào)控miR-361-3p;而低表達(dá)miR-361-3p可以逆轉(zhuǎn)LncRNA MIAT低表達(dá)對LPS處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響。