史勇 李成浩 張紅石

(1長春大學(xué)特殊教育學(xué)院,吉林 長春 130022;2長春中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院)

功能性便秘(FC)是指無代謝功能障礙、無結(jié)構(gòu)異常變化、無器質(zhì)性病因,出現(xiàn)的以排便次數(shù)減少、大便干結(jié)、排便無力為主要癥狀的臨床病癥〔1〕。屬于中醫(yī)學(xué)“便秘”“脾約”范疇,是社區(qū)生活中較為常見的功能性疾病〔2〕。流行病學(xué)顯示,我國成年人FC的發(fā)病率為4%～6%,年齡越大,發(fā)病率越高〔3〕。長期便秘會(huì)引起腹脹、食欲下降、口內(nèi)異味等癥狀,便秘產(chǎn)生的有害物質(zhì)亦會(huì)增加患者并發(fā)胃腸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)〔4〕。健脾五穴點(diǎn)按法治療老年FC,有著較好的臨床療效,但作用機(jī)制不明。因此,本研究主要是立足于對(duì)健脾五穴的實(shí)驗(yàn)機(jī)制研究,圍繞“腦-腸軸”調(diào)節(jié)FC的關(guān)鍵作用,探討健脾五穴點(diǎn)按法治療老年FC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí),Wistar大鼠40只,雌雄各半,9月齡,體質(zhì)量300～350 g,購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司〔許可證號(hào)碼：SCXK(吉)-2020-0002〕。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,雌雄分籠,每籠5只,攝食飲水不限,自然照明,保持環(huán)境溫度22～24 ℃,濕度55%～60%。

1.2藥品及試劑 莫沙必利片,5 mg/片,國藥準(zhǔn)字J20110022。復(fù)方地芬諾酯片(康普),2.5 mg/片,國藥準(zhǔn)字H32022716。大鼠5-羥色胺(HT)、人血管活性腸肽(VIP)酶聯(lián)免疫試劑盒(96T;組織勻漿;上海茁彩生物科技有限公司,ZC35959J,ZC37398)?？俁NA提取試劑(ml095476)、HG TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ml095527)、DNA Marker 2000(ml095609)、P物質(zhì)(SP)兔抗多克隆抗體(ml091754)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)兔抗單克隆抗體(ml091933)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;β-actin鼠抗單克隆抗體(北京安諾倫生物科技有限公司,YM3029);阿拉伯樹膠粉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);異氟烷(上海玉研科學(xué)儀器有限公司);98%氯苯丙氨酸(PCPA,上海麥克林生化科技股份有限公司)。

1.3儀器設(shè)備 氣麻儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司,MR7654);9 cm鍉針(宸之瑞辦公專營店);酶標(biāo)儀(BIOTEK,ELX-800);電泳儀(DYY-7C)、轉(zhuǎn)移槽(DYCZ-40D)、水平搖床(WD-9405B)均購自北京六一生物科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Applied Biosystems,ABI7500)、超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀,H-2050R);電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特;DH36001B);離心機(jī)(益世科生物科技有限公司,MCR-88-8)。

1.4動(dòng)物分組及造模 40只Wistar大鼠,喂養(yǎng)7 d后,分為雌雄兩籠,每籠20只,按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、穴位按壓組、陽性藥物組,每組10只,雌雄分籠各半?？瞻捉M給予2%蔗糖灌胃,其余各組采用復(fù)方地芬諾脂混懸液建立FC大鼠模型,將復(fù)方地芬諾酯片溶解稀釋后按大鼠10 mg/kg灌胃,每天1次,連續(xù)14 d,當(dāng)大鼠出現(xiàn)首粒黑便排出時(shí)間延長時(shí),為FC模型造模成功。

1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)及取材 空白組、模型組：每日正常飲食飲水,不做干預(yù)治療。穴位按壓組：采用9 cm鍉針進(jìn)行健脾五穴按壓治療,大鼠治療前采用氣麻儀固定在鼠板上,以鍉針垂直在大鼠神闕、中脘、章門(左右)、天樞(左右)和氣海進(jìn)行點(diǎn)按,力度以鍉針自身重力為最大值,每日1次,連續(xù)治療7 d。大鼠穴位定位參照文獻(xiàn)〔5〕。陽性藥物組：將莫沙必利溶解稀釋后按人鼠比例1∶30進(jìn)行等效劑量換算灌胃(每100 g大鼠給予25 mg藥物),每日1次,連續(xù)7 d。干預(yù)結(jié)束后,禁食24 h。麻醉成功后,經(jīng)腹主動(dòng)脈采血5 ml,從降結(jié)腸與乙狀結(jié)腸交界處向上取50 mm×3 mm×3 mm腸組織,分別存于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6首粒黑便時(shí)間及糞便含水率檢測(cè) 分別于造模14 d及治療7 d清晨給水30 min后,給予10 ml/kg的墨汁灌胃,記錄每只大鼠墨汁灌胃時(shí)間及各組大鼠的首粒黑便排出時(shí)間。糞便含水率(%)=(糞便濕重-糞便干重)/糞便濕重×100%。

1.7血清酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 檢測(cè)大鼠血清5-HT和VIP的含量。按ELISA試劑盒說明測(cè)定各組大鼠血清5-HT和VIP的含量。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,計(jì)算出每個(gè)樣品5-HT和VIP 的含量。

1.8結(jié)腸組織PCR檢測(cè) 將結(jié)腸組織置于離心管中,加入 TRNzol總RNA提取試劑進(jìn)行總RNA提取,采用分光光度計(jì)測(cè)定樣品濃度和純度,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨后進(jìn)行PCR。SP：上游引物5′-GCATTGCCTCCTTGATTTGG-3′,下游5′-TGGCGGTC-TTTTT TCTCGTT-3′,81 bp;CRF：上游引物5′-TCTCTGGATCTCACCTTCCACCTT-3′,下游5′-AGTTTCCTGTTGCTGTGAGCTTGC-3′,92 bp;(引物由美國 Invitrogen 生物技術(shù)有限公司合成,以 GAPDH為內(nèi)參),數(shù)據(jù)采用RQ=2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.9Western印跡 檢測(cè)結(jié)腸組織中SP、CRF蛋白表達(dá)。采用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量,完成蛋白提取、定量、電泳、轉(zhuǎn)印、封閉、抗體孵育、底物發(fā)光等,完成膠片掃描,采用圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶及光密度值。蛋白的相對(duì)含量以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組治療7 d后首粒黑便排出時(shí)間及糞便含水率比較 治療7 d后,各組首粒黑便排出時(shí)間比較：模型組>穴位按壓組>陽性藥物組(均P<0.05);模型組糞便含水率明顯低于穴位按壓組、陽性藥物組(均P<0.05),穴位按壓組和陽性藥物組糞便含水率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組治療7 d后首粒黑便排出時(shí)間、糞便含水率、血清5-HT、VIP和SP、CRF mRNA及蛋白水平比較

2.2ELISA檢測(cè)各組5-HT、VIP水平 模型組5-HT明顯低于穴位按壓組、陽性藥物組,模型組VIP水平明顯高于穴位按壓組、陽性藥物組(均P<0.05),穴位按壓組和陽性藥物組5-HT、VIP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3PCR檢測(cè)各組結(jié)腸組織SP、CRF mRNA和蛋白水平 模型組SP、CRF mRNA和蛋白水平明顯低于穴位按壓組、陽性藥物組(均P<0.05),穴位按壓組和陽性藥物組SP、CRF mRNA和蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)各組結(jié)腸組織SP、CRF蛋白表達(dá)

3 討 論

FC是消化系統(tǒng)常見的功能性胃腸道疾病,發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。西藥治療主要以刺激性瀉藥為主,效果欠佳,容易反復(fù),長期便秘發(fā)作甚至?xí)T發(fā)心腦疾病〔6〕。中醫(yī)治療療效確切持久、治病求本、歷史悠久,副作用少,有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),中醫(yī)學(xué)家認(rèn)為FC的病因病機(jī)主要從脾胃論治,常兼其他臟腑病變〔7〕。治療方法有中藥方劑內(nèi)服施治、中醫(yī)外治兩類。中藥根據(jù)臨床癥狀、舌脈表現(xiàn),四診合參進(jìn)行辨證分型施治,效果顯著。外治方法多樣化,以針灸治療、穴位貼敷、穴位注射、推拿療法、中藥灌腸為主,療效顯著〔8〕。健脾五穴,是中醫(yī)腹部按摩常用的推拿選穴。選穴包括神闕、中脘、章門、天樞、氣海。神闕是駱競洪九宮腹部推拿中的中宮,善于運(yùn)氣健脾,調(diào)暢氣機(jī);中脘、章門,一臟會(huì)一腹會(huì),是臟腑點(diǎn)穴中兩個(gè)合用穴;氣海有提氣健脾之法,臨床效果頗為明顯;天樞為天地交接之處、氣機(jī)轉(zhuǎn)輸之紐,點(diǎn)按此穴有利于助氣海,運(yùn)氣下行。健脾五穴點(diǎn)按法治療老年FC臨床療效較好,但因缺少有效的機(jī)制支撐,故阻礙了有效的臨床推廣及應(yīng)用。近年來研究發(fā)現(xiàn),“腦-腸軸”調(diào)節(jié)失衡在FC發(fā)病過程中扮演了重要的角色,該學(xué)說正逐漸成為FC機(jī)制研究的新熱點(diǎn)〔9〕。相關(guān)研究表明,5-HT、VIP、SP、CRF等腦腸肽的表達(dá)差異可影響患者的胃腸排空功能和腸蠕動(dòng),并與FC的發(fā)病密切相關(guān)〔10〕。本研究在以往臨床研究及動(dòng)物研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合現(xiàn)代理化技術(shù)、模型技術(shù)、動(dòng)物治療技術(shù)等,開展針對(duì)健脾五穴點(diǎn)按法治療老年FC大鼠影響的研究,從“腦-腸軸”調(diào)節(jié)上闡述健脾五穴對(duì)老年FC的影響作用。

綜上,經(jīng)健脾五穴按壓治療后,提高了FC大鼠結(jié)腸組織中SP、CRF mRNA表達(dá)和蛋白活性,對(duì)腦腸肽的紊亂具有調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)了大鼠排便,改善了FC癥狀。