李妍 張紅 紀(jì)朋艷 蔡同建 陳泉瑛 呂權(quán)洲

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132013;2陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系;3吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB) 源于胚胎時(shí)期的原始交感神經(jīng)或腎上腺髓質(zhì),可發(fā)生于頸部、腹部、腎上腺及盆腔等多個(gè)部位〔1〕。NB具有高度惡性,且腫瘤細(xì)胞侵襲性強(qiáng),約70%的患者伴有轉(zhuǎn)移性疾病,臨床上NB的治療以手術(shù)治療為主,輔以放療和化療,但治療效果不佳〔2,3〕。傳統(tǒng)中藥材柴胡是傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將柴胡列為上品,其在中醫(yī)臨床上的用藥史已達(dá)兩千多年。因具有清熱解表、調(diào)肝理氣、扶陽(yáng)正本等功效,柴胡被廣泛用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來(lái)、肝郁氣滯等癥。柴胡皂苷含量高,種類(lèi)多,是柴胡的主要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),柴胡皂苷具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、神經(jīng)調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)等多種作用〔4～7〕。柴胡皂苷(SS)d是從柴胡中提取的一種三萜皂苷。大量研究證實(shí),SSd具有廣泛的抗瘤作用,能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖〔8～11〕。本文前期研究證實(shí)SSd能夠促進(jìn)NB的SH-SY5Y細(xì)胞NB凋亡〔12〕。但SSd誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討SSd引起SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑 SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;SSd購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自沈陽(yáng)市華東試劑廠;胎牛血清購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;活性氧(ROS)熒光探針(DCFH-DA)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;丙二醛(MDA)細(xì)胞測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體購(gòu)自美國(guó)cell signaling technology公司。

1.2儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自北京東方安若生化科技有限公司;倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;超凈臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化儀器廠;低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)sigma公司;電泳儀及轉(zhuǎn)印槽購(gòu)自北京六一儀器廠;細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自加拿大JET公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將SH-SY5Y細(xì)胞株置于含DMEM(內(nèi)含體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清,100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素)的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2天進(jìn)行1次傳代。

1.4SSd藥物配制及分組 準(zhǔn)確稱(chēng)取SSd標(biāo)準(zhǔn)品粉末,將SSd標(biāo)準(zhǔn)品粉末溶于含0.3% DMSO的DMEM,配制成終濃度分別為0(對(duì)照組)、4、8、10 μmol/L 的SSd組。

1.5細(xì)胞ROS水平檢測(cè) 細(xì)胞分組同上,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞,接種于24孔板中,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡瞬時(shí)測(cè)定2′,7′-二氯熒光素(DCF)含量,使用Image J軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析,分析不同濃度SSd處理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)ROS含量,檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度。

1.6細(xì)胞LDH含量測(cè)定 細(xì)胞接種于24孔板內(nèi),SSd處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,取其上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,然后采用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH活性。

1.7細(xì)胞MDA含量測(cè)定 SH-SY5Y細(xì)胞接種于24孔板內(nèi),待貼壁后加入不同濃度的SSd生長(zhǎng)48 h后,4 ℃離心,取其上清液,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,酶標(biāo)儀檢測(cè)各組吸光度(OD)值。

1.8Western印跡檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞中CyclinD1、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2及Bcl-2相關(guān)X基因(Bax)蛋白表達(dá)：處理48 h后,胰酶消化,收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白并采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每孔加入50 μg蛋白溶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,4 ℃低溫條件下電轉(zhuǎn)。5%脫脂奶粉封閉,將CyclinD1、Bax及Bcl-2一抗分別用封閉液按1∶1 000稀釋后加于NC膜上,4 ℃孵育過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌后加入辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗,孵育2 h后進(jìn)行成像,以β-actin為內(nèi)參,后顯影、定影。圖像經(jīng)GeneGenius凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析,組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SSd影響SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平及MDA含量 與對(duì)照組相比,8、10 μmol/L SSd組細(xì)胞中ROS水平及MDA含量明顯增加(P<0.01,P<0.05),且有隨SSd濃度增加而升高趨勢(shì)。見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平、LDH活性、MDA、CyclinD1、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較

圖1 不同濃度SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平的影響(DCFH-DA染色,×200)

2.2SSd影響SH-SY5Y細(xì)胞LDH活性 與對(duì)照組比較,4、8和10 μmol/L SSd組LDH活性顯著升高(P<0.05,P<0.01),且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。見(jiàn)表1。

2.3SSd影響SH-SY5Y細(xì)胞CyclinD1、Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較,8、10 μmol/L SSd組Bcl-2表達(dá)顯著降低(P<0.01);4、8 和10 μmol/L SSd組Bax表達(dá)顯著升高,CyclinD1表達(dá)顯著降低(P<0.05,P<0.01),且SSd作用呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1、圖2。

1～4：對(duì)照組、4、8、10 μmol/L SSd組圖2 各組SH-SY5Y細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平

3 討 論

迄今為止,NB的病因未完全闡明,目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制與環(huán)境因素和遺傳有關(guān)〔13〕。尋找有效且不良反應(yīng)小的治療藥物對(duì)提高 NB患者的生存質(zhì)量有重要意義,SSd是從中藥柴胡中提取純化的主要生物活性成分之一。Tang等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)SSd可抑制肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。同時(shí),研究表明SSd通過(guò)下調(diào)多糖耐藥蛋白(MDR)1和P-糖蛋白(gp)的表達(dá),可增強(qiáng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性〔15〕。另有研究證實(shí),SSd可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移能力且呈劑量效應(yīng)關(guān)系〔16〕。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明SSd具有廣泛的抗腫瘤作用。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體在各種理化因素作用下生成較多的ROS自由基和活性氮(RNS)自由基等活性分子,導(dǎo)致機(jī)體的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡被破壞,引起機(jī)體損傷。當(dāng)氧分子與單電子反應(yīng)時(shí)可生成超氧陰離子,后者可進(jìn)一步與電子反應(yīng)生成過(guò)氧化氫、羥自由基等物質(zhì),這些氧化性質(zhì)活躍的含氧分子統(tǒng)稱(chēng)為ROS。藥物作用、細(xì)菌感染及組織缺氧等情況可導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS〔17〕。MDA為細(xì)胞在各種理化因素作用下膜相關(guān)的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)生成的產(chǎn)物,為機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的重要標(biāo)志物,可代表細(xì)胞氧化損傷程度〔18〕。LDH參與機(jī)體的能量代謝,能夠催化乳酸與丙酮酸之間的相互轉(zhuǎn)化。LDH為細(xì)胞內(nèi)酶,當(dāng)細(xì)胞膜損傷時(shí)其細(xì)胞外含量增加,因此LDH的釋放量是判斷細(xì)胞膜的完整性及發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)〔19〕。本研究發(fā)現(xiàn),SSd可通過(guò)增加SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平損傷細(xì)胞。

細(xì)胞增殖是生物傳代和生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。腫瘤的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖相關(guān)基因的異常表達(dá)、功能失活、突變等改變密切相關(guān)。細(xì)胞分裂是增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié),真核細(xì)胞的分裂周期主要分為分裂間期(G1、S、G2期)和有絲分裂期(M期),細(xì)胞在G1期合成所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在S期進(jìn)行DNA復(fù)制,在G2期進(jìn)行線(xiàn)粒體及其他細(xì)胞器的復(fù)制。CyclinD1廣泛存在于真核細(xì)胞中,是Cyclin家族中的重要成員,能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化。研究顯示,CyclinD1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),在多種腫瘤細(xì)胞中均可檢測(cè)到高表達(dá)的CyclinD1〔20〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),4～10 μmol/L SSd均可明顯抑制SH-SY5Y細(xì)胞中CyclinD1表達(dá),提示SSd對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖抑制作用與降低CyclinD1蛋白表達(dá)密切相關(guān)。

細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷是引起細(xì)胞凋亡的重要因素,過(guò)量的ROS會(huì)破壞線(xiàn)粒體膜的完整性,引起線(xiàn)粒體膜電位喪失,進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔21〕;同時(shí),有研究證實(shí)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖周期異常調(diào)控密切相關(guān),在缺氧、某些毒物和藥物的作用下,細(xì)胞周期蛋白表達(dá)被抑制,細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序〔22〕。本研究證實(shí),SSd不僅能夠引起SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)及CyclinD1表達(dá)抑制,同時(shí)能夠促進(jìn)Bax蛋白表達(dá),抑制Bcl-2蛋白表達(dá),提示SSd可能通過(guò)誘導(dǎo)NB的SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷并引起細(xì)胞周期調(diào)控異常進(jìn)而使凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)異常,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。