周明東 田陸高 仝巧云

(三峽大學 1第一臨床醫(yī)學院,湖北 宜昌 443000;2消化疾病研究所;3宜昌市中心人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

糖尿病(DM)胃輕癱是DM患者最常見的一種并發(fā)癥,主要是因為DM患者長期血糖控制欠佳,引起胃排空明顯延遲,進而產(chǎn)生腹痛、腹脹、惡心和嘔吐等消化道癥狀,嚴重影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。DM胃輕癱具有較高的發(fā)病率,藥物治療目前仍是其主要的治療手段,但因長期口服藥物治療副作用明顯,且長期口服藥物后期療效欠佳,具有一定的局限性〔2〕。電針刺激是在我國傳統(tǒng)醫(yī)學針灸的基礎上給予一定頻率和強度的電流,以達到更有效的治療作用;具有無創(chuàng)、方便、廉價、可重復性強、副作用小及療效顯著等特點,得到了世界衛(wèi)生組織和美國國立衛(wèi)生研究院的認可〔3,4〕。研究發(fā)現(xiàn)電針刺激可以調(diào)節(jié)胃腸動力,改善患者消化不良的臨床癥狀,但其具體機制尚不明確〔5〕。Cajal間質(zhì)細胞(ICC)是胃腸道蠕動的起搏細胞,主要以網(wǎng)狀形態(tài)銜接在胃腸神經(jīng)末梢和平滑肌之間,是胃腸運動的始動者和神經(jīng)信號傳遞者〔6〕。臨床研究表明,DM胃輕癱患者可出現(xiàn)明顯ICC減少,動物研究表明電針刺激可以修復ICC網(wǎng)絡〔7,8〕。在DM狀態(tài)下,膜型的干細胞因子(mSCF)可以促進c-Kit的表達〔9〕。本研究擬探索電針刺激是否通過mSCF/c-Kit信號促進ICC網(wǎng)絡修復,促進DM小鼠胃排空。

1 材料和方法

1.1動物模型構(gòu)建 6～8周齡雄性C57BL/6小鼠40只,體質(zhì)量20～25 g,飼養(yǎng)于三峽大學實驗動物中心。適宜的實驗室飼養(yǎng)條件下(22 ℃,12/12 h晝夜交替),可以自由進食和飲水。將小鼠隨機分為4組,正常對照(Control)組、DM(DM)組、DM假性刺激(DM+SEA)組、DM電針刺激(DM+EA)組。DM組及DM+EA組小鼠通過腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ,150 mg/kg)構(gòu)建DM小鼠模型,STZ注射1 w后不同時間檢測兩次小鼠尾靜脈血糖水平,血糖水平>250 mg/dl確定為DM模型建立成功。DM+SEA組僅給予針刺(不通電流)30 min/d,DM+EA組給予10 Hz,1～3 mA,30 min/d電針刺激處理。電針刺激均于每天上午9∶00～9∶30執(zhí)行。電針刺激儀為G6805-2A型(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司),針灸針長約7 mm(北京中研太和)。小鼠足三里穴(ST-36)位于脛骨和腓骨之間,脛骨前結(jié)節(jié)下約2 mm處,垂直針刺深度2～3 mm。連續(xù)刺激8 w,定期監(jiān)測小鼠體質(zhì)量和血糖變化。

1.2胃排空率測定 將0.3 ml濃度為0.05%酚紅(稀釋于1.5%羥甲基纖維素鈉溶液)灌入禁食24 h后的小鼠胃中,20 min后脫頸處死小鼠,剖腹結(jié)扎賁門和幽門,取出整個胃,并將胃內(nèi)容物全部取出,置于一定量的0.1 mol/L NaOH溶液中攪拌均勻,采用分光光度計檢測分析。計算胃排空率,計算公式為：胃排空率=(1-實際測定酚紅吸收光度值/標準酚紅吸收光度值)×100%。

1.3免疫熒光檢測 將獲取的新鮮胃組織置入預冷的Kreb液,沿小彎剪開胃組織,并將胃內(nèi)容物清洗干凈。胃組織展開后固定在鼠尾膠原表面,采用顯微鑷去除黏膜層,冷丙酮固定10 min。將丙酮處理后胃肌層組織在1×磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次后,置入含0.3% Triton X-100的5%山羊血清封閉2 h。將封閉后的胃肌層組織在4 ℃條件下置入含0.3% Triton X-100的Ano1一抗(兔來源,1∶100;eBioscience,San Diego,CA,USA)或c-Kit一抗(大鼠來源,1∶200,Abcam,Cambridge,MA,USA)孵育24 h。PBS漂洗3次后,分別采用含0.3% Triton X-100的山羊抗大鼠Dylight 488免疫球蛋白(Ig)G和山羊抗兔Dylight 594 IgG (Abbkine) 孵育2 h。制片后采用共聚焦顯微鏡(Olymplus,東京,日本)進行檢測。

1.4Western印跡檢測 將新鮮冰凍胃組織研磨后加入裂解液,提取組織蛋白,并采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。每個樣本吸取80 mg提取組織蛋白使用10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白,將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。轉(zhuǎn)印好的PVDF膜放置在TBST溶液配制好的脫脂牛奶中封閉1 h。所有的PVDF膜置入含有山羊抗c-Kit(1∶1 000;R&D Systems,Minneapolis,USA)、山羊抗mSCF(1∶1 000;R&D Systems,Minneapolis,USA)和兔抗小鼠GAPDH(1∶2 000;GeneTex,San Antonio,TX,USA)孵育過夜。TBST液中漂洗3次,PVDF膜轉(zhuǎn)至1∶2 000的抗兔二抗或抗山羊二抗中室溫孵育1 h。TBST溶液洗滌3次后,采用電化學發(fā)光(ECL)顯色試劑盒進行曝光。Alphaview軟件對曝光圖像進行分析定量。

1.5逆轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(PCR)檢測 胃組織mRNA表達檢測采用RT-PCR法。胃組織RNA使用Trizol試劑提取,使用PrimeScript RT Master Mix(Takara,Otsu,Japan)將提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。mSCF和c-Kit特異性引物序列為：c-Kit mRNA正義鏈：5′-GACCCGACGCAACTTCCTTA-3′,反義鏈：5′-GAGCATCTTCACGGCAACTGT-3′;mSCF mRNA正義鏈：5′-GGAAAATAGTGGATGACCTCG TG-3′,反義鏈：5′-TGGAATCTTTCTCGGGACCTAA-3′。數(shù)據(jù)分析公式為：△Ct= CT,Target -CT,GAPDH,然后代入公式=2-ΔΔCt計算出各組中c-Kit、mSCF基因的相對RNA表達水平。

2 結(jié) 果

2.1電針刺激對體質(zhì)量和血糖的影響 造模成功后2、4、6、8 w,Control組體質(zhì)量均明顯高于其余3組(均P<0.05),造模成功后8 w,DM+EA組體質(zhì)量明顯高于DM組(P<0.05);造模成功及造模成功后2、4、6、8 w,Control組血糖水平均明顯低于其余3組(均P<0.05),DM組和DM+EA組同一時間點血糖水平差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1、表2。

表1 各組體質(zhì)量監(jiān)測變化

表2 各組血糖水平變化

2.2電針刺激對胃排空的作用 與Control組胃排空率〔(0.61±0.014)%〕相比,DM組〔(0.40±0.013)%〕和DM+SEA組〔(0.41±0.024)%〕均明顯降低(均P<0.05),DM+EA組〔(0.56±0.012)%〕胃排空率明顯高于DM組(P<0.05)。

2.3電針刺激對mSCF-Kit信號的影響 與Control組比較,DM組和DM+SEA組c-Kit、mSCF蛋白和mRNA水平均明顯降低(均P<0.05);與DM組比較,DM+EA組c-Kit、mSCF蛋白和mRNA水平明顯升高(均P<0.05)。見圖1、表3、表4。

表3 各組c-Kit和SCF蛋白相對表達水平

表4 各組c-Kit和SCF mRNA相對表達水平

2.4電針刺激對ICC 網(wǎng)絡的影響 Control組肌間可見濃密、明亮而完整的Ano1陽性和c-Kit陽性ICC網(wǎng)絡;而DM組和DM+SEA組Ano1陽性和c-Kit陽性ICC細胞網(wǎng)絡可見亮度明顯減弱,數(shù)目顯著減少,甚至消失,網(wǎng)絡出現(xiàn)破壞中斷。與DM組比較,DE+EA組肌間Ano1陽性和c-Kit陽性ICC細胞網(wǎng)絡亮度明顯增加,細胞間銜接完整,未見明顯網(wǎng)絡中斷、破壞表現(xiàn)。見圖2。

圖2 各組Ano1和c-Kit陽性ICC網(wǎng)絡(免疫熒光染色,×200)

3 討 論

DM胃輕癱是DM主要并發(fā)癥之一,臨床上主要表現(xiàn)為腹脹、惡心、嘔吐等不適,胃鏡檢查可見明顯胃潴留,研究發(fā)現(xiàn)DM胃輕癱的發(fā)生可能與肌間ICC的損傷和缺失明顯相關〔7〕。電針刺激作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學針刺與電流刺激的結(jié)合,研究發(fā)現(xiàn)其在臨床治療胃腸動力障礙性疾病具有一定的療效〔8〕。胃排空延遲是導致DM胃輕癱患者腹脹、惡心等腹部不適癥狀的主要原因,臨床上促胃動力藥物在一定程度上可以改善患者的臨床癥狀。有研究發(fā)現(xiàn),電針刺激可以改善手術患者的胃排空功能〔10〕,本研究也發(fā)現(xiàn),電針刺激同樣可以促進DM小鼠胃排空率。同時,本研究發(fā)現(xiàn)電針刺激并不能改善DM小鼠血糖水平,但可以改善DM小鼠體質(zhì)量減輕的狀態(tài),推測可能與電針刺激促進胃排空后在一定程度上改善DM小鼠營養(yǎng)狀態(tài)相關。

ICC細胞是胃腸道蠕動波電活動起搏細胞,可以觸發(fā)電活動形成胃腸道蠕動波,促進攝入食物在消化道的傳輸〔11,12〕。C-Kit是酪氨酸蛋白激酶受體,在胃腸道組織中表達在ICC和極少量肥大細胞表面,是ICC細胞經(jīng)典的標記物〔13〕。而Ano1是鈣離子激活的氯離子通道蛋白,在胃腸道組織中表達在c-kit陰性在內(nèi)的所有ICC表面,但不表達在肥大細胞表面〔14〕。因此,Ano1作為胃腸道組織內(nèi)ICC標記物具有更好的特異性和靈敏性。研究已證實DM狀態(tài)下胃組織內(nèi)Ano1和c-kit陽性ICC均明顯減少〔7〕。本研究也提示,DM小鼠在8 w時胃組織內(nèi)Ano1和c-Kit陽性ICC明顯減少,但電針刺激可以改善這種情況,維持Ano1陽性ICC和c-Kit陽性細胞表達。M-SCF是c-kit配體,研究發(fā)現(xiàn)兩者在促進和維持ICC增殖、分化和生存方面具有重要的作用〔9〕。本研究也發(fā)現(xiàn),電針刺激可以促進mSCF和c-kit蛋白和mRNA水平的表達,進一步推測電針刺激可能通過促進和維持mSCF/c-Kit信號表達,維持ICC的完整性和功能。