張琳琳 董筱茜 于穎澤 張家煜 牛韶祎 張晨昱 胡文婷 王蓉 趙文杰

(1海南大學(xué)藥學(xué)院 熱帶生物資源教育部重點實驗室,海南 ?？?570228;2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

慢性神經(jīng)退行性疾病是一類以帕金森病、阿爾茨海默病和肌萎縮側(cè)索硬化為代表、中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行性神經(jīng)元丟失為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年研究證實神經(jīng)炎癥在慢性神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔1～3〕。小膠質(zhì)細胞作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫細胞在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),當受到外界的刺激或者損傷時,小膠質(zhì)細胞會被激活。激活的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生致炎因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6,導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量自由基、活性氧(ROS)等,引發(fā)更嚴重的炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,因而在神經(jīng)退行性疾病致病過程中發(fā)揮重要作用〔4,5〕。褐藻素是一種從海藻中提取獲得的、含量最豐富的天然類胡蘿卜素。 研究發(fā)現(xiàn),褐藻素具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和增強機體免疫等多種生物學(xué)功能〔6,7〕,然而到目前為止,褐藻素對被激活的小膠質(zhì)細胞導(dǎo)致的神經(jīng)損傷是否具有保護作用仍不清楚。本研究探討褐藻素對神經(jīng)炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護作用,為褐藻素成為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病治療藥物提供前期理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 BV2小膠質(zhì)細胞購于中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心,SH-SY5Y細胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。CCK-8試劑盒、線粒體膜電位試劑盒和ROS試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購于上海ES science公司。小鼠 TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和小鼠 IL-6 ELISA 試劑盒購于美國 Invitrogen 公司。南美胎牛血清購于AusGeneX 公司。

1.2CCK-8檢測BV2及SH-SY5Y細胞存活率 BV2或SH-SY5Y細胞,每孔細胞數(shù)1×105/ml 接種于96孔板,每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,置于細胞培養(yǎng)箱24 h后,加入不同濃度褐藻素(0、5、15、20、25、30、40、80 μmol/L)培養(yǎng)24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,避光加入CCK-8溶液,放入培養(yǎng)箱孵育1 h。孵育結(jié)束,酶標儀450 nm檢測吸光度,計算細胞存活率。

1.3ELISA檢測TNF-α、IL-6水平 每孔細胞數(shù)為1×105/ml BV2細胞接種于24 孔板,每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,置于細胞培養(yǎng)箱24 h后,分為正常對照組、脂多糖(LPS)組(濃度為200 ng/ml)、低劑量褐藻素治療組(200 ng/ml LPS+5 μmol/L褐藻素)、高劑量褐藻素治療組(200 ng/ml LPS + 25 μmol/L褐藻素),正常低劑量褐藻素對照組(5 μmol/L褐藻素),正常高劑量褐藻素對照組(25 μmol/L褐藻素)。培養(yǎng)24 h,取培養(yǎng)基上清,ELISA檢測TNF-α、IL-6水平。ELISA檢測步驟如下：每孔加入50 μl樣品稀釋液與50 μl樣品后,再加50 μl生物素化抗體,孵育2 h,孵育結(jié)束后,洗滌緩沖液洗滌5次,每孔加100 μl鏈霉親和素標記辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP),孵育 1 h。孵育結(jié)束后,洗滌緩沖液洗滌5次,每孔加入100 μl TMB底物溶液,避光顯色30 min后,每孔加入 100 μl 終止液終止反應(yīng),在450 nm下檢測其吸光度值,按照標準曲線計算TNF-α、IL-6濃度。

1.4線粒體膜電位檢測 每孔細胞數(shù)1×105/ml的BV2細胞接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,按照1.3分組,藥物處理24 h,按照試劑盒說明書,去除上清,預(yù)冷PBS 洗滌,避光每孔等量加入培養(yǎng)液和工作液,孵育20 min,去除上清,預(yù)冷1× JC-1染色工作液離心洗滌,收集細胞流式細胞儀檢測線粒體膜電位水平。

1.5細胞ROS檢測 BV2細胞,每孔細胞數(shù)1×105/ml,接種于6孔板,培養(yǎng)24 h后,按照1.3分組,藥物處理24 h,按照試劑盒說明書,去除上清,每孔加入1 ml2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),孵育20 min。PBS 洗滌,收集細胞,流式細胞儀檢測細胞ROS水平。

1.6CCK-8測定LPS誘導(dǎo)的BV2細胞條件培養(yǎng)基對SH-SY5Y細胞存活率的影響 BV2細胞,每孔細胞數(shù)1× 105/ml接種于 96孔板,每個濃度3個復(fù)孔,置于細胞培養(yǎng)箱 24 h后,按照1.3分組,藥物處理24 h,取各組條件培養(yǎng)基加入SH-SY5Y細胞處理24 h,避光加入 CCK-8 溶液, 放入培養(yǎng)箱孵育1 h。孵育結(jié)束,酶標儀450 nm 檢測吸光度,計算細胞存活率。

1.7Annexin Ⅴ-FITC試劑盒檢測凋亡 BV2細胞,每孔細胞數(shù) 1× 105/ml,接種于6孔板,每個濃度設(shè)3個復(fù)孔,置于細胞培養(yǎng)箱 24 h后,按照1.3分組,藥物處理24 h,取各組條件培養(yǎng)基加入SH-SY5Y細胞,處理24 h后,PBS洗滌,收集各組細胞。加1×結(jié)合緩沖液,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI,混勻,室溫避光孵育5 min,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPadPrism9軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度褐藻素對BV2細胞和SH-SY5Y細胞存活率的影響 0、5、10、15、20、25、30、40、80 μmol/L不同濃度褐藻素處理BV2細胞后,對BV2細胞均無明顯毒性;而0、5、10、15、20、25、30、40、80 μmol/L不同濃度褐藻素處理SH-SY5Y細胞后,40和80 μmol/L組細胞存活率明顯降低(P<0.05),呈濃度依賴性。5和25 μmol/L濃度的褐藻素對兩種細胞均無明顯藥物毒性,后續(xù)實驗采用這兩種濃度進行。見表1。

表1 不同濃度褐藻素對BV2和SHSY5Y細胞存活率的影響

2.2褐藻素抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細胞TNF-α和IL-6水平 與正常對照組比較,LPS組TNF-α和IL-6水平均明顯增加(P<0.05),而高、低劑量褐藻素均可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的釋放(P<0.05),但高、低劑量褐藻素治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。正常對照組和正常低、高劑量褐藻素對照組TNF-α和IL-6水平均無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 褐藻素對LPS誘導(dǎo)的BV2的TNF-α和IL-6、氧化應(yīng)激、線粒體膜電位、細胞存活率、凋亡率的影響

2.3褐藻素可抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細胞ROS水平 與正常對照組相比,LPS組ROS水平明顯升高(P<0.05)。高、低劑量褐藻素治療組ROS含量均明顯低于LPS組(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 褐藻素對LPS誘導(dǎo)的BV2細胞氧化應(yīng)激的影響

2.4褐藻素可減少BV2活化后條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)SH-SY5Y細胞的凋亡 與正常對照組相比,LPS組SH-SY5Y細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);高、低劑量褐藻素治療組SH-SY5Y細胞凋亡率相較于LPS組均顯著減少(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 褐藻素在各組LPS活化的BV2細胞條件培養(yǎng)基中對SHSY5Y細胞凋亡率的影響

2.5褐藻素在LPS活化的BV2條件培養(yǎng)基中對SH-SY5Y細胞的損傷作用 與正常對照組相比,LPS組SH-SY5Y細胞存活率明顯下降(P<0.05);與LPS模型組相比,高、低劑量褐藻素治療組SH-SY5Y細胞存活率則顯著上升(P<0.05);高、低劑量褐藻素治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。正常對照組和正常低、高劑量褐藻素對照組細胞存活率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

2.6褐藻素可改善LPS損傷的BV2線粒體膜電位水平 LPS組BV2細胞線粒體膜電位水平明顯低于正常對照組(P<0.05),高、低劑量褐藻素治療組均可明顯改善LPS誘導(dǎo) BV2小膠質(zhì)細胞活化引起的線粒體膜電位下降(P<0.05)。高、低劑量褐藻素治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。正常對照組和正常低、高劑量褐藻素對照組線粒體膜電位無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖3。

圖3 褐藻素對LPS誘導(dǎo)的BV2細胞線粒體膜電位的影響

3 討 論

褐藻素又被稱為巖藻黃質(zhì),已被證實具有多種生物學(xué)功能,如抗炎、抗凝血、抗腫瘤、抗血栓、抗病毒、抗氧化和增強免疫等諸多生物性功能〔6,8〕。研究發(fā)現(xiàn),灌胃給予小鼠褐藻素,通過4 w的毒性試驗觀察,未出現(xiàn)明顯毒性,因此認為褐藻素安全性高,可作為潛在的海洋藥物〔8〕。褐藻素可以抑制LPS刺激的小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞IL-1β和IL-6等促炎因子的水平,從而起到抗炎作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),褐藻素可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細胞的TNF-α、IL-6的釋放,從而起到抗炎作用。過度激活的小膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生很多自由基,當ROS的產(chǎn)生與其清除及細胞修復(fù)的速度失衡時,細胞就會發(fā)生氧化應(yīng)激〔9,10〕。過多的ROS會造成細胞損傷,導(dǎo)致線粒體功能障礙,出現(xiàn)線粒體膜電位下降,從而引起膜通透性增加、線粒體膜破裂、致炎因子釋放增多、DNA復(fù)制發(fā)生障礙,最終導(dǎo)致細胞凋亡〔11,12〕。本研究結(jié)果提示,褐藻素可通過抑制促炎因子的分泌,改善線粒體膜電位和抑制氧化應(yīng)激,從而抑制小膠質(zhì)細胞的活化。

本研究發(fā)現(xiàn),褐藻素能明顯改善LPS活化BV2細胞條件培養(yǎng)基引起的細胞損傷。細胞凋亡是一種細胞程序性死亡方式,在細胞損傷中發(fā)揮重要作用,也是很多神經(jīng)保護藥物作用的重要機制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),褐藻素可以明顯抑制細胞凋亡從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上, 褐藻素可以通過抑制BV2小膠質(zhì)細胞活化,減少促炎因子釋放,改善線粒體膜電位,抑制氧化應(yīng)激,從而對BV2小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細胞損傷發(fā)揮保護作用,因而褐藻素未來有望作為治療慢性神經(jīng)退行性疾病的候選藥物。