劉曉梅 白光輝 郭云娣

(1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 蘇州 215009;2蘇州市立醫(yī)院普外科)

胃癌(GC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一〔1〕;2022年中國(guó)癌癥中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：胃癌發(fā)病率僅次于肺癌,位列所有惡性腫瘤第二位,每年新發(fā)病例(40～50)萬(wàn)例〔2〕,而在各種治療方式中,雖然化療和手術(shù)提供了很大的幫助,但對(duì)于晚期胃癌療效仍不盡如人意〔1〕。EB病毒(EBV)陽(yáng)性〔EBV(+)〕GC是一種繼發(fā)于EBV感染的胃黏膜上皮細(xì)胞〔3〕克隆性生長(zhǎng)的胃腺癌,這種GC類(lèi)型具有獨(dú)特的信號(hào)通路,其相關(guān)的分子特征可以揭示藥物治療〔4〕的潛在靶點(diǎn)。SHH是編碼分泌型糖蛋白配體hedgehog(HH)蛋白的基因,主要在胚胎期參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化,特別是在維持正常胃腸道生長(zhǎng)和分化中發(fā)揮作用〔5〕。近年來(lái),SHH在正常胃腸道及胃腸道惡性腫瘤中的表達(dá)也被報(bào)道〔5～8〕,但在EBV(+)GC中研究較少。本實(shí)驗(yàn)探索SHH蛋白質(zhì)在EBV(-)GC、 EBV(+)GC及癌旁正常組織中的表達(dá)模式及其與臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 收集蘇州市立醫(yī)院2000年1月至2010年12月住院患者手術(shù)切除GC病理蠟塊標(biāo)本486例,由于較薄組織在切片時(shí)缺失,本組有效病例為375例〔檢測(cè)出EBV(+)GC 10例〕,之后另外收集EBV(+)GC 12例;鄰近正常組織(距腫瘤5 cm以上)200例。隨訪時(shí)間2～63個(gè)月?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行放、化療,所有標(biāo)本經(jīng)兩位病理專(zhuān)家閱片確診?；颊邿o(wú)其他惡性腫瘤及心、肝、腎等重要器官?lài)?yán)重?fù)p傷。排除臨床資料不完整者。本研究375例GC中年齡中位數(shù)為61.0歲。

1.2試劑 免疫組化：SHH抗體購(gòu)自Abcam公司(EP1190Y,ab53281),為兔抗人多克隆抗體,用邁新公司抗體稀釋液以1∶200比例稀釋。高壓鍋PH為6.0的檸檬酸鹽液修復(fù)。采用Envision免疫組化法,以檸檬酸鹽緩沖液代替SHH為陰性對(duì)照。EB病毒編碼的小RNA(EBERs)原位雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)于福建泰普生物科學(xué)有限公司,實(shí)驗(yàn)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3組織芯片的構(gòu)建 常規(guī)石蠟包埋蠟塊4 μm厚連續(xù)切片,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色后,用顯微鏡標(biāo)記出對(duì)應(yīng)蠟塊上的腫瘤組織或正常組織。自制10×16芯片蠟塊7個(gè),每個(gè)蠟塊75例×2點(diǎn);2個(gè)癌旁正常組織(距GC組織至少5 cm處)蠟塊8×10(每個(gè)蠟塊50例×2點(diǎn)),另外制作1個(gè)EBV(+)GC 單獨(dú)的芯片蠟塊〔8×5;375例GC芯片中篩選出的10例,再加上后續(xù)臨床確診EBV(+)GC 12例;3例胃正常組織和3例鼻咽癌組織〕,芯點(diǎn)直徑為1.6 ml。蠟塊(空位為芯片定位處)。SHH蛋白染色GC有效組織共375例,EBERs原位雜交陽(yáng)性組織共22例。芯片技術(shù)的專(zhuān)利號(hào)為：200920350099.2。

1.4原位雜交、免疫組化染色及結(jié)果判定 EBV原位雜交EBERs染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：僅細(xì)胞核棕褐色為陽(yáng)性,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜在核分裂時(shí)可以有陽(yáng)性著色,但視為陰性。SHH陽(yáng)性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì),呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果判定方法按照文獻(xiàn)〔1〕方法：將各組織的染色強(qiáng)度和比例相加評(píng)分量化為陰性(0分)、弱陽(yáng)性(1～2分)、中陽(yáng)性(3～4分)、強(qiáng)陽(yáng)性(5～6分)。但本研究只采用了兩種分類(lèi),將染色歸為低表達(dá)(4分及以下),過(guò)表達(dá)(5～6分)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析、Kaplan-Meier分析。

2 結(jié) 果

2.1SHH蛋白在 GC及癌旁正常組織中的表達(dá) SHH在 GC組織中陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),其表達(dá)率為71.2%(267/375);在癌旁正常組織中亦表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),其陽(yáng)性率為61.5%(123/200);兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.012,P=0.000),SHH蛋白明顯高表達(dá)于GC組織中。見(jiàn)圖1。

2.2SHH陽(yáng)性表達(dá)與GC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 375例GC中,SHH陽(yáng)性表達(dá)與年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度、Lauren分型、血管侵犯、TNM分期均無(wú)關(guān)(P>0.05);只與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 SHH陽(yáng)性表達(dá)與GC及EBV(+)GC臨床病理參數(shù)關(guān)系(n)

2.3SHH與EBV(+)GC相關(guān)性 SHH蛋白表達(dá)與EBV(+)GC原位雜交(圖2)的Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示,22例EBV(+)GC中SHH蛋白表達(dá)21例,SHH蛋白表達(dá)與EBV(+)GC呈負(fù)相關(guān)(r=-0.129,P=0.012)。

2.4SHH與EBV(+)GC 生存分析 Kaplan-Meier生存分析：EBV(+)GC隨訪5例,隨訪6～45個(gè)月、EBV(-)GC隨訪151例,隨訪2～63個(gè)月(χ2=0.451,P=0.502); SHH表達(dá)陽(yáng)性者隨訪109例,隨訪2～61個(gè)月;SHH表達(dá)陰性者隨訪40例,隨訪3～63個(gè)月(χ2=0.634,P=0.426),提示2個(gè)檢測(cè)指標(biāo)均與患者生存時(shí)間無(wú)關(guān)。見(jiàn)圖3。

圖3 SHH與EBV表達(dá)GC患者生存曲線

3 討 論

哺乳動(dòng)物中存在3個(gè)Hedgehog的同源基因：SHH、IHH和DHH,分別編碼SHH、IHH和DHH蛋白〔9〕。SHH蛋白作為一種配體在信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,以幫助胚胎發(fā)育、正常成人組織的維持、修復(fù)和腫瘤的發(fā)生,并在包括胃腸道在內(nèi)的多種身體器官中均有表達(dá)〔10〕。本研究結(jié)果提示,SHH作為一種致癌蛋白可能在胃癌早期的發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用,與Zhai等〔11〕的報(bào)道相同,而且SHH信號(hào)通路在成人組織中持續(xù)或異常的激活可促進(jìn)癌癥進(jìn)展〔12〕。在一系列惡性腫瘤中,包括皮膚、乳腺、肺、腦、前列腺和消化道〔12～15〕等器官中,HH通路的調(diào)控異常已被報(bào)道并與此類(lèi)患者的生存期縮短有關(guān),認(rèn)為SHH可能是GC有用的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。Akhtar等〔5〕研究結(jié)果認(rèn)為,SHH與患者生存相關(guān),與本研究結(jié)果相一致,本研究結(jié)果提示,EBV(+)GC獨(dú)特的信號(hào)通路與EBV(-)GC不同,其相關(guān)的分子特征有可能揭示藥物治療的潛在靶點(diǎn)。

盡管90%以上的成年人為EBV攜帶者,但EBV感染極少見(jiàn)于非腫瘤胃黏膜上皮細(xì)胞,而幾乎所有腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到單克隆EBV〔16〕,有研究〔16〕,胃癌中EBV感染率為3.7%(18/486),并同時(shí)存在于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中,推測(cè)EBV感染建立于胃癌發(fā)生的早期階段,這些研究結(jié)果與隨后的〔17～20〕的研究相一致。隨著對(duì)胃癌研究的不斷深入,世界衛(wèi)生組織(WHO)2019年消化系統(tǒng)腫瘤提出了EBV(+)GC這一具有特定分子特征和致癌機(jī)制的GC亞型。而EBV感染是否與SHH信號(hào)通路相關(guān),目前尚未見(jiàn)明確的研究結(jié)果,但我們知道鼻咽癌與EBV感染有因果關(guān)系并表現(xiàn)出頻繁的HH通路調(diào)控異常〔11〕,在正常鼻咽鱗狀上皮中HH通路成分低表達(dá),而在鼻咽癌(NPC)中大量表達(dá)SHH。結(jié)合本研究結(jié)果,提示SHH的異常表達(dá)可能是HH通路活性異常的結(jié)果。許多機(jī)制導(dǎo)致HH通路失調(diào),Port等〔19〕研究發(fā)現(xiàn),EBV對(duì)SHH的誘導(dǎo)可能導(dǎo)致通路失調(diào),SHH過(guò)表達(dá)是否是GC的HH通路失調(diào)的唯一原因尚不清楚,尚需大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來(lái)加以證明,但未來(lái)的研究將揭示GC發(fā)病機(jī)制中這些因素與腫瘤發(fā)展途徑之間的潛在相互作用及EBV在這一現(xiàn)象中所起的作用;這些發(fā)現(xiàn)可提示SHH通路可能是GC及EBV(+)GC潛在的新治療靶點(diǎn)。

綜上,SHH蛋白高表達(dá)于胃癌組織中并與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而與其他臨床病理參數(shù)及患者預(yù)后無(wú)關(guān);與EBV(+)GC呈負(fù)相關(guān)。雖然不排除這些相關(guān)性結(jié)果的偏差及實(shí)驗(yàn)方法的不同或標(biāo)本量不夠等因素,但這些結(jié)果仍可以提示使用特定抑制劑阻斷SHH通路可能是很有潛力的治療靶點(diǎn)。