徐佳 孫平 王海燕 張?jiān)葡?

(杭州市第三人民醫(yī)院 1呼吸內(nèi)科,浙江 杭州 310009;2外科)

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,隨著環(huán)境污染、生活方式改變及老齡化加劇,其患病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì),嚴(yán)重影響人們身心健康〔1,2〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)表明,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌總數(shù)80%以上,在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和病死率,不僅影響患者生存質(zhì)量,且威脅患者生命健康〔3〕。NSCLC作為最常見(jiàn)的肺癌組織學(xué)類型,具有腫瘤生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn),且腫瘤細(xì)胞容易從原發(fā)部位擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔器官,從而造成患者預(yù)后不佳〔4,5〕。大部分NSCLC由于癥狀較為隱匿,導(dǎo)致患者確診時(shí)病情已處于中晚期〔6〕。故而,尋找新的分子標(biāo)志對(duì)NSCLC高危人群進(jìn)行有效識(shí)別,深入了解NSCLC的生物學(xué)機(jī)制,對(duì)NSCLC患者的治療及預(yù)后改善具有重要意義。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)可催化合成一氧化氮,在多種惡性腫瘤中異常表達(dá),且與其預(yù)后密切相關(guān)。目前,關(guān)于iNOS在NSCLC患者中表達(dá)研究甚少,缺乏可靠的臨床參考價(jià)值。本研究旨在探討iNOS在老年NSCLC患者中表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇杭州市第三人民醫(yī)院于2018年1月至2019年1月行手術(shù)切除的老年NSCLC患者100例,取患者癌組織及其癌旁正常組織;年齡65～83歲,平均(74.32±6.28)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)《中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)原發(fā)性肺癌診療指南(2018版)》〔7〕標(biāo)準(zhǔn);(2)經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為NSCLC;(3)具備完整的臨床和隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴其他部位惡性腫瘤者;(2)伴重要臟器衰竭,如嚴(yán)重呼吸道疾病、腎病、肝病或無(wú)法控制的糖尿病、高血壓等慢性疾病者;(3)術(shù)前接受過(guò)放化療者;(4)精神疾病者。

1.2免疫組化法測(cè)定iNOS蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定iNOS蛋白表達(dá)。鼠抗人iNOS多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司),SP免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。具體方法：標(biāo)本均經(jīng)中性甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,連續(xù)切片4 μm。經(jīng)60 ℃烤片切片30 min,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,采用3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,抗原采用檸檬酸鈉緩沖液煮沸修復(fù),放于室溫環(huán)境下自然冷卻。再以5%山羊血清室溫封閉30 min,滴加iNOS蛋白一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。再滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,放置于37 ℃孵育20 min。采用DAB顯色,自來(lái)水沖洗,蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,顯微鏡下觀察。

1.3結(jié)果判定 每張切片隨機(jī)選取200倍不重疊視野5個(gè),計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞比例。iNOS蛋白定位于細(xì)胞核,主要呈淺黃色至棕黃色顆粒狀。按照陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度評(píng)分乘積綜合評(píng)價(jià)。陽(yáng)性細(xì)胞比例：0分為無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞;1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%;2分為陽(yáng)性細(xì)胞11%～30%;3分為陽(yáng)性細(xì)胞31%～50%;4分為陽(yáng)性細(xì)胞>50%。染色強(qiáng)度：0分為陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)著色;1分為陽(yáng)性細(xì)胞淺黃色;2分為陽(yáng)性細(xì)胞棕黃色;3分為陽(yáng)性細(xì)胞棕褐色。以總分≤3分表示(-),4～6分表示(+),7～9分表示(),≥10分表示()。

1.4隨訪情況 隨訪至2023年1月31日,通過(guò)查閱醫(yī)院病案記錄、電話、微信及門診等方式進(jìn)行隨訪,記錄患者總生存期(OS)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn),繪制生存曲線并行多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1癌組織與癌旁組織iNOS陽(yáng)性表達(dá)比較 癌組織iNOS陽(yáng)性表達(dá)〔65例(65.00%)〕顯著高于癌旁組織〔17例(17.00%);χ2=47.623,P<0.05〕。

2.2不同病理特征iNOS陽(yáng)性表達(dá)比較 不同性別、吸煙史、腫瘤直徑、組織學(xué)分化iNOS陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Ⅲ～Ⅳ期iNOS陽(yáng)性表達(dá)顯著高于Ⅰ～Ⅱ期,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移iNOS陽(yáng)性表達(dá)顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3NSCLC患者iNOS表達(dá)與預(yù)后關(guān)系 隨訪至2023年1月31日,隨訪時(shí)間19～60個(gè)月。NSCLC患者iNOS陽(yáng)性表達(dá)OS時(shí)間(30個(gè)月)顯著短于iNOS陰性表達(dá)(39個(gè)月,P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 NSCLC患者iNOS表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

2.4多因素Logistic回歸分析影響預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素 Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和iNOS陽(yáng)性表達(dá)為影響預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 多因素Logistic回歸分析影響NSCLC患者預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素

3 討 論

目前,關(guān)于NSCLC具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,而NSCLC的侵襲性轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者最主要死亡原因,且是當(dāng)今NSCLC治療的重要與難點(diǎn)〔7～9〕?，F(xiàn)階段,針對(duì)NSCLC尚無(wú)特效的治療手段,且患者5年生存率較低〔10～12〕。因此,早期診斷和治療NSCLC患者是提高生存率的關(guān)鍵〔13,14〕。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),肺內(nèi)的巨噬細(xì)胞存在兩種類型,其中M1型巨噬細(xì)胞呈iNOS陽(yáng)性,而argenase 1呈陰性;其能夠被脂多糖、腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ激活,從而產(chǎn)生炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素-12、一氧化氮和iNOS,其中一氧化氮能夠與過(guò)氧化物結(jié)合,從而形成一種細(xì)胞毒性過(guò)氧亞硝酸鹽〔15〕。iNOS在正常生理?xiàng)l件下幾乎不表達(dá),而在病理狀態(tài)下及在誘導(dǎo)因素如脂多糖、白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子誘導(dǎo)下,使iNOS誘導(dǎo)合成一氧化氮相比于正常生理?xiàng)l件下的一氧化氮濃度高1 000倍左右,且認(rèn)為iNOS誘導(dǎo)生成的一氧化氮可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要促進(jìn)作用。近年來(lái),研究顯示iNOS在多種腫瘤中異常表達(dá),且認(rèn)為iNOS對(duì)多種惡性腫瘤的血管生成、侵襲及生長(zhǎng)具有一定影響〔16,17〕。王光輝等〔18〕研究表明,收集148例不同乳腺病理組織及正常乳腺組織20例,其中iNOS在乳腺正常組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá);而在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中陽(yáng)性率為78.8%,在原位癌組織中陽(yáng)性率為52.5%,在乳腺不典型增生組織中陽(yáng)性率為25.0%,且存在顯著差異;5年無(wú)病生存率,原位癌中iNOS染色陽(yáng)性低于陰性,可見(jiàn)在乳腺癌早期階段iNOS即表達(dá)出現(xiàn)升高,其可作為乳腺癌早期診斷及評(píng)估預(yù)后的一種潛在指標(biāo)。王莉等〔19〕研究表明,iNOS在宮頸癌組織中呈過(guò)表達(dá),且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),認(rèn)為可作為宮頸癌生物學(xué)行為及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。趙娜等〔20〕研究表明,收集行手術(shù)切除的卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織96例患者臨床資料,惡性腫瘤患者中iNOS陽(yáng)性表達(dá)率高于交界性腫瘤患者、良性腫瘤患者及正常卵巢組織患者,且惡性腫瘤患者中不同臨床分期和病理分級(jí)間iNOS蛋白表達(dá)具有顯著差異,且分期越高iNOS蛋白陽(yáng)性率越高,可見(jiàn)卵巢上皮性腫瘤患者中iNOS蛋白呈高表達(dá),認(rèn)為其可成為基因治療的靶點(diǎn),對(duì)卵巢上皮性腫瘤患者發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有預(yù)測(cè)作用。