朱俊杰 李建民 吳再輝 劉少鵬 龔澤華 劉俊杰

(華北理工大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000;2附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

腦卒中是急性腦血管疾病,腦內(nèi)缺血或出血而導(dǎo)致的腦組織受損,從而致殘或致死,分為缺血性腦卒中(IS)和出血性腦卒中(ICH)。腦卒中是僅次于缺血性心臟病的第二大死因,其疾病負(fù)擔(dān)較高〔1〕。腦卒中高發(fā)病率與高同型半胱氨酸血癥(Hhcy)和高尿酸血癥有關(guān)。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是人體內(nèi)葉酸-甲硫氨酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶,與葉酸的代謝密切相關(guān),后者在DNA、RNA和蛋白質(zhì)甲基化及DNA合成和維持過(guò)程中發(fā)揮重要作用,與此同時(shí),rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性導(dǎo)致的其生成酶活性和熱穩(wěn)定性下降易導(dǎo)致Hhcy〔2〕。在人類(lèi)的染色體中,MTHFR 基因位于1號(hào)染色體1p36.3上,包括11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子,cDNA長(zhǎng)2.2 kb,其多態(tài)性高。MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn),即 MTHFR C677T,其多態(tài)性與多種疾病(血管病、癌癥、神經(jīng)病學(xué)、糖尿病、銀屑病等)有關(guān),多態(tài)性的流行病學(xué)因地域和種族而異〔2〕。MTHFR C677T基因于第677位堿基對(duì)上胞嘧啶由胸腺嘧啶取代,導(dǎo)致丙氨酸轉(zhuǎn)化為纈氨酸。這一突變降低MTHFR活性和耐熱性,雜合型 CT 型、突變 TT 型酶的活性分別約為65%、30%的CC型酶的活性〔3〕,引起血清葉酸水平異常,進(jìn)而導(dǎo)致Hhcy。MTHFR C677T位點(diǎn)的TT型人群相較于CC型和CT型人群,體內(nèi)尿酸水平顯著較高〔4〕,該基因亦被認(rèn)為是高尿酸血癥和痛風(fēng)相關(guān)基因。一項(xiàng)納入1 470例研究對(duì)象的Meta分析中,MTHFR C677T基因型和尿酸水平與高尿酸血癥顯著相關(guān)〔5〕。有項(xiàng)對(duì)患有認(rèn)知障礙的老年人群的研究表明：血清尿酸和血清同型半胱氨酸呈正相關(guān),協(xié)同導(dǎo)致腦血管病變,飲食干預(yù)將有助于改善血管病變導(dǎo)致的認(rèn)知能力下降,研究認(rèn)為盡管MTHFR C677T 的各基因型對(duì)同型半胱氨酸有影響,但是對(duì)尿酸水平可能無(wú)顯著影響〔6〕。

關(guān)于MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性,在近年來(lái)的研究中存在矛盾的觀點(diǎn)。有研究表明MTHFR(677C>T 和 1298A>C)多態(tài)性使個(gè)體易患IS〔7〕;但是亦有研究〔8〕表明MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)多態(tài)性與ICH的易感性之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)。一項(xiàng)針對(duì)莫斯科地區(qū)的研究,未發(fā)現(xiàn)MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性與IS風(fēng)險(xiǎn)之間存在關(guān)聯(lián)〔9〕?；谟《缺辈咳巳旱牟±龑?duì)照研究說(shuō)明MTHFR C677T 基因多態(tài)性與ICH或IS無(wú)關(guān),然而同型半胱氨酸水平升高與 IS 患者的 MTHFR C677-TT 基因型相關(guān)〔10〕。

因此,考慮到同一基因的突變?cè)诓煌巳褐胁町愝^大及區(qū)域的遺傳差異性,使得MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)多態(tài)性地區(qū)差異性較大,本研究旨在通過(guò)探討MTHFR 基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)唐山地區(qū)人群腦卒中的影響,以期基于該位點(diǎn)多態(tài)性為預(yù)防腦卒中提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2018年11月1日至2021年6月30日華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院腦卒中患者194例為病例組。病例組根據(jù)腦卒中類(lèi)型,又分為IS組和ICH組。同期無(wú)腦卒中病史體檢者221例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病例組符合診斷標(biāo)準(zhǔn),參考《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南 2018》〔11〕《各項(xiàng)腦血管診斷要點(diǎn)》〔12〕《中國(guó)腦出血診治指南(2019)》〔13〕,或曾有過(guò)確診腦卒中病史。②對(duì)照組研究對(duì)象無(wú)新發(fā)腦卒中和該病病史。③研究對(duì)象具有詳細(xì)可靠的臨床病歷資料。④唐山地區(qū)常住人群且父母輩均為本地人,漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：①惡性腫瘤、顱腦外傷、免疫疾病、感染疾病、凝血功能障礙、腦血管畸形。②藥物相關(guān)性腦卒中：抗凝藥物、抗血小板藥物等。③納入ICH組的不包括IS治療過(guò)程中所致的ICH。本研究經(jīng)華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn),患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2資料記錄與血樣采集 研究對(duì)象均記錄年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、高血壓史、飲酒史、糖尿病史、家族史,是否為高尿酸血癥、Hhcy及腦卒中類(lèi)型(IS/ICH)。取研究對(duì)象晨起空腹取外周靜脈血20 ml于抗凝管中置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 上游引物5′-GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT-3′,下游5′-CCTCAAAGAAAAGCTGCGTGATG-3′,野生型探針對(duì)應(yīng)基因突變位點(diǎn)C,其序列5′-3′：VIC-ATGAAATCGGCTCCCGC-NFQ,突變型探針對(duì)應(yīng)基因突變位點(diǎn)T,其序列5′-3′：FAM-ATGAAATCGACTCCCGC-NFQ〔14〕。應(yīng)用 DNA 提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕,操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。紫外分光儀測(cè)定提取的 DNA 樣品 OD260/OD280 比值,若OD比值在 1.8～2.0,則純度符合要求。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：無(wú)菌水9.5 μl,DNA 模板2 μl,上下游引物各1.0 μl(10 pmol/μl),野生型和突變型探針各0.6 μl(10 pmol/μl),PCR Mix 12.5 μl(含除外模板、引物與探針的PCR擴(kuò)增必需組分)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性,95 ℃ 45 s變性,53 ℃ 45 s退火,72 ℃ 1 min延伸,以上步驟30個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min延伸,于4 ℃保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)不同樣本 MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性,檢驗(yàn)結(jié)果由相應(yīng)軟件進(jìn)行判讀。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用R4.0.2軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、非參數(shù)秩和檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)?；蛐偷膬蓛杀容^采用FDR法校正。檢驗(yàn)Hardy-Weinbrey遺傳平衡定律,構(gòu)建多因素二元Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組基線(xiàn)資料對(duì)比 兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙、飲酒、高尿酸血癥及Hhcy差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩組性別、高血壓、糖尿病、腦卒中家族史差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與病例組一般資料比較(n)

2.2MTHFR 基因 rs1801133 位點(diǎn)多態(tài)性

2.2.1rs1801133位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果及Hardy-Weinbrey遺傳平衡定律檢驗(yàn) 病例組、對(duì)照組、IS組、ICH組均滿(mǎn)足Hardy-Weinbrey遺傳平衡定律(χ2=0.49、2.90、0.36、0.04,P=0.48、0.09、0.55、0.84),提示研究對(duì)象具有群體代表性。

2.2.2rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性比較 IS組和ICH組基因型與等位基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IS組、ICH組、病例組分別與對(duì)照組比較,基因型與等位基因差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。建立5種遺傳模型,除隱性模型(TT vs CC+CT)在ICH組和對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)T等位基因攜帶者發(fā)生腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增加,見(jiàn)表3。

表2 IS組與ICH組MTHFR基因 rs1801133位點(diǎn)比較〔n(%)〕

表3 各組5種基因模型OR(95% CI)

2.2.3腦卒中危險(xiǎn)因素 以MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)CT型、TT型及飲酒、糖尿病、高尿酸血癥、腦卒中家族史、Hhcy、吸煙、高血壓、體質(zhì)量指數(shù)等多因素為自變量,以腦卒中為因變量,進(jìn)行二元Logistic 回歸分析。結(jié)果顯示：使得腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增加的因素有TT型、飲酒、吸煙、高尿酸血癥、體質(zhì)量指數(shù)、年齡(P<0.05)。見(jiàn)表4。MTHFR 基因 rs1801133 位點(diǎn)TT型可作為腦卒中患病獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

3 討 論

本研究所納入研究對(duì)象符合Hardy-Weinbrey遺傳平衡定律,說(shuō)明所納入研究對(duì)象可代表唐山地區(qū)人群的情況。本研究結(jié)果表明,MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)多態(tài)性與腦卒中有相關(guān)性。Escobedo等〔15〕對(duì)墨西哥人群中MTHFR基因rs1801133多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性研究中表明,該位點(diǎn)變體的雜合子(CT型)比純合子(TT型)受試者的腦卒中風(fēng)險(xiǎn)高3倍;Mazdeh等〔16〕在對(duì)伊朗人群研究中表明,在隱性模型中,rs1801133與腦卒中風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)〔OR(95%CI)=1.89(1.12～3.20),P=0.03〕;Chang等〔17〕對(duì)老年人IS風(fēng)險(xiǎn)增加的關(guān)聯(lián)研究表明,MTHFR C677T 變體增加了IS的風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)一步亞組分析表明中國(guó)人群的MTHFR C677T 變異與較高的IS風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。Yuan等〔18〕研究表明MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)不同基因型患者,體內(nèi)血漿同型半胱氨酸水平呈現(xiàn)TT基因型>CT基因型>CC基因型的趨勢(shì)。結(jié)合上述可以推測(cè),MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)腦卒中易發(fā)性的影響(即危險(xiǎn)程度大小)可能因種族、地域和年齡而有所差異,與不同基因型對(duì)Hhcy的差異性影響有關(guān)。

本研究結(jié)果提示,對(duì)于MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)雜合 CT 型和突變 TT 型的人群應(yīng)及早預(yù)防腦卒中的發(fā)生。Leng等〔19〕研究表明：MTHFR C677T多態(tài)性和飲食模式對(duì)中國(guó)人群Hhcy具有交互作用,其中零食模式和高肉模式兩種飲食模式與Hhcy風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān),與MTHFR 677TT之間呈協(xié)同效應(yīng)。葉酸和維生素(Vit)B12水平低的高血壓患者首次發(fā)生IS的風(fēng)險(xiǎn)顯著更高;葉酸治療在低葉酸和VitB12的CC基因型患者及高葉酸和VitB12的 TT 基因型患者中的效果最大〔20〕。由此可說(shuō)明：從調(diào)整飲食模式、補(bǔ)充葉酸和預(yù)防及治療Hhcy的角度可能可以預(yù)防CT、TT基因型腦卒中發(fā)生。

本研究證實(shí)了MTHFR基因多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性同樣適用于唐山地區(qū)人群,為該區(qū)域基于該基因多態(tài)性對(duì)腦卒中影響這一事實(shí)以采取預(yù)防措施提供了一定的依據(jù)。本研究尚存在一些局限性：本研究所選取的樣本僅來(lái)源于華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院,盡管樣本量符合要求和樣本數(shù)據(jù)符合Hardy-Weinbrey定律,但是期待本地區(qū)更多醫(yī)院的樣本,使得研究結(jié)果更具有代表性。與此同時(shí),在研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),MTHFR基因多態(tài)性對(duì)腦卒中的影響,可能涉及除此以外的多種基因的聯(lián)合效應(yīng),此種聯(lián)合效應(yīng)及相關(guān)基因與信號(hào)通路正在研究。有研究表明,聯(lián)合基因型 FVL/MTHFR譜會(huì)增加第2次腦卒中發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)〔21〕。亦有研究表明,基因、蛋白質(zhì)和環(huán)境線(xiàn)索都會(huì)產(chǎn)生累積效應(yīng),增加腦血管意外風(fēng)險(xiǎn)〔22〕。本研究尚未排除別的基因的影響及多種基因的聯(lián)合效應(yīng),不可避免地導(dǎo)致研究誤差,這一點(diǎn)上值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,基于唐山地區(qū)人群的分析表明,MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)多態(tài)性與腦卒中發(fā)生有相關(guān)性,T等位基因攜帶者、雜合 CT 型、突變 TT 型可增加腦卒中風(fēng)險(xiǎn),建議對(duì)上述基因型的患者及早采取預(yù)防措施。