郜會(huì)龍，丁來標(biāo)，王麗霞，楊潔，宮嬌嬌

糖尿病視神經(jīng)病變（diabetes optic neuropathy，DON）是2型糖尿病最常見的并發(fā)癥之一[1]。研究[2]表明，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的炎癥與DON密切相關(guān)。還有研究[3]發(fā)現(xiàn)，活化的Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)2型糖尿病及其炎癥并發(fā)癥的發(fā)生，例如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞因子可通過TLR4激活表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[4]。微小RNA-181（microRNA-181，miR-181）可調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖，在維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮作用[5]。有研究[6]表明，TNF-α抑制劑或miR-181c的表達(dá)上調(diào)可能是一個(gè)潛在的用于治療糖尿病的靶點(diǎn)，以保護(hù)胰島β細(xì)胞團(tuán)，但其與DON的關(guān)系尚無研究報(bào)道。三七皂苷R1（panax notoginseng saponin R1，NGR1）是從三七中提取的一種皂苷，具有治療糖尿病性腦病和改善微循環(huán)障礙等藥理作用[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，NGR1可通過阻斷氧化應(yīng)激和凋亡，在細(xì)胞氧化損傷和神經(jīng)毒性中發(fā)揮保護(hù)作用，且能保護(hù)缺血/再灌注損傷[9]。然而，其對DON的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制仍未見報(bào)道。本文將重點(diǎn)探究NGR1通過miR-181/IL-8/TLR4通路調(diào)控DON及其抗炎機(jī)制，以為臨床治療提供參考。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45只SPF級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體重200～250 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)[SYXK（冀）2020-005]。所有大鼠在恒溫恒濕的環(huán)境飼養(yǎng)，至少適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》執(zhí)行，通過河北以嶺醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：202010201）。

1.2 藥品、試劑與儀器

人胚腎細(xì)胞HEK293T（武漢尚恩生物技術(shù)有限公司，SNL-015），培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，CM-0026），NGR1（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，PCS0838），鏈脲佐菌素（北京酷來搏科技有限公司，CS10491），蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒（上海愛必信生物科技有限公司，abs9217），酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，H052-1），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，4323032），IL-8（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，27095-1-AP）、TLR4（美國CST公司，14358）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（英國Abcam公司，ab8245），山羊抗兔、山羊抗鼠二抗（德國默克公司，12-348、12-349），增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司，ECL-P-100）。光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，KB0801002），全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司，3110）。

1.3 DON模型的建立

37只大鼠適應(yīng)性7 d飼養(yǎng)后，按照50 mg/kg的劑量尾靜脈注射鏈脲佐菌素，后于代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)大鼠，記錄其每日飲水量。篩選鏈脲佐菌素注射后72 h尾靜脈空腹血糖值＞16.7 mmol/L、≥40.0 mL的每日飲水量、尿糖定性+++以上、持續(xù)21 d的糖尿病大鼠進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。大鼠處死后經(jīng)視神經(jīng)的HE染色檢測發(fā)現(xiàn)，最終32只大鼠發(fā)生視覺神經(jīng)病變，成功建立DON模型。

1.4 分組與給藥

將造模成功的32只大鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組（model group，MG）、低劑量NGR1組（lowdose NGR1 group，LNGR1）、中劑量NGR1組（middle-dose NGR1 group，MNGR1）、高劑量NGR1組（high dose-NGR1 group，HNGR1），另將不做任何處理的大鼠設(shè)為對照組（control group，CG），每組8只，共40只。LNGR1、MNGR1、HNGR1組大鼠每2日灌胃1次，劑量分別為15、30、60 mg/kg的NGR1[9-10]，CG、MG組大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)給藥6周。

NGR1藥液配制方法：取NGR1 10 mg，加入1 mL二甲基亞砜充分溶解混勻配制為10 mg/mL濃度的NGR1藥液，在-20 ℃避光保存；實(shí)驗(yàn)時(shí)使用0.9%氯化鈉注射液稀釋使用。

1.5 血糖檢測及體質(zhì)量記錄

給藥期間每7 d大鼠斷尾取血，全自動(dòng)生化分析儀檢測空腹血糖值，并記錄大鼠體質(zhì)量；給藥完成后禁食5 h，再次測血糖值并記錄體質(zhì)量。

1.6 HE染色觀察視神經(jīng)形態(tài)

給藥完成后處死大鼠，立即摘取大鼠一側(cè)眼球以及視神經(jīng)，從球后至視交叉處剪斷神經(jīng)；4 ℃下以4%多聚甲醛固定液固定48 h后，脫水、透明處理、包埋，沿視神經(jīng)縱切面以4 μm厚度切片，在水浴槽中充分展開蠟片，貼于載玻片后烤片。隨機(jī)選取每只大鼠的石蠟切片，按照試劑盒說明書操作進(jìn)行HE染色，并于光學(xué)顯微鏡下拍攝視神經(jīng)形態(tài)，所獲得的圖像分別通過Image-Pro Plus6.0圖像軟件進(jìn)行視神經(jīng)橫斷面積的測量、視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)的測量。

1.7 ELISA檢測大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-9水平

給藥完成后處死大鼠，立即摘取大鼠一側(cè)眼球及視神經(jīng)，從球后至視交叉處剪斷神經(jīng)；建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，取神經(jīng)組織分裝于離心管中，用標(biāo)本稀釋液1∶5稀釋，根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作檢測糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）、IL-1β、IL-6、TNF-α和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）水平，完成后用酶標(biāo)儀在450 nm測定光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為濃度。

1.8 qRT-PCR檢測視神經(jīng)miR-181表達(dá)

分別提取各組視神經(jīng)組織中的總mRNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，以cDNA為模板按照qRT-qPCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)PubMed中大鼠目的基因序列獲得目的基因片段，使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物序列（表1）。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)30 s、40個(gè)循環(huán)95 ℃反應(yīng)10 s，退火溫度60 ℃反應(yīng)30 s。采用2-ΔΔCq法分析基因相對表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參基因，重復(fù)操作檢測3次。

表1 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物信息

1.9 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測miR-181和IL-8靶向關(guān)系

選用轉(zhuǎn)染效率較高的人胚腎細(xì)胞HEK293T用于檢測熒光素酶報(bào)告基因，所有質(zhì)粒構(gòu)建由上海生工生物工程股份有限公司完成。將HEK293T細(xì)胞分為空白對照組、野生型組、突變型組，構(gòu)建野生型及突變型IL-8的3'UTR雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染到對應(yīng)的分組，空白對照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，3組每組內(nèi)設(shè)2個(gè)亞組，分別為Vector亞組和miR-181亞組，Vector亞組轉(zhuǎn)染陰性對照（negative control，NC）的空白質(zhì)粒miR-NC，miR-181亞組轉(zhuǎn)染miR-181模擬物質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后檢測miR-181表達(dá)，雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測各組熒光素酶活性進(jìn)行評(píng)估。

1.10 Western Blot法檢測視神經(jīng)IL-8、TLR4的蛋白表達(dá)

提取各組大鼠視神經(jīng)組織中總蛋白質(zhì)，測定蛋白濃度。依次經(jīng)凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別將兔抗IL-8（稀釋比例1∶500）、TLR4（稀釋比例1∶1,000）一抗以及內(nèi)參蛋白GAPDH（稀釋比例1∶5,000）在4 ℃孵育過夜。次日洗膜后，山羊抗兔和山羊抗小鼠（均稀釋比例1∶5,000）二抗室溫孵育2 h，顯影。用Image J軟件對圖像進(jìn)行分析。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)量/同一樣本內(nèi)參蛋白表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析，本研究相關(guān)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，且符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGR1對DON大鼠血糖和HbA1c的影響

5組間DON大鼠體重、血糖和HbA1c比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F體重=12.789，F(xiàn)血糖=1452.002，F(xiàn)HbA1c=224.032，均P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG大鼠體重較低（t=-3.675，P=0.001），血糖較高（t=67.721，P=0.000），HbA1c水平升高（t=27.213，P=0.000）；與MG組比較，MNGR1、HNGR1組大鼠體重較高（tMNGR1=4.863，tHNGR1=6.018，均P=0.000），血糖較低（tMNGR1=-29.171，tHNGR1=-43.981，均P=0.000），HbA1c水平較低（tMNGR1=-18.468，tHNGR1=-22.799，均P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有劑量依賴性（表2）。

表2 NGR1對DON大鼠體重、血糖和HbA1c的影響（±s，n=8）

表2 NGR1對DON大鼠體重、血糖和HbA1c的影響（±s，n=8）

注：# 與CG組比較，P<0.05；* 與MG組比較，P<0.05；CG 對照組；MG 模型組；LNGR1 低劑量三七皂苷R1組；MNGR1 中劑量三七皂苷R1組；HNGR1 高劑量三七皂苷R1組；NGR1 三七皂苷R1；DON 糖尿病性視神經(jīng)病變；HbA1c 糖化血紅蛋白

HbA1c（%）4.20±0.30 12.43±1.15#8.73±0.52 6.85±0.28*5.54±0.25*224.032 0.000組別CG MG LNGR1 MNGR1 HNGR1 F值P值體重（g）241.23±11.51 218.05±12.43#224.95±13.45 248.72±12.13*256.01±13.45*12.789 0.000血糖（mmol/L）7.10±0.21 18.20±0.40#16.50±0.38 13.42±0.35*10.99±0.26*1452.002 0.000

2.2 NGR1對DON大鼠血清炎癥因子的影響

5組間DON大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-9比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FIL-1β=208.547，F(xiàn)IL-6=145.987，F(xiàn)TNF-α=70.753，F(xiàn)MMP-9=51.711，均P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9表達(dá)較高（tIL-1β=22.949，tIL-6=20.732，tTNF-α=12.785，tMMP-9=12.276，均P=0.000）；與MG組比較，LNGR1、MNGR1、HNGR1組大鼠血清IL-1β水平較低（tLNGR1=-6.465，tMNGR1=-18.598，tHNGR1=-21.943，均P=0.000）、IL-6水平較低（tLNGR1=-3.765，P=0.001；tMNGR1=-13.274，tHNGR1=-15.405，均P=0.000）、TNF-α水平較低（tMNGR1=-9.221，tHNGR1=-10.523，均P=0.000）、MMP-9水平較低（tLNGR1=-2.934，P=0.006；tMNGR1=-4.343，tHNGR1=-9.991，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有劑量依賴性（表3）。

表3 NGR1對DON大鼠血清炎癥因子的影響（±s，n=8）

表3 NGR1對DON大鼠血清炎癥因子的影響（±s，n=8）

注：# 與CG組比較，P<0.05；* 與MG組比較，P<0.05；CG 對照組；MG 模型組；LNGR1 低劑量三七皂苷R1組；MNGR1 中劑量三七皂苷R1組；HNGR1 高劑量三七皂苷R1組；NGR1 三七皂苷R1；DON 糖尿病性視神經(jīng)病變；IL-1β 白細(xì)胞介素-1β；IL-6 白細(xì)胞介素-6；TNF-α 腫瘤壞死因子-α；MMP-9 基質(zhì)金屬蛋白酶9

MMP-9（ng/mL）7.84±1.01 38.48±6.52#31.15±5.20*27.64±6.02*13.54±4.20*51.711 0.000組別CG MG LNGR1 MNGR1 HNGR1 F值P值IL-1β（pg/mL）24.78±7.24 175.15±22.07#132.79±15.72*53.29±5.12*31.37±6.77*208.547 0.000 IL-6（pg/mL）34.58±6.25 256.85±29.39#216.485±25.33*114.55±19.50*91.69±19.35*145.987 0.000 TNF-α（pg/mL）19.61±3.73 153.33±32.16#148.29±24.65 56.89±9.55*43.27±20.99*70.753 0.000

2.3 NGR1對DON大鼠視神經(jīng)形態(tài)的影響

CG組大鼠視神經(jīng)未出現(xiàn)明顯毛細(xì)血管出血、擴(kuò)張以及軸突腫脹，纖維呈細(xì)波紋狀排列，可見膠質(zhì)細(xì)胞散在分布；MG組視神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)呈疏松狀態(tài)且排列紊亂，具有腫脹的軸突，毛細(xì)血管出現(xiàn)明顯出血、擴(kuò)張，有大量增生的膠質(zhì)細(xì)胞且分布密集；LNGR1、MNGR1、HNGR1組大鼠視神經(jīng)排列相對較整齊、具有相對較致密的結(jié)構(gòu)，僅部分軸突具有出血和擴(kuò)張現(xiàn)象，膠質(zhì)細(xì)胞散在分布，且HNGR1組視神經(jīng)狀態(tài)優(yōu)于LNGR1、MNGR1組（圖1）。

圖1 NGR1對大鼠視神經(jīng)形態(tài)的影響（HE染色，×100）

2.4 NGR1對DON大鼠視神經(jīng)橫截面積和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)的影響

5組間DON大鼠視神經(jīng)橫截面積和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F橫截面積=215.281，F(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)=8.291，均P=0.000）。與CG組比較，MG組大鼠視神經(jīng)橫截面積較低（t=-27.680，P=0.000），膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較高（t=5.501，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MG組比較，LNGR1、MNGR1、HNGR1組大鼠視神經(jīng)橫截面積較大（tLNGR1=6.241，tMNGR1=7.853，tHNGR1=10.248，均P=0.000），HNGR1組膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較低（tHNGR1=-3.097，P=0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有劑量依賴性（表4）。

表4 NGR1對DON大鼠視神經(jīng)橫截面積和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=8）

表4 NGR1對DON大鼠視神經(jīng)橫截面積和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=8）

注：# 與CG組比較，P<0.05；* 與MG組比較，P<0.05；CG 對照組；MG 模型組；LNGR1 低劑量三七皂苷R1組；MNGR1 中劑量三七皂苷R1組；HNGR1 高劑量三七皂苷R1組；NGR1 三七皂苷R1；DON 糖尿病性視神經(jīng)病變

膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mm2）74.69±28.23 163.74±38.34#133.16±33.41 135.95±37.07 113.60±21.96*8.291 0.000組別CG MG LNGR1 MNGR1 HNGR1 F值P值橫截面積（×103 μm2）723.76±17.93 464.65±19.71#523.07±13.83*538.16±17.43*560.58±23.41*215.281 0.000

2.5 IL-8與miR-181的靶向關(guān)系驗(yàn)證

熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)顯示，miR-181與IL-8有結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。與Vector亞組比較，野生型組miR-181亞組的IL-8熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.324，P=0.006）；而空白對照組和突變型組的亞組比較（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5）。

圖2 miR-181與IL-8的結(jié)合位點(diǎn)

表5 各組細(xì)胞熒光素酶活性比較（±s，n=3）

表5 各組細(xì)胞熒光素酶活性比較（±s，n=3）

注：* 與Vector亞組比較，P<0.05；miR-181 微小RNA-181

亞組熒光素酶活性Vector亞組miR-181亞組t值P值突變型組1.15±0.10 1.12±0.10 0.367 0.732空白對照組1.00±0.01 0.97±0.02 2.324 0.081野生型組1.01±0.10 0.43±0.16*5.324 0.006

2.6 NGR1對DON大鼠視神經(jīng)miR-181、IL-8、TLR4表達(dá)的影響

5組間DON大鼠視神經(jīng)miR-181、IL-8、TLR4表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FmiR-181=298.723，F(xiàn)IL-8=1524.128，F(xiàn)TLR4=117.251，均P=0.000）。與CG組比較，MG組大鼠視神經(jīng)miR-181、IL-8、TLR4表達(dá)較高（tmiR-181=33.870，tIL-8=62.851，tTLR4=20.802，均P=0.000）；與MG組比較，LNGR1、MNGR1、HNGR1組大鼠視神經(jīng)miR-181表達(dá)較低（tLNGR1=13.476，tMNGR1=14.420，tHNGR1=11.187，均P=0.000）、IL-8表達(dá)較低（tLNGR1=2.460，P=0.019；tMNGR1=19.230，tHNGR1=46.383，均P=0.000）、TLR4表達(dá)較低（tLNGR1=8.350，tMNGR1=14.185，tHNGR1=11.502，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且具有劑量依賴性（圖3、表6）。

圖3 NGR1對DON大鼠視神經(jīng)IL-8、TLR4表達(dá)的影響

表6 NGR1對DON大鼠視神經(jīng)miR-181、IL-8、TLR4表達(dá)的影響（±s，n=8）

表6 NGR1對DON大鼠視神經(jīng)miR-181、IL-8、TLR4表達(dá)的影響（±s，n=8）

注：# 與CG組比較，P<0.05；* 與MG組比較，P<0.05；CG 對照組；MG 模型組；LNGR1 低劑量三七皂苷R1組；MNGR1 中劑量三七皂苷R1組；HNGR1 高劑量三七皂苷R1組；NGR1 三七皂苷R1；DON 糖尿病性視神經(jīng)病變；miR-181 微小RNA-181；IL-8 白細(xì)胞介素-8；TLR4 Toll樣受體4

TLR4 1.08±0.15 3.63±0.36#2.61±0.29 1.89±0.17*2.22±0.18*117.251 0.000組別CG MG LNGR1 MNGR1 HNGR1 F值P值miR-181 1.39±0.12 4.43±0.23#3.22±0.13 3.14±0.15*3.43±0.23*298.723 0.000 IL-8 0.96±0.22 22.02±0.64#21.20±1.19 15.55±0.56*6.48±0.25*1524.128 0.000

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是由高血糖誘發(fā)的視網(wǎng)膜微血管病變，可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)造成DON，導(dǎo)致患者出現(xiàn)神經(jīng)萎縮，甚至失明[10]。因此及早發(fā)現(xiàn)DON，對糖尿病患者的病情監(jiān)測和治療具有重要意義。藥理學(xué)研究[11]表明，NGR1對神經(jīng)系統(tǒng)作用明顯，其對還原和羧甲基化的酪蛋白纖維有明顯抑制作用，也有報(bào)道[12]稱NGR1可減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，30、60 mg/kg NGR1可降低DON大鼠血糖和HbA1c水平，緩解視網(wǎng)膜組織損傷，改善神經(jīng)損傷并降低炎癥水平，可見NGR1對DON可能具有治療作用。

視神經(jīng)對由高糖引起的代謝紊亂以及缺血、缺氧具有較高的敏感性[13]，而DON重要病理組織學(xué)改變即視神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MG組和NGR1各劑量組大鼠視神經(jīng)出現(xiàn)了明顯的出血和血管擴(kuò)張、軸突腫脹以及膠質(zhì)細(xì)胞增生，NGR1各劑量組以上情況較MG組有改善?？紤]可能因長期高糖狀態(tài)而導(dǎo)致血液成分、血管結(jié)構(gòu)、血流動(dòng)力學(xué)異常引起的血管改變，以及體內(nèi)谷氨酸、一氧化氮等異常誘發(fā)體內(nèi)毒性反應(yīng)引起的代謝紊亂。另外，本研究前期通過NGR1處理視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同濃度分組之間比較細(xì)胞活力無明顯差異，而本研究中使用30、60 mg/kg的NGR1干預(yù)的大鼠視神經(jīng)IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9水平顯著降低，說明經(jīng)NGR1干預(yù)后可降低炎癥反應(yīng)，從而減輕高糖誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

有研究[15]表明，血管緊張素水平會(huì)隨著糖尿病嚴(yán)重程度而加劇，而miR-181可直接靶向血管緊張素原并阻斷其翻譯。也有研究[16]發(fā)現(xiàn)，miR-181在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中可能發(fā)揮著重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，miR-181在MG組大鼠視神經(jīng)表達(dá)水平最高，這與上述研究相一致；同時(shí)使用30、60 mg/kg的NGR1干預(yù)DON大鼠后，視神經(jīng)miR-181水平降低，這與前期細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性，進(jìn)一步說明miR-181可能在DON的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，NGR1可降低其表達(dá)水平。

炎癥反應(yīng)可能在神經(jīng)元損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，激活固有免疫受體TLR4可激活炎癥信號(hào)通路，TLR4的激活誘導(dǎo)下游釋放TNF-α等炎癥因子[17]。外周神經(jīng)系統(tǒng)中促炎性細(xì)胞因子如TNF-α的表達(dá)增加，提示糖尿病患者疼痛感覺或神經(jīng)病理狀態(tài)可能加劇[18]。而IL-8的表達(dá)受TNF-α和IL-1的調(diào)節(jié)，在引發(fā)炎癥的條件下，血清IL-8水平會(huì)顯著升高[19]。MMP-9與多種炎癥性疾病相關(guān)[20]，有研究[21]顯示IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α可分別在多種類細(xì)胞中誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)，同時(shí)MMP-9本身也可誘導(dǎo)以上炎癥因子的表達(dá)，從而使炎癥惡性循環(huán)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、IL-8在MG組大鼠視神經(jīng)中表達(dá)最高，15、30、60 mg/kg NGR1干預(yù)后逐漸降低，提示NGR1干預(yù)可降低miR-181、TLR4的表達(dá)，進(jìn)而降低炎癥因子表達(dá)，減輕炎癥損傷，發(fā)揮改善作用。再根據(jù)miR-181與IL-8結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)果，提示miR-181可能通過激活miR-181/IL-8/TLR4通路的來增加細(xì)胞相關(guān)炎癥，而NGR1能抑制miR-181表達(dá)，進(jìn)而降低IL-8/TLR4的表達(dá)，起到緩解神經(jīng)細(xì)胞炎癥的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NGR1可降低GON大鼠血糖，改善視神經(jīng)病理狀況，其機(jī)制可能與調(diào)控視神經(jīng)miR-181/IL-8/TLR4通路及相關(guān)炎癥有關(guān)，可為DON的治療和發(fā)病機(jī)制的研究提供參考。