孫莉，周玉，余義，唐艷榮*

1.黃鶴樓酒業(yè)有限公司（武漢 430050）；2.湖北信嘉檢測科技有限公司（咸寧 437000）

白酒是我國的傳統(tǒng)蒸餾酒，按其風味特征可分為各種不同的香型，且每種香型的白酒都有其特有的典型風格，但不論何種香型的白酒，保持其適度的甜感，不僅可以降低其他一些苦澀雜味對酒感的影響，而且更能體現(xiàn)酒體的綿甜、爽凈、醇厚，但是這種甜味是來自于自然發(fā)酵產(chǎn)生的，而非添加甜味劑[1-5]。

人工合成甜味劑可能對人體有致癌、致病的副作用[6]，因而已被許多國家限制使用。尤其在白酒行業(yè)，GB 2760—2014中規(guī)定白酒中甜味劑不得檢出。目前，關于甜味劑的檢測方法主要有液相色譜-質譜聯(lián)用法[7-8]、高效液相色譜法[9-10]、高效液相色譜蒸發(fā)散射法[11]、高效毛細管電泳-間接紫外法[12]、核殼型色譜柱-反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法[13]、紫外衍生-高效液相色譜法[14]。

氨基甲酸乙酯是一種廣泛存在于白酒飲料中的2A類致癌物質，對人體健康存在潛在危害性?；浦械陌被姿嵋阴ズ侩S貯藏時間的延長有不同程度的升高，絕對增長幅度排序依次為酒頭＞中間段基酒＞酒尾[6]。

該方法針對酒類中的7種甜味劑和氨基甲酸乙酯進行同時檢測，保證甜味劑風險的同時，同步對酒中氨基甲酸乙酯含量進行監(jiān)測，有利于后期勾調儲存成品時對氨基甲酸乙酯含量進行管控處理，為保證酒類中食品安全作出貢獻[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純，美國Baker公司）；乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（色譜純，阿拉丁有限公司）；水（超純水，德國默克密理博MiLLi-QDireat）；甜蜜素、安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、阿力甜、氨基甲酸乙酯標準物質（純度≥99%，上海安譜有限公司）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260LC-Agilent 6470安捷倫三重串聯(lián)四極桿質譜儀；Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18安捷倫色譜柱（2.1×150 mm，1.8 μm）；超聲波清洗池：KQ-250E型（昆山市超聲儀器有限公司）；有機濾膜（孔徑0.22 μm，天津津騰有限公司）；全玻璃微孔過濾器（規(guī)格1 000 mL，天津津騰）；天平[感量為0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；0.22 μm水相微孔過濾膜（天津津騰有限公司）；液氮（純度≥99.995%）；高純氮氣（純度≥99.995%）；氮氣發(fā)生器（德國PEAK）。

1.3 方法原理

首先在市面上購買三大香型濃香型、清香型和醬香型白酒進行感官分析，目前市面上的蒸餾酒基本上都是澄清透明的樣品，采用加熱超聲的方式除醇，取上清液過0.22 μm濾膜上機檢測。處理后的樣品進入液相色譜進行分離，以保留時間進行定性分析，再經(jīng)質譜檢測器進行定量分析，該方法均采用外標法對樣品進行含量測定。

1.4 試驗方法

1.4.1 流動相的配制

流動相A（0.1%乙酸溶液）：準確移取1 mL乙酸（分析純）加入一級水并定容至1 000 mL，經(jīng)過0.22 μm水相濾膜抽濾，超聲混勻除去CO2，超聲時間不宜過長，避免流動相基質變化，影響色譜峰分離效果。

流動相B（甲醇）：色譜純，為避免抽濾過程中溶入其他雜質，只需超聲除去CO2即可。

1.4.2 7種甜味劑和氨基甲酸乙酯標準儲備溶液（1 000 mg/L）配制

準確稱取各標準品0.1 g于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，配制的母液質量濃度為1 000 mg/L（即100 ppm），該溶液在0～4 ℃冰箱保存。

1.4.3 7種甜味劑混合標準中間溶液（10 mg/L）配制

分別準確移取7種甜味劑標準儲備溶液各1 mL于100 mL容量瓶中，用一級水搖勻并定容至刻度，將該溶液于0～4 ℃冰箱冷藏保存。

氨基甲酸乙酯標準中間溶液（100 mg/L）：準確移取氨基甲酸乙酯標準儲備溶液各10 mL于100 mL容量瓶中，用一級水搖勻并定容至刻度，將該溶液于0～4 ℃冰箱冷藏保存。

1.4.4 7種甜味劑和氨基甲酸乙酯標準混合系列工作溶液配制

分別準確吸取0.05，0.10，0.20，0.30，0.40和0.50 mL 7種甜味劑混合標準中間溶液，0.02，0.04，0.08，0.16，0.40和0.60 mL氨基甲酸乙酯標準中間溶液，用水混勻并定容至100 mL，配制成7種甜味劑質量濃度分別為0.005，0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/L，以及氨基甲酸乙酯質量濃度為0.02，0.04，0.08，0.16，0.40和0.60 mg/L的標準混合系列工作溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.5 樣品制備

取適量酒樣放入超聲池中進行加熱超聲除醇后，過0.22 μm有機濾膜后上機測定。

1.4.6 儀器參數(shù)設置

1.4.6.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus-C18（1.8 μm 2.1 mm×150 mm）。

流動相：A-0.1%乙酸：B-甲醇梯度洗脫，見表1。

表1 梯度洗脫程序表

柱溫箱：40 ℃。

流速：0.15 mL/min。進樣量：2 μL。

1.4.6.2 質譜條件

電離方式：正、負離子（ESI+、ESI-）模式電離；干燥氣體溫度：325 ℃；干燥氣體流速：8 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；電子倍增電壓：正模式200 V，負模式200 V；噴嘴電壓：正模式300 V，負模式500 V；電噴霧電壓：正模式為3 500 V，負模式為3 000 V；毛細管：帶有鉑鎳涂層的導電毛細管；監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測（MRM）模式檢測。8種目標物質離子選擇參數(shù)見表2。

表2 8種目標物質離子選擇參數(shù)表

2 結果與分析

2.1 色譜條件和質譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

通過對8種食品安全風險物質的物理和化學信息進行分析，分別以0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈作為流動相對樣品進行色譜峰分離。通過試驗發(fā)現(xiàn)色譜級的甲酸和分析純的乙酸搭配有機相，色譜峰分離效果差異不大；且分析純的乙酸相較于色譜級的甲酸價格便宜很多，由于后期梯度洗脫水相的使用量非常大，出于經(jīng)濟方面考慮建議實驗室選用分析純的乙酸稀釋后作為水相流動相。同樣作為有機相的甲醇和乙腈，兩者適用范圍基本差不多，甲醇作為有機相進行洗脫基本不會引入新的雜質，而乙腈在長時間的使用過程中容易與樣品中的部分物質反應，生成易堵塞色譜柱的絡合物；出于對色譜柱的長效性使用方面考慮，建議使用甲醇為有機相進行梯度洗脫。故方法最終選用0.1%乙酸-甲醇為流動相進行洗脫。見圖1。

圖1 8種目標物質混合標準溶液的總離子流色譜圖

8種目標物質的出峰時間依次為：1）6.037 min，安賽蜜；2）6.813 min，氨基甲酸乙酯；3）7.467 min，糖精鈉；4）8.598 min，甜蜜素；5）8.932 min，三氯蔗糖；6）9.030 min，阿斯巴甜；7）9.656 min，阿力甜；8）10.782 min，紐甜。

2.1.2 質譜條件的優(yōu)化

將液相部分色譜柱換為兩通連接，采取直接進樣的方式，將配制的單標純品目標物標準溶液注入質譜，分別進行正、負離子模式，在Scan狀態(tài)下進行全掃描檢測，得到TIC總離子流圖，根據(jù)總離子流圖標記出特征離子峰，即得到一級質譜圖和準分子離子峰，再進行SIM模式掃描，將標記出的準分子離子峰進行單獨掃描，得到EIC提取離子流圖；再用碰撞氣惰性氣體高純氮氣攻擊該前體離子，獲得其二級質譜圖及相應的子離子。由于該方法是同時分析8種目標物質，且各物質間質荷比差異較大，所以該方法中既有正離子模式也有負離子模式的存在，但兩種模式同時存在則對電離毛細管的要求較高，需使用帶有鉑鎳涂層的導電毛細管，才能在短時間內完成正負模式的快速切換。利用多反應監(jiān)測模式（MRM）對選定的定性離子和定量離子對裂解電壓、毛細管電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質譜參數(shù)進行優(yōu)化，使各監(jiān)測離子豐度和信號達到最佳。

通過設置Precursor Ion模式對母離子進行確認，再通過設置Product Ion模式下，利用碰撞池電壓對母離子進行轟擊，得到相應的子離子碎片，選擇其中離子豐度高的離子作為子離子，且每種化合物的質譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應包括一個母離子和兩個子離子，該方法通過設置均能確定8種目標物質的母離子和兩個子離子。

經(jīng)過以上質譜條件設置，最終確定該方法采用正、負離子模式采集，該模式下的質譜分析參數(shù)見表2。

2.2 線性范圍

該方法線性范圍的確定主要是通過不同類型和不同階段的酒類樣品進行測檢測分析，從剛蒸餾出來的基酒，到存放一定時長的老酒，再到勾調研制的小樣，最后到批量勾調的大樣，直至最后的包裝成品，以及市面上購買一些不同類別和香型的成品酒，均對以上酒類樣品進行8種目標物質的檢測分析。目前市面上的酒類產(chǎn)品甜味劑的檢出都很低，基本上都是未檢出；氨基甲酸乙酯主要是針對蒸餾酒在蒸餾過程中生成的，所以一般基酒中氨基甲酸乙酯含量較高，而成品酒經(jīng)過長時間的存放，氨基甲酸乙酯含量逐漸降低。針對以上酒類產(chǎn)品中8種目標物質的結果分析，最終確立了以下相關標準曲線濃度范圍。見表3。

表3 8種目標物質標準曲線線性相關系數(shù)

結果表明，甜蜜素等八種目標物質的相關系數(shù)（R2）范圍均大于0.99，符合相關標準要求。

2.3 檢出限和定量限

參考GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》中5.4小節(jié)檢出限和定量限的評定，方法規(guī)定，采用信噪比法評估檢出限和定量限，檢出限可接受的信噪比為大于等于3∶1，定量限可接受的信噪比為大于等于10∶1。為保證方法的實用性，該方法選擇將8種目標物質分別加入酒基中（蒸餾酒、清香型白酒或食用酒精），模擬8種目標物質在酒基中的狀態(tài)，選擇食用酒精為基質，然后在食用酒精樣品中添加8種目標物質的標準儲備液，進行方法檢出限和定量限的探底試驗。在保證信噪比滿足相關標準使用要求的前提下，也要保證峰形的完整，且峰形無異常，通過對方法的優(yōu)化確?；|對方法檢測結果影響最小。分別對各目標化合物線性范圍的最低濃度點進行信噪比分析，結果見圖2和圖3。

圖2 8種目標物質混合標準溶液檢出限信噪比圖

圖3 8種目標物質混合標準溶液定量限信噪比圖

結果表明：在質量分數(shù)為0.005 mg/kg時，信噪比大于3；質量分數(shù)為0.010 mg/kg，信噪比大于10；滿足白酒中分析方法要求。

2.4 精密度

2.4.1 方法重復性

配制3份不同濃度的樣品溶液，按照給定分析方法的全過程進行處理和測定，記錄6個平行樣的測定結果，統(tǒng)計其相對標準偏差，見表4。

表4 8種目標物質在酒類中的檢測精密度

由數(shù)據(jù)可知，低中高三種濃度，樣品檢測結果相對標準偏差在0.4%～9.4%之間，均小于10%，滿足相關標準要求。

2.5 回收率

在市面上購置一種有代表性香型的白酒，濃香型白酒是介于醬香型白酒和清香型白酒之間，從呈香呈味物質方面考慮，濃香型白酒的各項指標均居兩者中間，故選取濃香型白酒作為加標基體。向濃香型白酒中加入7種甜味劑標準曲線最高點的0.2，0.5和0.9倍濃度的標準品，氨基甲酸乙酯加標考慮到酒類從釀造到生產(chǎn)包裝整個過程中氨基甲酸乙酯的數(shù)值變化，選加標質量濃度300，400和500 μg/L，將加標后的樣品進行前處理后上機檢測，試驗結果見表5。

表5 8種目標物質在酒類中的加標回收率

由數(shù)據(jù)可知，安賽蜜、氨基甲酸乙酯、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜低中高三種加標回收率均在80%～120%之間，符合相關標準要求。

3 結論

此次研究建立了液相色譜-質譜串聯(lián)技術檢測方法，使用AJS ESI離子源同時測定酒類中7種甜味劑和氨基甲酸乙酯含量的方法，并對該方法進行了優(yōu)化處理。從基體干擾、檢測范圍、數(shù)值變化等多方面保證方法對于酒類結果檢測的準確性和適用性，最大限度地降低基質效應對于檢測結果的影響，防止超線性范圍檢測的情況出現(xiàn)。為驗證方法的實用性，參考相關方法驗證學標準，從多角度、多維度對該方法進行方法學驗證，保證方法的完整性和全面性。該方法前處理在保證不影響含量的前提條件下簡單易操作，有效去除乙醇基體影響基線的問題，檢測靈敏度高，適合對酒類中7種甜味劑和氨基甲酸乙酯進行大批量定性篩查和定量分析，為食品安全監(jiān)測提供技術支持。