劉爽，劉愛青,2，王佳，閆征

1.北京盛美諾生物技術有限公司（北京 100062）；2.安徽盛美諾生物技術有限公司（淮北 235000）

膠原蛋白是動物結締組織的重要組成成分，占動物總蛋白含量的25%～30%，據(jù)不完全統(tǒng)計，人體內(nèi)含有20余種膠原蛋白[1]。膠原蛋白肽作為一種功能性食品原料，在全球范圍內(nèi)得到廣泛應用[2]，其是以動物的皮、骨為原料通過酶解技術制備的小分子物質。隨著人們對膠原蛋白肽市場的認知深度增加，特殊的肽段也越來越受市場關注，尤其是膠原三肽。膠原三肽是由大分子膠原經(jīng)過酶解得到的由3個氨基酸組成的小肽。膠原三肽的氨基酸組成為Gly-X-Y，其中X的位置通常是脯氨酸（Pro），Y通常為羥脯氨酸（Hyp）和羥賴氨酸（Hyl），后兩種氨基酸在其他蛋白質中很少見[3]。理論上膠原蛋白含有至少400個三肽序列，含量超過1%的僅24種，其中Gly-Pro-Hyp含量最為豐富[3]。

在功效方面，膠原三肽對皮膚的生長、修復具有重要的促進作用[4-6]，以及具有抗氧化作用[7]等。Choi等[8-9]報道膠原三肽可提高人體皮膚的彈性和含水量；成靜等[10]報道膠原三肽可抑制黑色素的形成；Hee-Bong等[11]報道膠原三肽可抑制光老化引起的皺紋的形成，證明膠原三肽具有作為抗光老化劑的潛力。光損傷也是較受關注的皮膚問題，其表現(xiàn)為皮膚暴露部位粗糙、皺紋加深加粗、不規(guī)則性色素沉著、真皮彈性纖維變性及降解產(chǎn)物蓄積等，紫外線的照射會使皮膚成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成減少，導致細胞的氧化損傷[12]。人皮膚成纖維細胞是皮膚真皮層中主要細胞，不僅能促進表皮細胞的遷移、增殖和分化，還能分泌大量的膠原蛋白、彈性蛋白以及多種細胞修復因子，從而修復老化皮膚[13-14]。關于膠原蛋白肽對皮膚光老化的修復報道較多[15-16]，但膠原三肽在該方面的研究較少，試驗主要研究膠原三肽對光損傷皮膚細胞的修復作用，并對比普通膠原蛋白肽對皮膚成纖維細胞的修復差異，以及不同工藝產(chǎn)品的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑及耗材

DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技）；DMEM/F-12培養(yǎng)架（賽默飛世爾科技）；0.25%胰酶（賽默飛世爾科技）；青鏈霉素混合液（賽默飛世爾科技）；磷酸鹽緩沖液（賽默飛世爾科技）；胎牛血清（賽默飛世爾科技）；蛋白酶抑制劑（上海羅氏制藥有限公司）；細胞培養(yǎng)板（康寧公司）；細胞培養(yǎng)皿（康寧公司）；Anti-MMP1抗體[EP1247Y]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Anti-MMP13抗體[EP1263Y]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Anti-Collagen I抗體[EPR7785]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Anti-COL3A1（E8D7R），Cell Signaling Technology；Anti-Elastin抗體[EPR20603]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Anti-GAPDH抗體[EPR16891]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Goat anti Mouse antibody（北京康為生物科技有限公司）；Goat anti Rabbit antibody（北京康為生物科技有限公司）；NC膜（0.45 μm孔徑Millipore，默克生物）；ECL Millipore（默克生物）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；牛血清白蛋白Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；丙烯酰胺Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；過硫酸銨Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；吐溫-20 Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；N, N,N′, N′-四甲基乙二胺（賽默飛世爾科技）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物）；羥脯氨酸檢測試劑盒，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；透明質酸檢測試劑盒（R & D Systems）；細胞凋亡檢測試劑盒（BD Biosciences）。

1.1.2 主要試驗與儀器

低溫冷凍離心機（賽默飛世爾科技）；電泳槽，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；電泳儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；酶標儀（賽默飛世爾科技）；濕轉電泳槽，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；水平脫色搖床（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技）；UV輻照系統(tǒng)（法國VILBER LOURMAT公司）；倒置顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)）；流式細胞儀CytoFlex（貝克曼庫爾特生命科學事業(yè)部）。

1.2 細胞生物學相關試驗方法及步驟

1.2.1 人皮膚成纖維細胞（Human skin fibroblast，HSF）常規(guī)培養(yǎng)

將HSF細胞在10 cm皿中培養(yǎng)，待細胞密度至80%融合度時吸棄上清液，加入2 mL 0.25%胰酶消化細胞；消化完成后加入等體積完全培養(yǎng)基（10% FBS的DMEM+雙抗）中和胰酶，將細胞轉移至15 mL離心管中，按1 500 r/min室溫離心5 min；棄上清液后加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)基重懸細胞，吸取200 μL加入新10 cm培養(yǎng)皿中；加入10 mL新鮮完全培養(yǎng)基，將細胞于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞密度至80%時再次進行傳代或鋪板。

1.2.2 多肽處理建模

將1#膠原三肽（市購，平均分子量約800 Da）、2#膠原三肽（市購，平均分子量約500 Da）、1#膠原蛋白肽（市購，平均分子量約2 000 Da）、2#膠原蛋白肽（市購，平均分子量約2 000 Da）分別稀釋至10，50，100，500和1 000 mg/L不同的質量濃度；將處于對數(shù)生長期的HSF細胞使用0.25%胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細胞匯合率為80%～90%；將肽按照5個不同濃度加入細胞上清液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)；在加入肽處理后第1～第5天分別收集細胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；測定450 nm波長處吸光度，并根據(jù)吸光度計算細胞增殖曲線。

1.2.3 UVB處理建模

將處于對數(shù)生長期的HSF細胞使用胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細胞匯合率為80%～90%；在100和200 mJ/cm2的UVB照射下處理細胞；在UVB后第1～第5天分別收集細胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；測定450 nm波長處吸光度，并根據(jù)吸光度計算細胞增殖曲線。

1.2.4 CCK8評估UBV處理條件下不同多肽就細胞增殖的影響

將處于對數(shù)生長期的HSF細胞使用胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細胞匯合率為80%～90%；將4種肽按照50，100和500 mg/L加入細胞上清液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

在200 mJ/cm2的UVB照射下處理細胞；在加入多肽處理后第1～第5天分別收集細胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；測定450 nm波長處吸光度，并根據(jù)吸光度計算細胞增殖曲線。

1.2.5 細胞凋亡檢測

將處于對數(shù)生長期的HSF細胞使用胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細胞匯合率為80%～90%；將4種肽按照50，100和500 mg/L加入細胞上清液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6 h；在200 mJ/cm2的UVB照射下處理細胞；處理完成后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用胰酶消化細胞，按1 500 r/min室溫離心5 min，收集細胞；使用預冷PBS重懸細胞2次，按1 500 r/min離心5 min洗滌細胞；每管加入300 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞；每管加入5 μL Annexin V-FITC，混勻細胞，室溫避光染色20 min；每管加入5 μL PI，室溫避光染色5 min；每管補加200 μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻后流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

將處于對數(shù)生長期的HSF細胞使用胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細胞匯合率為80%～90%；將4種肽按照50，100和500 mg/L加入細胞上清液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)18 h；在200 mJ/cm2的UVB照射下處理細胞；處理完成后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集不同處理組細胞上清液培養(yǎng)基；將上清液在4 ℃條件下按1 500 r/min離心10 min，將上清液轉移至新的離心管中；使用ELISA試劑盒檢測透明質酸和羥脯氨酸含量。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3 Western Blotting檢測HSF細胞中蛋白表達

1.3.1 蛋白提取

將不同處理組和對照HSF細胞使用胰酶消化后收集。棄上清液后在細胞沉淀中加入500 μL細胞裂解液，反復吹懸細胞沉淀后冰上放置30 min，按12 000 r/min離心15 min。離心完成后取上清液作為待測樣品。

1.3.2 BCA蛋白定量和樣品制備

將待測樣本溶于稀釋緩沖溶液中，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量。定量完成后使用蛋白裂解液調(diào)整蛋白濃度，加入5×還原樣品緩沖液，將樣品終質量濃度定為1 mg/mL。將加入緩沖液的樣品煮沸10 min進行蛋白變性，煮沸后的樣品在4 ℃以10 000 r/min離心30 s后備用。

1.3.3 蛋白表達量檢測

根據(jù)目的蛋白分子量，配制10%或12%分離膠及5%濃縮膠；將待檢測蛋白樣品加入上樣孔，每孔上樣量約20 μg；上樣完成后進行電泳，濃縮膠恒壓90 V電泳約20 min。分離膠恒壓160 V電泳約90 min，通過預染蛋白Marker和Loading buffer上樣緩沖液停止電泳；電泳完成后進行轉模，在300 mA恒流冰浴轉膜1 h；轉膜完成后5% BSA室溫輕搖45 min進行封閉減少非特異雜交；使用1% BSA-TBST稀釋一抗，具體一抗稀釋度見抗體說明書進行優(yōu)化。加入一抗后在4℃孵育過夜；一抗孵育完成后使用TBST洗膜6次，快洗3次后慢洗3次，每次3 min；使用1% BSA-TBST稀釋二抗，二抗稀釋度1∶10 000，加入二抗后室溫輕搖60 min；一抗孵育完成后使用TBST洗膜6次，快洗3次后慢洗3次，每次3 min；二抗孵育完成后將ECL發(fā)光液加到膜上，室溫反應3 min。使用膠片曝光10 s～3 min，顯影2 min后進行定影。

2 結果及分析

2.1 CCK-8評估膠原肽對UVB處理條件細胞增殖和活力的影響

從圖1可以看出，與UVB處理組相比，膠原三肽組、膠原蛋白肽組均可促進光輻照后的細胞增殖，且呈一定劑量相關性，其中2#膠原三肽的效果最好，之后依次為1#膠原三肽、2#膠原蛋白肽、1#膠原蛋白肽。2#膠原三肽試驗第5天細胞水平可與達到未處理組一致，與UVB組差異極顯著（P＜0.001）。

圖1 膠原肽對UVB處理后細胞增殖和活力的影響

2.2 流式細胞術評估膠原肽對UVB處理條件下細胞凋亡比例

從圖2可以看出，UVB處理后細胞凋亡數(shù)量顯著增加。膠原三肽組、膠原蛋白肽組均減低細胞凋亡數(shù)量，且呈一定劑量相關性，其中2#膠原三肽的效果最好，之后依次為1#膠原三肽、2#膠原蛋白肽、1#膠原蛋白肽。

圖2 流式細胞術評估膠原肽對UVB處理條件下細胞凋亡比例

2.3 膠原肽對UVB處理條件下透明質酸含量的影響

從圖3可以看出，膠原三肽組、膠原蛋白肽組均可促進光輻照損傷成纖維細胞生成透明質酸，且呈一定劑量相關性，其中2#膠原三肽的效果最好，與UVB處理組相比差異顯著（P＜0.01）。

2.4 膠原肽對UVB處理條件下羥脯氨酸含量的影響

從圖4可以看出，膠原三肽組、膠原蛋白肽組均可促進光輻照損傷成纖維細胞生成羥脯氨酸，且呈一定的劑量相關性，效果最好的為2#膠原三肽，其次依次為1#膠原三肽、2#膠原蛋白肽、1#膠原蛋白肽。

圖4 ELISA評估膠原肽對UVB處理條件下羥脯氨酸含量的影響

圖5 Western blot檢測膠原三肽對UVB處理條件下蛋白表達的影響

圖6 Western blot檢測膠原蛋白肽對UVB處理條件下蛋白表達的影響

2.5 Western blot檢測膠原肽對UVB處理條件下蛋白表達的影響

Western Blot檢測蛋白表達發(fā)現(xiàn)膠，原蛋白肽、膠原三肽均有降低MMP-1、MMP-13及提高COL1a1、COL1a2、原彈性蛋白mRNA的趨勢。其中，MMP-1和MMP-13是降解動物體內(nèi)膠原蛋白的酶，降低其活性，即可減少人體膠原蛋白的流失[17]。

3 結論與討論

試驗通過UVB處理建模，對比不同膠原肽對人皮膚成纖維細胞的保護作用。細胞增殖和細胞凋亡結果顯示，膠原三肽及膠原蛋白肽對UVB處理后的人皮膚成纖維細胞均具有一定的修復作用，且呈一定劑量相關性，其中效果顯著的依次性為2#膠原三肽＞1#膠原三肽＞2#膠原蛋白肽＞1#膠原蛋白肽。ELISA檢測透明質酸和羥脯氨酸的含量顯示，膠原三肽、膠原蛋白肽均可以修復UVB損傷后人皮膚成纖維細胞生成細胞外基質的能力，且呈一定劑量相關性，其中效果顯著的依次性為2#膠原三肽＞1#膠原三肽＞2#膠原蛋白肽＞1#膠原蛋白肽。Western Blot檢測蛋白表達發(fā)現(xiàn)，膠原三肽、膠原蛋白肽均有降低MMP-1、MMP-13以及提高COL1a1、COL1a2、原彈性蛋白mRNA的趨勢。結果說明，膠原肽對光老化人皮膚成纖維細胞具有一定修復作用，其中膠原三肽的效果優(yōu)于普通的膠原蛋白肽。

從分子量角度看，試驗組膠原三肽組的平均分子量均小于膠原蛋白肽組平均分子量，這可能是影響其發(fā)揮修復作用的原因之一，張寧等[18]研究不同分子量的膠原蛋白肽在動物體內(nèi)吸收過程，其證明分子量越小，吸收速率越快。從結構來看，膠原三肽組的三肽含量高于膠原蛋白肽組，三肽透皮吸收性較強，研究表明三肽可促使成纖維細胞的增殖活性，修復受損組織，即可高效率地促進皮膚透明質酸及膠原蛋白的生成，以實現(xiàn)抗皺、保濕、抗老化、修復等功效[19-21]，Kim[22]利用無毛小鼠驗證膠原三肽具有抗光老化的作用。

對膠原三肽的功效近兩年已有多項研究報道，如：Han等[23]研究了膠原三肽對UVB下光老化損傷的抑制作用；Saito-Takatsuji等[24]研究了膠原三肽對細胞的保護作用；金載桓等[25]將其應用于食品或化妝品中，來改善免疫力和皮膚狀態(tài)。膠原三肽在功能性食品中領域也有了越來越多的應用案例，其市場售價高于普通膠原蛋白肽，但是關于該成分的機理研究還較少，與普通膠原蛋白肽的功效對比研究也較少，所以為將其更好、更精確地應用到功能性食品中，可以考慮多針對其機理及具體肽段對機體的具體作用進行更深刻的探討研究，包括皮膚、骨骼、關節(jié)等方面的應用研究，為市場新品的開發(fā)提供更完善的理論依據(jù)。