張宏強(qiáng)，李春桃*

錦州醫(yī)科大學(xué)（錦州 121001）

槲皮素（Quercetin）屬于黃酮醇類化合物，難溶于水，易溶于堿性溶液。槲皮素大量存在于植物的果實(shí)、莖、葉中，具有多種生物活性[1]。藍(lán)莓葉在《本草綱目》已有記載：“其味苦平，無(wú)毒，益精氣，強(qiáng)筋骨，止瀉除睡，久服長(zhǎng)生不饑，變白卻老?！彼{(lán)莓葉已列入中國(guó)藥典，可以作為普通食品的原料[2]。此次試驗(yàn)以藍(lán)莓葉為原料提取槲皮素，采用超聲波乙醇提取槲皮素，通過(guò)響應(yīng)面法，探索其最佳提取條件，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

藍(lán)莓葉（湖北牧童藍(lán)莓科技有限公司）；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司）；無(wú)水乙醇、甲醇、磷酸、高硫酸鉀（西隴化工股份有限公司）；DM101大孔樹(shù)脂（北京索萊寶科技有限公司）；DPPH試劑（合肥千盛生物科技有限公司）；氯化鐵（天津百倫斯生物技術(shù)有限公司）；鄰苯三酚（天津市永晟精細(xì)化工有限公司）；ABTS溶液（上海尚寶生物科技有限公司）；醋酸銨、硫酸亞鐵（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-15C高效液相色譜儀（島津儀器蘇州有限公司）；KH-500V超聲波發(fā)生器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；FA2004B電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；SHB-B95A循環(huán)水式多用真空泵（陜西太康生物科技有限公司）；DHG-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DK-98-11A恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；UV752紫外分光光度計(jì)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；XD-52AA數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲輔助提取藍(lán)莓葉槲皮素工藝

將藍(lán)莓葉用高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)0.125 mm（120目）篩[3]。稱取3.0 g藍(lán)莓葉粉末于錐形瓶中，將錐形瓶放置于超聲波發(fā)生器中，加入一定量體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，超聲提取時(shí)間30 min后，真空抽濾[4]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 料液比對(duì)藍(lán)莓葉槲皮素提取的影響

稱取3.0 g經(jīng)干燥、粉碎后的藍(lán)莓葉放入錐形瓶中，在超聲波溫度50 ℃、超聲功率500 W下提取，以藍(lán)莓葉槲皮素提取量為指標(biāo)，對(duì)料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）進(jìn)行單因素分析[5]。

1.3.2.2 超聲溫度對(duì)藍(lán)莓葉槲皮素提取的影響

稱取3.0 g經(jīng)干燥、粉碎后的藍(lán)莓葉放入錐形瓶中，在料液比1∶15（g/mL）、超聲功率500 W下提取，以藍(lán)莓葉槲皮素提取量為指標(biāo)，對(duì)超聲溫度40，50，60，70和80 ℃進(jìn)行單因素分析[6]。

1.3.2.3 超聲功率對(duì)藍(lán)莓葉槲皮素提取的影響

稱取3.0 g經(jīng)干燥、粉碎后的藍(lán)莓葉放入錐形瓶中，在料液比1∶15（g/mL）、超聲溫度50 ℃下提取，以藍(lán)莓葉槲皮素提取量為指標(biāo)，對(duì)超聲功率300，400，500，600和700 W進(jìn)行單因素分析[7]。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

采用 Box-Behnken組合設(shè)計(jì)，對(duì)藍(lán)莓葉槲皮素提取條件進(jìn)行優(yōu)化，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.3.4 藍(lán)莓葉槲皮素含量測(cè)定

1.3.4.1 色譜條件的選擇

采用C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：45%甲醇；流動(dòng)相B：55%磷酸水溶液（1%）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm[8]。

1.3.4.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取0.63 mg槲皮素對(duì)照品，置于50 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，加適量50%甲醇，充分搖勻使其溶解，并用甲醇定容至刻度，將其作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確量取1 mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，定容至20 mL容量瓶，制得6.3 μg/mL槲皮素對(duì)照品溶液[9]。

1.3.4.3 供試品溶液制備

取0.85 g槲皮素粉末，加50 mL甲醇，放入超聲波發(fā)生器中充分?jǐn)嚢?0 min，充分溶解后，用超純水稀釋到一定比例。取上清液以0.45 μm濾膜過(guò)濾，取濾液為供試品溶液[10]。

1.3.4.4 線性關(guān)系

精密吸取5份對(duì)照品溶液，每份吸取2 mL放入安培瓶中，按照上述色譜條件測(cè)定槲皮素的含量[11]。以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線。計(jì)算得回歸方程Y槲皮素=318.28X+286.87，相關(guān)系數(shù)R=0.998 7，確定系數(shù)R2=0.999 3。結(jié)果表明，槲皮素溶液在0.717～49.690 μg/mL之間存在良好的線性關(guān)系。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測(cè)定

避光條件下，取2 mL藍(lán)莓葉槲皮素溶液，加入1 mL DPPH-乙醇溶液，混勻后，靜置30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以VC、蘆丁為陽(yáng)性對(duì)照，做3次平行試驗(yàn)[12-13]。按式（1）計(jì)算藍(lán)莓葉槲皮素DPPH·的清除率。

式中：A0為未加樣品的吸光度；Ai為加樣品后的吸光度；Aj為樣品本身的吸光度。

1.3.6 超氧陰離子自由基清除率能力

取5 mL pH 8.0濃度0.1 mmol/L碳酸鈉于試管中，加入1.0 mL藍(lán)莓葉槲皮素溶液和0.4 mL濃度30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后反應(yīng)6 min，在328 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以VC、蘆丁為陽(yáng)性對(duì)照，做3次平行試驗(yàn)[14-15]。按式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A0為未加樣品的吸光度；Ai為加樣品后的吸光度；Aj為樣品本身的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比的影響結(jié)果

根據(jù)圖1顯示，提取量開(kāi)始隨著料液比的變化，曲線呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，在比例達(dá)到1∶15（g/mL）時(shí)圖像出現(xiàn)最高峰。隨著乙醇添加比例的繼續(xù)增大，溶液已飽和，提取量逐漸下降。料液比為1∶15（g/mL），提取量最高。

圖1 料液比的影響結(jié)果

2.1.2 超聲溫度的影響結(jié)果

由圖2可知，隨著超聲溫度的不斷升高，藍(lán)莓葉槲皮素提取量不斷增大。當(dāng)提取溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，藍(lán)莓葉槲皮素提取量達(dá)到最大；若繼續(xù)升高溫度，曲線呈現(xiàn)下降狀態(tài)，這可能是因?yàn)殚纹に仉S著溫度的升高表現(xiàn)出不穩(wěn)定狀態(tài)，因其分子結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致提取量的減少。因此確定最佳超聲溫度為50 ℃。

圖2 超聲溫度的影響結(jié)果

2.1.3 超聲功率對(duì)提取量的影響

由圖3所示，曲線的趨勢(shì)表現(xiàn)為先上升，達(dá)到最高點(diǎn)后下降。當(dāng)超聲功率小于500 W時(shí)，提取量逐漸增大；最大提取量在超聲功率達(dá)到500 W時(shí)出現(xiàn)；超聲功率大于500 W時(shí)，提取量隨著超聲功率的增大開(kāi)始減小。提取量總體呈現(xiàn)先上升后下降的變化。因此確定最佳超聲功率為500 W。

圖3 超聲功率的影響結(jié)果

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，超聲波輔助提取藍(lán)莓葉槲皮素以75%乙醇為溶劑，最佳料液比1∶15（g/mL）、超聲溫度50 ℃和超聲功率500 W，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)化藍(lán)莓葉槲皮素提取條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，分析試驗(yàn)結(jié)果得回歸方程：Y=8.44-0.43A+0.38B+0.48C-0.21AB+0.16AC-0.45BC-1.29A2-0.14B2-0.65C2。

由表3槲皮素提取量回歸方程方差分析可知：P＜0.000 1，該回歸方程模型極顯著；失擬性P=0.808 1＞0.05，無(wú)顯性著，說(shuō)明模型擬合正確；決定系數(shù)R2=0.997 7＞0.9，校正系數(shù)=0.994 7＞0.9，說(shuō)明該模型擬合程度較高，該方程可應(yīng)用于藍(lán)莓葉槲皮素的超聲輔助提取工藝研究。由F值可知，影響槲皮素提取量各因素作用大小比較：超聲功率（C）＞料液比（A）＞超聲溫度（B）。

表3 槲皮素提取量回歸方程方差分析

2.2.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析

各因素之間交互作用對(duì)槲皮素提取量的影響見(jiàn)圖4～圖6。等高線圖可以直觀反映出交互因素對(duì)槲皮素提取量的影響程度。交叉線越平穩(wěn)，形狀呈圓形，代表交互作用不顯著；而交叉線越陡峭，形狀呈橢圓形，則代表交互作用顯著。固定超聲功率，隨著超聲溫度和料液比的增加，槲皮素提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，曲面坡度較陡，等高線呈橢圓形，則超聲溫度和料液比兩因素交互作用顯著；固定超聲溫度，隨著超聲功率和料液比的增加，槲皮素提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，曲面坡度較陡，等高線呈橢圓形，則超聲功率與料液比兩因素交互作用顯著；固定料液比，槲皮素提取量隨著超聲功率和超聲溫度的升高而降低，曲面坡度陡峭，兩因素作用極顯著。

圖4 超聲溫度和料液比對(duì)槲皮素提取量影響的響應(yīng)面圖和等高線

圖5 超聲功率和料液比對(duì)槲皮素提取量影響的響應(yīng)面圖和等高線

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，最終得出藍(lán)莓葉槲皮素超聲輔助提取的最優(yōu)條件：料液比1∶13.773 g/mL，超聲溫度51.288 ℃，超聲功率499.123 W。在此條件下，槲皮素提取量為8.765 mg/g。考慮到實(shí)際操作會(huì)存在一定誤差，將工藝條件進(jìn)行優(yōu)化為料液比1∶15 g/mL、超聲溫度50 ℃、超聲功率500 W。在此條件下，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，槲皮素提取量為8.396 mg/g。與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出的最大值之間存在4.2%的誤差，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)和分析藍(lán)莓葉槲皮素超聲輔助提取的工藝條件。

2.2.4 高效液相色譜法定量結(jié)果分析

將經(jīng)DM101大孔樹(shù)脂純化后的藍(lán)莓葉槲皮素，通過(guò)高效液相色譜儀測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為320 nm。從圖7和圖8可知，藍(lán)莓葉槲皮素在該分離條件下達(dá)到很好的分離效果，槲皮素樣品液在14.5 min處有較好的吸收峰，與槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間完全一致，可以確定經(jīng)提取純化后的樣品為槲皮素。

圖7 槲皮素對(duì)照品HPLC圖

圖8 槲皮素樣品HPLC圖

2.3 藍(lán)莓葉槲皮素體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 DPPH自由基清除率試驗(yàn)結(jié)果

由圖9可知，在0.5～2.5 mg/mL范圍內(nèi)，藍(lán)莓葉槲皮素對(duì)DPPH自由基清除率逐漸增大。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到43.5%，DPPH自由基清除能力低于VC的DPPH自由基清除能力，而高于蘆丁的DPPH自由基清除能力。此后隨濃度增加，三者對(duì)DPPH自由基清除能力變化不大。

圖9 藍(lán)莓葉槲皮素、VC和蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.3.2 超氧陰離子自由基清除率試驗(yàn)結(jié)果

由圖10可知，在0.5～4.5 mg/mL范圍內(nèi)，藍(lán)莓葉槲皮素、蘆丁、VC對(duì)超氧陰離子自由基清除率，隨著濃度的增大而升高。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4.5 mg/mL時(shí)，三者對(duì)超氧陰離子自由基清除率達(dá)到最大，分別為45.3%，37.4%和85.8%。當(dāng)這三者濃度相同時(shí)，其對(duì)超氧陰離子自由基清除率VC最高、藍(lán)莓葉槲皮素次之、蘆丁最低。

圖10 藍(lán)莓葉槲皮素、VC和蘆丁對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)的方法，對(duì)超聲波輔助提取槲皮素的工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定最優(yōu)提取條件：在75%乙醇條件下，料液比1∶15（g/mL），超聲溫度50 ℃，超聲功率500 W。影響槲皮素提取量的因素順序依次為超聲功率＞料液比＞超聲溫度。通過(guò)3組平行試驗(yàn)，槲皮素提取量為8.396 mg/g。與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出的最大值之間存在4.2%的誤差，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)和分析藍(lán)莓葉槲皮素超聲輔助提取的工藝條件。經(jīng)高效液相色譜法結(jié)果分析得藍(lán)莓葉槲皮素提取物中含有槲皮素單體。通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)，藍(lán)莓葉槲皮素DPPH自由基清除率為43.5%，對(duì)超氧陰離子自由基清除率為45.3%。該研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)藍(lán)莓葉槲皮素抗氧化功能性食品提供理論依據(jù)。