段志航，趙彩云，代博，唐達，李曉花*

滇西應用技術大學傣醫(yī)藥學院（云南 666100）

紫色姜為姜科姜屬植物紫色姜（Zingiber montanum（J.Koenig）Link ex A.Dietr.）的干燥根莖，主要產自中國云南西雙版納，廣泛栽種于傣族居民的房前屋后，是傣族常用調料品，傣藥名“補累”，是傣藥成藥，國藥準字Z20026657，雙姜胃痛丸（帕中補）的主要藥材，收錄于《云南省中藥材標準》（2005年版）[1-2]?，F代對紫色姜的研究主要集中于揮發(fā)油，具有健胃、消食、散寒、止嘔等功效[2-4]。黃酮類化合物是姜科姜屬植物黃姜、大高良姜、山姜、干姜、良姜、大肉姜的主要活性成分，具有抑菌、抗炎、抗銀屑病、抗氧化、減肥、降血脂、降血糖及防治糖尿病等多種活性[4-13]，被廣泛用于食品、醫(yī)藥等領域。試驗為進一步拓展紫色姜的開發(fā)利用前景，以其干燥根莖為原料，采用單因素試驗為基礎，以響應面法對紫色姜總黃酮成分的提取工藝進行優(yōu)化，以DPPH·和·OH清除率為指標，評價其抗氧化能力[18-21]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色姜干品（生產批號為滇20182806，西雙版納藥業(yè)有限責任公司）；蘆丁標準品（純度＞98%，solarbio）；無水乙醇（分析純，天津大茂化學試劑廠）；5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、氫氧化鈉（分析純，美國默克Sigma-Aldrich試劑）；石油醚[分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司]；1, 1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；維生素C（≥99.7%，阿達瑪斯試劑有限公司）；K2HPO4和KH2PO4（分析純，上海泰坦科技股份有限公司）；鄰菲羅啉（分析純、阿達瑪斯試劑有限公司）；硫酸亞鐵（分析純、美國Amresco公司）；超純水為自制。

1.2 主要儀器與設備

DHG-9070A型烘箱（上海一恒科技有限公司）；Secura125-ICN型分析天平（賽多利斯公司）；CR-031S型超聲波清洗機（春霖清洗設備公司）；UV2600型紫外分光光度計（日本島津有限公司）；UPR-Ⅱ-20L超純水儀（鄭州優(yōu)爾普儀器）。

1.3 方法

參照《中國藥典》（2020年版）附錄Ⅳ及文獻報道的高良姜等總黃酮的提取方法[10-13]，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法進行紫色姜總黃酮含量測定[9-11]。

1.3.1 對照品溶液的配制

將蘆丁對照品干燥至恒重后，精密稱取0.010 5 g，加適量85%乙醇超聲溶解，放冷，定容至50 mL，搖勻，即得蘆丁的對照品貯備試液（0.21 mg/mL）[12]。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密量取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL對照品溶液，分別置于25 mL量瓶后加85%乙醇至6 mL。加0.8 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置10 min，加0.8 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置10 min，加4 mL 5%氫氧化鈉溶液，定容，搖勻，靜置20 min。以空白為掃描基線，從190～900 nm進行全波長掃描，最大吸收波長為365 nm。以空白開始，對不同濃度標準液在365 nm波長下測定吸光度，縱坐標為吸光度（A），橫坐標為蘆丁濃度（C），繪制標準曲線。標準曲線方程為y=0.014 7x-0.080 9，R2=0.999 8，線性關系良好[11-13]。

1.3.3 紫色姜總黃酮的提取和含量測定

紫色姜烘干，粉碎，過篩（60目，約0.250 mm），干燥保存。

稱取1 g紫色姜粉末，加入30 mL石油醚浸泡脫脂提取8 h后，將藥渣烘干，加入30倍67%乙醇，于30 ℃超聲提取63 min，離心得上清液，用67%乙醇定容至50 mL，備用。

取1 mL備用提取液，加0.8 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置10 min，加0.8 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置10 min，加4 mL 5%氫氧化鈉溶液，用相應體積分數的乙醇定容至50 mL，充分混勻，靜置20 min，平行3份，以相應溶液為空白對照，在365 nm波長下測吸光度，根據蘆丁標準曲線，計算待測液中紫色姜黃酮的濃度，按式（1）計算紫色姜中黃酮提取率（mg/g）[18-25]。

紫色姜黃酮提取率=c×a×V/M（1）式中：V為提取液體積，mL；c為提取液中黃酮質量濃度，mg/mL；a為稀釋倍數；M為紫色姜質量，g。

1.3.4 紫色姜總黃酮提取單因素試驗

紫色姜根莖經干燥、粉碎，脫脂提取后，稱取1 g，在其他條件一致的情況下，分別考察單因素條件，包括不同功率、提取時間、料液比、乙醇體積分數對紫色姜總黃酮提取率的影響。提取液離心后定容，稀釋，按1.3.2和1.3.3項下方法進行測定，每個試驗平行3次試驗，取平均值。根據試驗結果設定響應面試驗因素水平。

1.3.5 Box-Behnken 響應面試驗

1.3.5.1 響應面法優(yōu)化超聲提取工藝

根據單因素試驗結果，設定各因素水平，利用Design-Expert 10.0.3軟件中Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，對單因素試驗進行優(yōu)化，考察時間、料液比、乙醇體積分數、超聲功率對提取率的影響，以黃酮提取率為考察指標，設計四因素三水平的響應面試驗（共29個試驗點）進行正交試驗，并進行方差分析，因素水平見表1[15-19]。

表1 因素水平表

1.3.5.2 提取工藝的驗證根據Design-Expert 10.0.3軟件運行結果，在超聲功率、超聲時間、料液比、乙醇體積分數等多因素共同影響下的最優(yōu)提取工藝，結合實際工藝設置的可行性，采用優(yōu)化工藝進行3次重復試驗，將得到的實際提取率與理論提取率進行比較。若回歸模型的預測值和實際試驗結果相符合，則表明該回歸模型可準確地預測和模擬紫色姜總黃酮提取率。

1.3.6 紫色姜總黃酮體外抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性

1.3.6.1.1 供試品溶液的制備

按1.3.3.1的優(yōu)化工藝進行提取，得到提取液，進行稀釋處理，得到0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mg/mL不同質量濃度的黃酮提取液。

1.3.6.1.2 DPPH溶液的制備

以95%乙醇溶液為溶劑配制濃度0.1 mmol/L的DPPH溶液。

1.3.6.1.3 VC對照品溶液的制備

精密稱取0.5 g維生素C，用無水乙醇溶解、定容，于100 mL棕色容量瓶中，得到質量濃度5 mg/mL的陽性對照品溶液，避光冷藏于4 ℃冰箱中。取2，4，6，8，10和12 mL，用乙醇定容于100 mL，稀釋配成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mg/mL不同質量濃度的對照品溶液[18-19]。

1.3.6.1.4 DPPH自由基清除能力的測定

依次精密移取DPPH溶液、乙醇各2 mL，置于10 mL試管中，振搖充分混合，30 min后于波長517 nm處測定吸光度（Ac）；精密移取乙醇、供試品溶液各2 mL，置于10 mL試管中，振搖充分混合，30 min后，于波長517 nm處測定吸光度（Aj）；依次精密移取DPPH溶液、供試品各2 mL于10 mL試管中，充分混合振搖，靜置30 min（室溫下），于波長517 nm處測定吸光度（Ai）。平行測定3次以上，取平均值。按式（2）計算不同濃度紫色姜黃酮提取物對DPPH自由基清除率[18-19]。

式中：K為DPPH自由基的清除率，%；Ai為加試品、DPPH的吸光度；Aj為加試品的吸光度；Ac為加入乙醇、DPPH的吸光度。

1.3.6.2 紫色姜總黃酮羥基自由基清除能力測定

按1.3.3.1的優(yōu)化工藝進行提取，得到提取液，進行稀釋處理，得0.1 mg/mL黃酮溶液。取10個容量瓶（10 mL），分別加入0.1 mg/mL黃酮溶液與1，2，3，4，5，6，7，8，9和10 mL VC溶液，用乙醇溶液（65%）定容至10 mL，得到VC溶液和待測樣品。取相同比色管（10個），分別加入2 mL pH 7.4，0.2 mol/L磷酸緩沖液和0.3 mL 2.5 mmol/L鄰菲羅啉溶液，充分混勻。加入0.2 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液，立即混勻，向其中分別加入1.5 mL VC溶液或紫色姜樣品溶液，混勻，加入1 mL 1% H2O2。另做損傷管和未損傷管，其中損傷管中加入1% H2O2，未損傷管中不加1%H2O2，補充體積至8 mL，恒溫1 h（37 ℃水?。?，用紫外分光光度計在波長364.5 nm處測其吸光度。按式（3）計算清除率（%）。

式中：A2為樣品管的吸光度；A0為未損傷管的吸光度；A1為損傷管的吸光度。

2 結果與分析

2.1 紫色姜總黃酮提取單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對紫色姜總黃酮提取率的影響

在溫度30 ℃、料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分數65%、超聲時間60 min條件下，研究超聲功率100，200，300，400和500 W時紫色姜總黃酮提取率，結果見圖1。

圖1 超聲功率對紫色姜黃酮提取率的影響

由圖1可知，在100～300 W功率范圍內，紫色姜總黃酮提取率隨著超聲功率的增加而增加，最高提取率為30.94 mg/g。隨著功率的進一步增加，紫色姜總黃酮的提取率降低，在500 W時總黃酮提取率下降至25.92 mg/g。這種現象可能是因為在適當范圍內，提高功率，可以有效使細胞的內容物加速流出，從而增大提取液中紫色姜總黃酮物質流出。而超聲功率過大，會導致空化泡的增長過大，進而降低空化作用和超聲波的傳播，減少能量的傳遞，這不利于提取的進行。

2.1.2 超聲時間對紫色姜總黃酮提取率的影響

在溫度30 ℃、料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分數65%、超聲功率300 W條件下，研究超聲時間10，20，30，40，50，60，70和80 min時紫色姜總黃酮提取率，結果見圖2。

圖2 超聲時間對紫色姜黃酮提取率的影響

由圖2可知，在一定范圍內，紫色姜總黃酮提取率隨著時間的增加而增加，在60 min時紫色姜總黃酮提取功率最高（26.05 mg/g）。當提取時間延長至70 min時總黃酮提取率下降至25.12 mg/g。該現象可能是在一定范圍內提取時間增加，有利于紫色姜總黃酮的溶出；但是隨著提取時間的延長，超聲破壞了黃酮類成分的結構，且其他物質溶出增加，使其得率下降。

2.1.3 料液比對紫色姜總黃酮提取率的影響

在溫度30 ℃、乙醇體積分數65%、超聲功率300 W、超聲時間60 min條件下，研究料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL時紫色姜總黃酮提取率，結果見圖3。

圖3 料液比對紫色姜黃酮提取率的影響

由圖3可知，在1∶10～1∶30 g/mL范圍內紫色姜總黃酮提取率隨著料液比中液體占比的增加，最高為32.88 mg/g。當料液比中液體占比進步一增加時，總黃酮提取率降低，在1∶50 g/mL時總黃酮提取率下降至28.05 mg/g，說明料液比中液體占比的增加導致其他化合物的溶出度增加，使其提取率下降。

2.1.4 乙醇體積分數對紫色姜總黃酮提取率的影響

在溫度30 ℃、料液比1∶30 g/mL、超聲功率300 W、超聲時間60 min條件下，研究乙醇體積分數55%，65%，75%，85%和95%時紫色姜總黃酮提取率，結果見圖4。

圖4 乙醇體積分數對紫色姜黃酮提取率的影響

由圖4 可知，紫色姜總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增加呈現先升高后降低的趨勢。在65%時紫色姜總黃酮提取功率最高（32.89 mg/g），在95%時總黃酮提取率下降至24.38 mg/g。說明乙醇體積分數增高可能導致其他化合物的溶出度增加，使總黃酮得率下降。

2.2 響應面法優(yōu)化紫色姜總黃酮提取工藝

2.2.1 模型的建立與方差分析

在單因素試驗基礎上，以超聲功率、超聲時間、料液比、乙醇體積分數為影響因素，以紫色姜總黃酮提取率為響應值，采用Box-Behnken的中心組合試驗設計原理設計模型試驗，以Design-Expert 10.0.3軟件對結果進行分析，確定紫色姜總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件，響應面試驗設計及結果見表2，方差分析與顯著性差異見表3。

表2 響應面試驗結果及分析

表3 回歸方程方差分析

如表3所示，對回歸方程進行方差分析。其中，顯著性檢驗概率P小于0.05時，認為該模型具有統(tǒng)計學意義。F值檢驗各變量，以評價對響應值影響的顯著性的大??；F值越大，則相應變量的顯著程度越大。從表3可以看出，工藝條件對提取率影響大小順序為D＞A＞B＞C，即超聲功率＞乙醇體積分數＞超聲時間＞料液比。模型的決定系數R2為0.989 2，說明模型具有較高顯著性，同時=0.978 5，能夠解釋試驗97.85%的響應值變異，且與預測相關系數也接近，說明試驗模型與真實數據有較好擬合度，可用該模型分析和預測提取率最佳的處理工藝。

應用Design-Expert 10.0.3軟件對試驗結果進行多元回歸擬合，得到紫色姜總黃酮得率（Y）對乙醇體積分數（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、超聲功率（D）的二次多元回歸方程：Y=31.864+1.192 5A+0.8B-0.643 333C+1.689 17D+0.11AB+1.727 5AC-0.33AD+0.965BC+0.215BD+0.137 5CD-2.586 58A2-1.672 83B2-2.072 83C2-2.829 08D2。

不同工藝條件交互作用對提取率的影響見圖5～圖10。由圖5可知，乙醇體積分數-超聲時間交互作用，對提取率的影響趨勢為一拋物曲面，乙醇體積分數和超聲時間的增加使提取率呈先增后減變化趨勢。取適中條件，即乙醇體積分數60%～70%、超聲時間60～65 min時，可顯著提高產物提取率。由圖6可知，交互曲面縱向跨度較大，且等高線呈現顯著橢圓形，表明乙醇體積分數和料液比交互作用對提取率影響顯著。乙醇體積分數和料液比的增加使提取率結果呈先增后減變化趨勢。僅考慮二者影響下，提取率優(yōu)化工藝條件集中于乙醇體積分數60%～70%、料液比1∶25～1∶35 g/mL水平區(qū)間組合。如圖7所示，乙醇體積分數和超聲功率增加使提取率均呈先增后減變化。其中，提取率隨超聲功率的變化趨勢更加顯著，表明超聲功率對提取率的影響較乙醇體積分數影響顯著。乙醇體積分數65%～70%、超聲功率300～350 W水平范圍取值時，為二者交互影響下提取率的優(yōu)化工藝。由圖8可知：超聲時間小于60 min時，提取率與超聲時間呈正相關關系；超聲時間大于60 min時，其關系發(fā)生轉折，在超聲時間60 min附近取值時，為提取率的臨界最佳工藝參數。同理，提取率隨料液比變化，其在1∶30 g/mL附近取值時，為臨界最佳參數。如圖9所示，超聲功率和超聲時間交互作用中，超聲功率對提取率的貢獻更大，是提取率的敏感影響因子。取超聲功率300～350 W、超聲時間水平60～65 min條件，利于促進產物提取率提升。如圖10所示，提取率被超聲功率的影響，較料液比影響更加顯著，引起先增后減小的較大幅度曲面變化，取料液比1∶25～1∶30 g/mL、超聲功率300～400 W水平附近值，可顯著提高提取率水平。根據結果進行分析各影響因素，得出最佳提取工藝條件：超聲功率330 W、超聲時間63 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分數67%。

圖5 超聲時間與乙醇體積分數的響應曲面及等高線圖

圖6 料液比與乙醇體積分數的響應曲面及等高線圖

圖7 超聲功率與乙醇體積分數的響應曲面及等高線圖

圖8 超聲時間與料液比的響應曲面及等高線圖

圖9 超聲時間與超聲功率的響應曲面及等高線圖

圖10 料液比與超聲功率的響應曲面及等高線圖

圖11 最佳超聲提取工藝條件試驗驗證圖

2.2.2 最佳超聲提取工藝條件試驗驗證

為驗證擬合的回歸方程是否能指導實踐生產，進行3次平行試驗，取平均值，根據實際生產條件，調整最佳工藝參數：超聲功率330 W、超聲時間63 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分數67%，在此條件下，紫色姜總黃酮平均提取率為33.20 mg/g，與理論值相似，而且重復性較好。

2.2.3 抗氧化性研究

紫色姜總黃酮表現出的DPPH清除活性隨著濃度的增加而增加[18-19]。從圖12可以看出，質量濃度范圍在0.1～0.6 mg/mL時，紫色姜總黃酮最大清除活性為46.33%。從圖13可以看出，隨著提取物濃度的升高，其對·OH自由基的清除率逐漸升高，具有濃度依賴性。此外，隨著濃度的增加，紫色姜總黃酮質量濃度0.6 mg/mL時抑制率最高到54.20%。

圖12 DPPH自由基清除試驗

圖13 羥基自由基試驗

試驗選擇2種抗氧化活性評價方法，均表現出紫色姜總黃酮和VC的體外抗氧化能力，且抗氧化活性與紫色姜總黃酮濃度的增加密切相關。

3 結論

以紫色姜總黃酮為試驗對象，單因素試驗為基礎，通過響應面優(yōu)化法，優(yōu)化輔助紫色姜總黃酮的提取工藝，考察超聲功率、超聲時間、料液比、乙醇體積分數對紫色姜總黃酮得率的影響。結果顯示：響應面分析的二次模型，擬合程度較高，影響紫色姜總黃酮得率的因素主次順序是超聲功率＞乙醇體積分數＞超聲時間＞料液比；提取的最佳工藝為超聲功率330 W、超聲時間63 min、料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分數67%，紫色姜總黃酮提取率為33.20%，與理論值相差不大。采用·OH自由基和DPPH·清除試驗對紫色姜總黃酮抗氧化活性進行體外抗氧化評價。試驗結果顯示，紫色姜總黃酮對不同自由基的清除能力不同，在質量濃度范圍（0.1～0.6 mg/mL）內，紫色姜總黃酮均呈現劑量依賴的關系。雖然在·OH自由基和DPPH· 自由基清除試驗中發(fā)現抗氧化活性均較VC弱，但在一定范圍下，紫色姜總黃酮在抗羥自由基試驗中顯示出較好的抗氧化性，說明其具有抑制自由基生成的作用，可作為自由基清除型抗氧劑應用。