祝曼麗，鄭真姐，魏琳芽，劉嬌，許云賀，張莉力*

錦州醫(yī)科大學食品與健康學院（錦州 12100）

玫瑰花富含黃酮、總酚、氨基酸、微量元素、揮發(fā)油、多糖等活性成分[1]，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜安神等功效，被廣泛應用在食品、藥品、保健品等領域[2-5]。洛神花又名玫瑰茄，洛神花中含有黃酮、總酚、有機酸等活性成分，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤等作用[6]，被廣泛應用茶劑、冷熱飲料、果汁、果醬等方面[7]。蠶豆花中含有槲皮素和山奈酚，有良好的抗氧化活性，臨床上從蠶豆花中提取左旋多巴治療帕金森[8]，具有良好的降血壓活性[9]。近幾年，人們對花茶的需求量顯著增加，花茶相關的產(chǎn)品開發(fā)和利用還處于初級階段，產(chǎn)品較單一[10]。

目前，很多人把眼光放在了乳酸菌發(fā)酵植物基質上[11]。植物基質發(fā)酵可以改善風味，有助于提高抗氧化能力。蘋果汁經(jīng)乳酸桿菌發(fā)酵后抗氧化性有了明顯的提高，乳酸菌發(fā)酵植物基質可以提高酚類化合物生物利用[12]，玫瑰干花瓣用乳酸菌發(fā)酵后抗氧化能力顯著增強[13]。經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后的玫瑰花抗氧化能力顯著增加[14]。

因此，以玫瑰花、洛神花和蠶豆花為主要原料，以Liquorilactobacillus sataumensisML30和Lactococcus lactis subsp lactisYM34為發(fā)酵劑，以模糊評價為指標，利用單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵花茶的最佳發(fā)酵工藝優(yōu)化，并測定發(fā)酵過程中黃酮含量、總酚含量、DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力和羥自由基清除能力對其在發(fā)酵過程中的抗氧化能力并進行評價，為乳酸菌發(fā)酵花茶產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

玫瑰花（山東濟南平陰縣）；洛神花（安徽亳州沁園春堂）；蠶豆花（河北保定花辰月夕旗艦店）；黃冰糖（南京甘汁園糖業(yè)有限公司）。

研究初步設定玫瑰花和洛神花的比例3∶2、添加量3%、蠶豆花添加量0.02%、黃冰糖添加量8%、菌株比例1∶1、初始pH 5.2、發(fā)酵溫度30 ℃、培養(yǎng)時間24 h。

L.satsumensisML30、L.lactis subsp lactisYM34發(fā)酵劑（菌保藏于錦州醫(yī)科大學微生物實驗室）；L.satsumensisML30種子培養(yǎng)基（紅糖添加量6%、大豆低聚肽添加量0.3%、胡蘿卜汁添加量7%、磷酸氫二鉀的添加量0.2%、發(fā)酵溫度30 ℃、初始pH 6、菌株接種量5%、發(fā)酵時間為16～18 h）；L.lactis subsp lactisYM34種子培養(yǎng)基參考李源等[15]。

1.2 主要儀器與設備

SG-C20 K36電磁爐（中山市森高電器有限公司）；DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱（蘇州佳寶凈化工程設備有限公司）；JB-VS-1300超凈工作臺（金壇市鑫鑫實驗儀器廠）；PHS-3B精密pH計（上海雷磁儀器廠）；紫外分光光度計（上海滬凈醫(yī)療器械有限公司）；LX-B100L立式自動壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設備有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 花茶制備

按玫瑰花和洛神花的比例3∶2、添加量3%，蠶豆花0.02%放入到水中煮制沸騰，將洛神花挑出放入榨汁機中并加入適量水打碎5 s，過0.125 mm篩子和8層紗布。加入8%黃冰糖在70 ℃下加熱溶解，攪拌均勻，花茶冷卻至室溫，用磷酸氫二鉀調節(jié)pH，分裝，在95 ℃下滅菌10 min。

1.3.2 單因素試驗

以制備100 mL的花茶為標準，以模糊評定法[16]為評價指標，模糊評定法中感官評分占60%，菌體密度占40%，所有權數(shù)之和為1。權重系數(shù)矩陣M=（60%，40%）評價結果為V=MR，R為最大值，根據(jù)V的大小來綜合判斷花茶發(fā)酵程度?？疾烊樗峋l(fā)酵花茶菌株接種量（2%，4%，6%，8%和10%）、菌株比例（YM34-ML30比例3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3）、初始pH（pH 4.5，5，5.5，6和6.5）、培養(yǎng)溫度（20，25，30，35和40 ℃）、發(fā)酵時間（4，8，12，16和20 h）對乳酸菌發(fā)酵花茶品質的影響。

1.3.3 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以模糊評定為指標，選出單因素中影響較大的因素，以發(fā)酵時間（A）、初始pH（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量，以模糊評分（V）為響應值，進行工藝優(yōu)化試驗，因素與水平如表1所示。

表1 乳酸菌發(fā)酵花茶加工工藝響應面試驗因素與水平

表2 感官評分表

1.3.4 感官評價

根據(jù)薛寶玲等[17]的感官評價方法，選擇10名感官評價員（5男5女），以乳酸菌發(fā)酵花茶的外觀、口感和香味等評價指標對產(chǎn)品進行感官評價，總分為100分。

1.3.5 吸光度的測定

吸光度采用紫外分光光度法[18]，以未發(fā)酵的花茶為空白，測菌體密度。

1.3.6 活性成分測定

最佳發(fā)酵條件優(yōu)化的花茶，分別選取0，5，10和15 h四個時間段乳酸菌發(fā)酵的花茶，并測定最佳工藝下乳酸菌發(fā)酵花茶的黃酮和總酚含量。其中測定黃酮含量參照孫小晶等[19]的方法，標準曲線的方程為y=0.135 6x-0.044 4，R2=0.993 3，重復3次試驗計算乳酸菌發(fā)酵花茶中的黃酮含量?？偡雍坎捎酶Ａ址颖壬╗20]，標準曲線的方程為y=0.055 5x+0.000 7，R2=0.999 5，重復3次試驗計算乳酸菌發(fā)酵花茶中的總酚含量。

1.3.7 抗氧化性測定

分別選取0，5，10和15 h四個時間段乳酸菌發(fā)酵的花茶，并測定DPPH自由基，參考Yang等[21]的檢測方法；超氧自由基清除率的研究參考高善行等[22]的檢測方法；羥自由基的清除率參考賈寒冰等[23]的檢測方法。評價乳酸菌發(fā)酵花茶的抗氧化活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計利用SPSS 22.0版本對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA單因素方差分析和LSD多重檢驗（P＜0.05），通過SNK檢驗法進行各組間的兩兩差異性比較。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌株接種量對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

菌株接種量為2%，4%，6%，8%和10%，分析菌株接種量對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表3所示，菌株接種量過大或過小對吸光度都有很大的影響，菌株接種量小于6%或大于6%時，乳酸菌發(fā)酵花茶的吸光度低于正常。當菌株接種量為6%時，乳酸菌發(fā)酵花茶的吸光度最高，結合感官評價后的V值也最高，此時得到的產(chǎn)品沉淀少，有一種玫瑰的淡淡清香味（P＜0.05），因此，較優(yōu)的菌株接種量為6%。

表3 菌種接種量對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.1.2 菌株比例對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

菌株比例為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3，分析菌株比例對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表4所示，菌株比例為1∶1時，乳酸菌發(fā)酵花茶中V值最高，吸光度最高為0.716±0.009，感官評價為79.5±0.47分，均高于其他比例（P＜0.05），在此情況下乳酸菌發(fā)酵花茶產(chǎn)品無沉淀，酸甜適中，說明在此菌株比例下，乳酸乳球菌和乳酸桿菌都能很好地生長，因此，選擇菌株比例1∶1。

表4 菌種比例對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.1.3 初始pH對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

初始pH 4.5，5，5.5，6和6.5，分析初始pH對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表5所示，當pH為6時，乳酸菌發(fā)酵花茶中V值最高，得到的產(chǎn)品吸光度和感官評分好（P＜0.05），pH過低，乳酸乳球菌的生長會受到抑制，沒有為乳酸乳球菌創(chuàng)造良好的生長環(huán)境，當初始pH過高時，乳酸桿菌的生長又會受到抑制，從而導致乳酸菌發(fā)酵花茶的風味不佳。因此，選擇pH 6。

表5 不同pH對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.1.4 培養(yǎng)溫度對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

培養(yǎng)溫度為20，25，30，35和40 ℃，分析培養(yǎng)溫度對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表6所示，溫度對乳酸菌有較大影響，發(fā)酵的溫度過低，菌體不能正常地生長繁殖，在此階段菌體的代謝較慢，當發(fā)酵溫度為30 ℃時，菌體的吸光度最高，但花茶的顏色較暗淡、略有苦味，V值不高，當發(fā)酵溫度為35 ℃時，吸光度達到0.441，感官評價最高，顏色鮮艷、苦味不重、發(fā)酵風味良好，因此，培養(yǎng)溫度選擇35 ℃。

表6 發(fā)酵溫度對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.1.5 發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

發(fā)酵時間為4，8，12，16和20 h，分析發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響。如表7所示，發(fā)酵時間越長，吸光度越高，感官評價得分就越低，感官評價下降（P＜0.05），當發(fā)酵時間為16 h時，感官評價最高，發(fā)酵風味良好、質地均勻、顏色鮮艷且長時間不變色、酸甜適中，V值最高為0.952±0.003（P＜0.05），因此，選擇發(fā)酵時間16 h進行后續(xù)試驗。

表7 不同發(fā)酵時間對乳酸菌發(fā)酵花茶的影響

2.2 響應面試驗優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵花茶發(fā)酵工藝結果

2.2.1 乳酸菌發(fā)酵花茶響應面試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，選擇發(fā)酵時間（A）、初始pH（B）、培養(yǎng)溫度（C）作為考察因素，依據(jù)模糊評定法確定V值，各因素試驗設計與結果見表8。

表8 乳酸菌發(fā)酵花茶工藝優(yōu)化響應面試驗設計與結果

2.2.2 回歸模型的建立

如表9所示，利用Design Expert 10.0軟件對試驗數(shù)據(jù)回歸分析建立方程：V=0.95-0.039×A+0.032×B+0.037 5×C+0.085×A×B-0.028×A×C+0.040×B×C-0.079×A2-0.041×B2-0.089×C2。

表9 乳酸菌發(fā)酵花茶工藝優(yōu)化回歸模型方差分析

表10 乳酸菌發(fā)酵花茶抗氧化活性

響應面試驗模型中的A、AB、A2、C2影響差異均極顯著（P＜0.01），B、交互項BC對試驗響應值影響顯著（P＜0.05），C、交互項AC對響應值的影響不顯著（P＞0.05）。由統(tǒng)計學模型可以得出，回歸系數(shù)R2=0.958 5，模型校正決定系數(shù)Radj2=0.911 8，由此說明該模型可以解釋91.11%響應值的變化，擬合度良好，誤差小，可以用來分析乳酸菌發(fā)酵花茶的大眾接受度，具有一定的指導意義。因變量與試驗中所考察的自變量之間的線性關系顯著，說明在此次對花茶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化試驗中，試驗數(shù)據(jù)誤差較小，結果可信。它們之間的主次關系依次為發(fā)酵時間＞pH＞發(fā)酵溫度。通過響應面優(yōu)化分析，可得到花茶發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件。根據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件求出回歸模型極值點，結果表明最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵時間14.90 h、pH 5.7、發(fā)酵溫度35.6 ℃，此時V值為0.952 6。為了方便乳酸菌發(fā)酵花茶的制作，將最優(yōu)條件調整為發(fā)酵時間15 h、pH 5.7、發(fā)酵溫度36 ℃。經(jīng)過3次驗證試驗，V值為0.95，活菌數(shù)為3.6×108CFU/mL，發(fā)酵后的pH為3.8±0.05，這些指標說明該方程與實際情況擬合良好，適合應用于花茶發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化。

2.3 花茶發(fā)酵過程中活性成分和抗氧化能力分析

2.3.1 花茶發(fā)酵過程中活性成分的變化

花茶發(fā)酵過程中黃酮和總酚含量變化，結果如圖1所示。黃酮和總酚含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加，總酚含量在發(fā)酵初始階段（0～10 h）增加速度較緩慢，在10～15 h快速增加，在發(fā)酵結束時，總酚含量由最初的2.29±0.05 μg/mL增長至3.89±0.09 μg/mL，提高了69.76%，經(jīng)過去糖基化反應使乳酸菌發(fā)酵花茶中有更多的糖基化酚，破壞植物的細胞壁，從而釋放出更多的可溶性共軛或者不溶性酚類化合物，從而導致總酚含量增加[24]。在發(fā)酵0～5 h，黃酮含量增長得最快，由1.09±0.04 mg/mL增長至1.20±0.04 mg/mL，隨著發(fā)酵時間的延長，黃酮的增長速度減緩，在發(fā)酵結束時黃酮增長至1.33±0.04 mg/mL，比發(fā)酵前提高了20.54%。酶經(jīng)過酶解后會破壞細胞壁從而使黃酮更好地釋放出來[25]。在發(fā)酵過程中，黃酮類和總酚類物質含量升高，是玫瑰花中的重要的活性生物成分，具有較強的生物活性，是一種天然的抗氧化劑[26]。

圖1 花茶發(fā)酵過程中活性物質含量變化

2.3.2 發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

乳酸菌發(fā)酵后，花茶發(fā)酵的DPPH自由基清除率、超氧自由基清除率顯著升高，分別上升了33.44%和6.13%，羥自由基清除率下降了6.63%。DPPH自由基清除能力增加表明微生物發(fā)酵可能會提高多酚化合物的可用性，說明乳酸菌發(fā)酵花茶具有一定的抗氧化活性。乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酚類和黃酮類物質能使DPPH清除率的上升，使其抗氧性增強。研究也發(fā)現(xiàn)，總酚與清除超氧陰離子能力有顯著的量效關系[27]。

3 結論

乳酸菌發(fā)酵花茶的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)是菌株接種量6%、菌株比例1∶1、初始pH 5.5、培養(yǎng)溫度36℃、發(fā)酵時間15 h。乳酸菌發(fā)酵花茶在發(fā)酵過程中，黃酮的含量提高了20.54%，多酚含量提高了69.76%，DPPH自由基清除能力提高了33.44%，超氧自由基清除率提高了6.13%，羥自由基清除率下降了6.63%。結果表明花茶經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后抗氧化能力明顯提高，為后續(xù)研究乳酸菌發(fā)酵花茶的營養(yǎng)成分奠定理論基礎。