李淑慧，王 雅，田 軍，郭雨軒，張淑涵，牟 越，翁小剛，孫 奕

古代經(jīng)典名方保元湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子水平機(jī)制的研究

李淑慧1, 2，王 雅2，田 軍3，郭雨軒1，張淑涵1，牟 越1，翁小剛1*，孫 奕1*

1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700 2. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050 3. 江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，江蘇 徐州 221001

闡釋古代經(jīng)典名方“保元湯”的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并探討其分子水平的作用機(jī)制，發(fā)掘保元湯更多潛在的臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。采用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)，選用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜電噴霧電離源（ESI），正、負(fù)離子掃描模式，檢測(cè)鑒定保元湯的化學(xué)成分組成，并分析保元湯大鼠多次多天ig給藥后含藥血漿中的原型化學(xué)成分及代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫和藥物信息數(shù)據(jù)庫等分析保元湯入血原型成分的靶向作用，并揭示其治療潛能。根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)和多級(jí)質(zhì)譜碎片離子，結(jié)合對(duì)照品、數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)報(bào)道，共鑒定出保元湯中133個(gè)化學(xué)成分，并且確定大鼠ig保元湯后，35個(gè)成分能夠經(jīng)口吸收入血達(dá)到血漿穩(wěn)態(tài)的藥物濃度。保元湯入血原型成分“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖、核心靶基因基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析、疾病預(yù)測(cè)分析表明，保元湯可通過人參皂苷Rb1、丹皮酚、刺芒柄花素、刺甘草查耳酮、大豆異黃酮、甘草查耳酮A、6-姜辣素、水楊酸等8個(gè)關(guān)鍵成分作用于絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription）等核心靶點(diǎn)，通過糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end- products，RAGE）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、非受體酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等信號(hào)通路等途徑發(fā)揮藥效作用，提示保元湯除治療慢性心力衰竭外，還對(duì)阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等具有潛在治療優(yōu)勢(shì)。保元湯35個(gè)入血原型成分中含有多個(gè)同類成分的衍生物，且其中既有單一成分對(duì)接多個(gè)靶點(diǎn)、又有多個(gè)類似物對(duì)接同一靶點(diǎn)的情況，由此佐證了“中藥（復(fù)方）多成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用”和“中藥多成分單靶點(diǎn)疊加作用”的理論。采用高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及其數(shù)據(jù)庫，可以為全面闡釋中藥（復(fù)方）藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及探討其分子水平的作用機(jī)制提供可行的科學(xué)方法。明確了古代經(jīng)典名方保元湯的入血化學(xué)成分，鑒定了其原型成分的代謝產(chǎn)物，并從分子水平闡釋了基于這些入血原型成分的作用靶點(diǎn)，并揭示其潛在治療優(yōu)勢(shì)，為擴(kuò)大該方劑臨床應(yīng)用提供參考，發(fā)掘更多的臨床治療潛能。

保元湯；UPLC-QTOF-MS/MS；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；分子水平機(jī)制；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；人參皂苷Rb1；丹皮酚；刺芒柄花素；刺甘草查耳酮；大豆異黃酮；甘草查耳酮A；6-姜辣素；水楊酸

保元湯是國家中醫(yī)藥管理局第一批公布的古代經(jīng)典名方之一，源于明代《博愛心鑒》和《簡(jiǎn)明醫(yī)彀》，由人參1錢、黃芪2錢、甘草5分，肉桂2分，生姜1片組成[1]，方中人參性稟中和，益元?dú)舛?，善補(bǔ)脾肺之氣，為君藥；黃芪味甘性溫，固腠理而補(bǔ)元?dú)?，與人參相須為用，增強(qiáng)補(bǔ)氣之功，為臣藥；配伍少量肉桂，取其溫通血脈、溫腎補(bǔ)陽之功用；甘草味甘性平，可解毒又能補(bǔ)氣中和，調(diào)和諸藥，為佐使藥。現(xiàn)代藥理研究表明，保元湯具有調(diào)節(jié)免疫[2]、促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)凝血及纖溶平衡、抗氧化、抗應(yīng)激[3]等作用[4]，在臨床上常用于心衰、冠心病、緩慢性心律失常等心血管疾病的治療[5]。2016年國家中醫(yī)藥管理局及國家藥監(jiān)局明確規(guī)定了生產(chǎn)符合國家規(guī)定條件且源于古代經(jīng)典名方的中藥復(fù)方制劑后，引起經(jīng)典名方的研究熱潮。作為臨床常用經(jīng)典名方保元湯，大多應(yīng)用于心血管疾病的治療上，臨床應(yīng)用相對(duì)較局限，保元湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究也較少[6]，本課題組從事保元湯的現(xiàn)代開發(fā)應(yīng)用，已對(duì)保元湯進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究探索，包括保元湯的處方組成、處方藥材基原考證、各項(xiàng)工藝參數(shù)的優(yōu)化、定量分析、指紋圖譜的建立及量值傳遞等研究。國家中醫(yī)藥管理局遴選古代經(jīng)典名方的原則是，體現(xiàn)“目前仍廣泛應(yīng)用、療效確切、具有明顯特色及優(yōu)勢(shì)”；古代中有較多記載及醫(yī)案證據(jù)，現(xiàn)代文獻(xiàn)中有較多臨床及實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道；得到中醫(yī)臨床進(jìn)一步凝練、權(quán)威專家廣泛認(rèn)可；以及各類中醫(yī)藥教材中廣為收錄等。保元湯能夠入選第一批名單，可見其具有廣泛的應(yīng)用和確切的臨床療效基礎(chǔ)。為進(jìn)一步闡明保元湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制，本研究采用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法，進(jìn)行保元湯的化學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥動(dòng)學(xué)研究，探討保元湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子水平的作用機(jī)制，發(fā)掘該方劑的臨床治療潛能。

運(yùn)用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)，可以高效、準(zhǔn)確地分析復(fù)方成分的相對(duì)分子質(zhì)量、元素組成和裂解碎片等信息，可有效識(shí)別中藥的各類復(fù)雜成分及其化學(xué)結(jié)構(gòu)，為中藥復(fù)方現(xiàn)代研究提供了進(jìn)一步的技術(shù)支撐[7]。同時(shí)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，并利用其日臻完善的數(shù)據(jù)庫，通過構(gòu)建“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”多層次的網(wǎng)絡(luò)用于中藥藥效物質(zhì)的篩選及其作用機(jī)制分析，可為中藥復(fù)方的深入研究提供有效的策略[8]。因此，本研究采用高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)保元湯水煎液以及ig給藥大鼠的血漿成分進(jìn)行分析鑒定，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法進(jìn)行系統(tǒng)分析研究，為保元湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床高效應(yīng)用等提供必要的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相系統(tǒng)和Vion QTOF型高分辨質(zhì)譜儀、UNIFITM1.9.4數(shù)據(jù)處理軟件（美國Waters公司）；Centrifuge 5424R型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；KQ5200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；VX-Ⅲ型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；HDZ20型智能煎藥壺（容量2 L，額定功率500 W，穩(wěn)定電壓220 V，美味世家永達(dá)基電器廠）；LGJ-10E型冷凍真空干燥機(jī) [四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司]。

1.2 藥材與試劑

實(shí)驗(yàn)用對(duì)照品咖啡酸（批號(hào)120160505）、肉桂酸（批號(hào)20091329）、桂皮醛（批號(hào)21051103）、槲皮素（批號(hào)10081-9905）、6-姜辣素（批號(hào)20041903）、姜黃素（批號(hào)151022）、黃芪甲苷（批號(hào)21050701）、甘草苷（批號(hào)20091106）、甘草酸（批號(hào)20041302）、毛蕊異黃酮苷（批號(hào)21010901）、人參皂苷Rg1（批號(hào)20110810）、人參皂苷Rb1（批號(hào)21011625）、人參皂苷Rf（批號(hào)21071411）、人參皂苷Re（批號(hào)21012405）、人參皂苷F1（批號(hào)O0915AS）購自北京倍特仁康生物醫(yī)藥科技有限公司，對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%。乙腈、甲醇、甲酸（美國Fisher公司）均為質(zhì)譜純；水為屈臣氏飲用水；其他試劑均為分析純。

人參（批號(hào)RS220311）、黃芪（批號(hào)HQ220402）、甘草（批號(hào)GC220406）、肉桂（批號(hào)RG220315）、生姜（批號(hào)SJY501-21-10-004），購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司，均來源于道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所孫奕研究員鑒定，5味藥材分別為五加科植物人參C. A. Mey. 的干燥根和根莖，豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根，豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖，樟科植物肉桂Presl的干燥樹皮，姜科植物姜Rosc.的新鮮根莖。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量200～300 g，動(dòng)物來源機(jī)構(gòu)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011或者SCXK（京）2021-0006；飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批單位為中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，批準(zhǔn)文號(hào)2022B023。

2 方法

2.1 分析溶液的制備

2.1.1 保元湯水提液化學(xué)成分分析

（1）保元湯水提液制備：分別取3倍處方劑量藥材飲片人參11.2 g、黃芪22.4 g、甘草5.6 g、肉桂2.3 g、生姜片約9.0 g，加水1200 mL，浸泡60 min，以武火煮沸后轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮至480 mL，多層紗布趁熱濾過，取續(xù)濾液；藥渣再加水900 mL，煎煮至420 mL，多層紗布趁熱濾過，取續(xù)濾液，合并2次濾液，得提取液。將少量提取液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，取2 μL液質(zhì)分析。

（2）對(duì)照品溶液制備：精密稱取各對(duì)照品約1.0 mg，精密稱定，加入甲醇配制成1.0 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。從上述各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液中精密量取儲(chǔ)備液各100 μL，加入甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 保元湯入血成分分析

（1）保元湯ig液制備：稱取保元湯水提液凍干粉末，加適量飲用水配制成0.14 g/mL的ig受試液。

（2）血漿樣品采集與處理：經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，確定動(dòng)物給藥及采血方案：6只SD雄性大鼠，分為給藥組與空白組，每組3只，給藥前禁食12 h，自由飲水，保元湯2倍臨床等效劑量ig給藥（1.41 g/kg），給藥容積1 mL/100 g，空白組給予同等體積的蒸餾水，每天給藥2次，連續(xù)給藥1周，1周后戊巴比妥鈉麻醉，腹腔主動(dòng)脈取血，肝素管抗凝，靜置，4 ℃，3500 r/min，離心15 min，取上清液則為含藥血漿[9]。

取含藥血漿樣品200 μL，加入甲醇800 μL沉淀蛋白，渦旋5 min，離心（轉(zhuǎn)速13 000 r/min，15 min，取上清，氮?dú)獯蹈桑瑐溆?。固相萃取柱活化，取氮?dú)獯蹈珊髽悠芳?.5 mL水溶解，渦旋2 min后上樣，以5 mL水洗脫，收集洗脫液，再用5 mL的70%甲醇洗脫，收集2種洗脫液，將水洗脫液和甲醇洗脫液13 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，70%甲醇洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈桑?00 μL 70%甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，得血漿樣品進(jìn)行分析?？瞻籽獫{處理方法同上。

2.2 UPLC-MS/MS條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS-T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～3 min，2%～19% B；3～8 min，19% B；8～8.1 min，19%～22% B；8.1～14 min，22%～29% B；14～16 min，29% B；16～32 min，29%～45% B，32～32.1 min，45%～90% B，32.1～35 min，90%～95% B，35～36 min，95% B，36～40 min，95%～2% B；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），掃描方式為MSe模式，正、負(fù)離子模式下離子源工作參數(shù)為毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，錐孔反吹氣流量（N2）50 L/h，脫溶劑氣流量1000 L/h，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度450 ℃，掃描范圍50～1500，數(shù)據(jù)分析采用UNIFITM1.9.4質(zhì)譜分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。

2.3 化合物鑒別與結(jié)構(gòu)分析

采用UNIFITM1.9.4質(zhì)譜分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，通過Chemspider數(shù)據(jù)庫、chemical book數(shù)據(jù)庫、本課題組化學(xué)成分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫以及結(jié)合可參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，建立包含保元湯5味藥材化學(xué)成分的質(zhì)譜內(nèi)部數(shù)據(jù)庫，通過精確相對(duì)分子質(zhì)量、離子碎片信息以及對(duì)照品比對(duì)鑒定化合物，并按照化合物結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行總結(jié)歸納；入血成分的鑒定方法同上，給藥后血漿與方劑提取液離子峰的保留時(shí)間、質(zhì)荷比一致的化合物，則確認(rèn)為保元湯中的入血成分，并對(duì)其中特征成分的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒別。

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.4.1 保元湯潛在作用靶點(diǎn) 將經(jīng)UPLC-QTOF- MS/MS分析鑒定后的保元湯入血原型成分，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和藥物信息數(shù)據(jù)庫Drug Bank（http://www.drugbank.ca/）找到與之對(duì)應(yīng)的靶蛋白。

2.4.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在Uniprot數(shù)據(jù)庫中查找靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名稱和編號(hào)，將活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)基因名導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape 3.8.2，運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建保元湯入血活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)將活性入血成分與作用靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，實(shí)現(xiàn)從保元湯主要入血成分到作用靶點(diǎn)分析，通過String數(shù)據(jù)庫對(duì)相應(yīng)的靶點(diǎn)繪制蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，通過節(jié)點(diǎn)度（degree）值與combined score值大小篩選核心靶點(diǎn)。

2.4.3 數(shù)據(jù)分析處理與疾病預(yù)測(cè) 構(gòu)建的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用Cytoscape軟件中的工具Network Analyzer來分析中介中心度（betweenness centrality）和節(jié)點(diǎn)度這2個(gè)重要的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)；利用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的靶基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。Bonferroni法校正后＜0.01的項(xiàng)目被認(rèn)為是顯著富集，故根據(jù)＜0.01，進(jìn)行篩選相關(guān)的生物過程（biology process，BP）、細(xì)胞組成（cellular componet，CC）、分子功能（molecular function，MF）以及KEGG富集后的主要通路。最后，將KEGG信號(hào)通路經(jīng)FDR篩選，輸入CTD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行疾病預(yù)測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 保元湯水提液化學(xué)成分鑒定

通過文獻(xiàn)綜述等方法整理出人參、黃芪、甘草、肉桂、生姜5味中藥化學(xué)成分，得到保元湯主要化學(xué)成分389種[10-11]，其中人參75種、黃芪109種、甘草162種、肉桂43種、生姜67種。通過Chemspider數(shù)據(jù)庫和Chemical Book數(shù)據(jù)庫下載保元湯主要化學(xué)成分mol格式文件，在UNIFITM1.9.4中建立了包含215種化學(xué)成分的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫。對(duì)UPLC-QTOF- MS/MS的采集數(shù)據(jù)對(duì)庫，結(jié)合本課題組內(nèi)部數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中質(zhì)譜裂解規(guī)律及對(duì)照品比對(duì)共鑒別出133個(gè)成分，保元湯水提液正、負(fù)離子模式下的總離子流圖及成分歸屬見圖1，保元湯水提液化學(xué)成分見表1，主要化學(xué)成分為皂苷和黃酮類。典型化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律如下，（1）皂苷類：化合物83（R＝22.85 min）在負(fù)離子模式下檢測(cè)得到準(zhǔn)分子離子峰為/1 153.60 [M＋HCOO]?, 1 107.598 4 [M－H]?，其二級(jí)質(zhì)譜圖（圖2-B）上可看到碎片離子/945.544 5 [M－H－Glc]?, 783.491 7 [M－H－GlcGlc]?, 621.438 5 [M－H－GlcGlcGlc]?，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，并與對(duì)照品比較，推斷化合物83為人參皂苷Rb1?；衔?3（R＝13.08 min）準(zhǔn)分子離子峰為/799.486 0 [M－H]?, 845.491 9 [M＋HCOO]?, 637.433 1 [M－H－Glc]?, 475.379 7 [M－H－GlcGlc]?，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，并與對(duì)照品比較，推斷53為人參皂苷Rg1（圖2-A）。通過以上規(guī)律可以得出皂苷的裂解以糖苷鍵的斷裂為主，類似的化合物54被推斷為Re，其余化合物類比鑒別。（2）黃酮類：化合物35（R＝7.34 min）準(zhǔn)分子離子峰為/417.119 4 [M－H]?，其二級(jí)質(zhì)譜圖上可見碎片離子/255.066 7 [M－H－Glc]?, 135.008 6, 119.049 9，結(jié)合文獻(xiàn)，糖苷鍵的斷裂和RDA裂解是黃酮類化合物的主要質(zhì)譜裂解規(guī)律，故推測(cè)135.008 6 [1, 3A]?, 119.049 9 [1, 3B]?，與對(duì)照品比對(duì)，推斷35為甘草苷（圖2-C），其余化合物依次類推得出。

A-保元湯負(fù)離子流圖 B-保元湯正離子流圖 C-混合對(duì)照品正離子流圖 D-混合對(duì)照品負(fù)離子流圖

表1 保元湯提取液化學(xué)成分信息

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

“*”表示有對(duì)照品；“?”表示該成分未查到確定碎片；表中來源用字母代表各藥材（R-人參，H-黃芪，G-甘草，S-生姜，C-肉桂）

“*”represents having standards; “?”represents no fragment; R, H, G-, S-, C, respectively.

A-人參皂苷Rg1 B-人參皂苷Rb1 C-甘草苷

3.2 保元湯水提液主要入血化學(xué)成分鑒定

前項(xiàng)研究已得保元湯水提液化合物鑒定結(jié)果，由于水提液化合物鑒別方法的色譜條件、質(zhì)譜條件等與大鼠含藥血漿中入血成分鑒定方法一致，因此保元湯水提液化合物保留時(shí)間及特征離子與血漿中入血成分?jǐn)?shù)據(jù)也高度一致，以保元湯水提液中化合物信息為基準(zhǔn)，構(gòu)建“保元湯入血成分?jǐn)?shù)據(jù)庫”，采用UNIFITM1.9.4進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，對(duì)保元湯的入血成分進(jìn)行識(shí)別（圖3），共鑒定出35個(gè)入血成分（表2），其中包括9個(gè)皂苷類、14個(gè)黃酮類、4個(gè)有機(jī)酸，8個(gè)其他類成分，對(duì)其中代表性成分中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、人參皂苷Rb1、甘草酸進(jìn)行代謝產(chǎn)物鑒定，鑒定結(jié)果見表3。

A-血漿樣品70%甲醇層正離子流圖 B-血漿樣品70%甲醇層負(fù)離子流圖

3.3 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的功效物質(zhì)及其靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和Drug bank數(shù)據(jù)庫檢索并與文獻(xiàn)比對(duì)，保元湯35個(gè)入血原型成分中共有27個(gè)入血成分能得到對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，共有193個(gè)對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)。通過Uniprot進(jìn)行基因名稱的轉(zhuǎn)化，利用Cytoscape構(gòu)建出“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），betweenness centrality和degree均大于平均值的主要成分有人參皂苷Rb1、丹皮酚、大豆異黃酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水楊酸（表4）。利用String數(shù)據(jù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），根據(jù)degree以及combined score篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，主要靶點(diǎn)分別為E1結(jié)合蛋白P300（E1A binding protein p300，EP300）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、腫瘤蛋白p53（tumor protein P53，TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，AKT1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、人磷脂酰肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（phosphatidylinositol-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）、環(huán)腺苷3′,5′-單磷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cyclic adenosine 3,5-monophosphate responsive element binding protein 1，CREB1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、周期素依賴性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）。

3.4 GO功能與KEGG通路富集分析

利用Metascape在線數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，篩選出＜0.01的GO條目346個(gè)，其中BP 199個(gè)，CC 56個(gè)及MF 91個(gè)。BP主要有對(duì)激素的反應(yīng)（response to hormone）、對(duì)異生素刺激的反應(yīng)（response to xenobioti stimulus）、對(duì)缺氧的反應(yīng)（response to hypoxia）、凋亡過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）等，CC主要涉及到膜筏（membrane raft）、胞膜小窩（caveola）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、神經(jīng)元細(xì)胞體（neuronal cell body）、突觸后膜（postsynaptic membrane）等；MF主要有酶結(jié)合（enzyme binding）、蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、蛋白質(zhì)異二聚化活性（protein heterodimerization activity）等分子功能。各取前20位制作富集氣泡圖，見圖6。

表2 保元湯入血化學(xué)成分信息

“?”表示該成分未查到確定碎片；“/”表示該成分未做網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析；“*”表示有對(duì)照品

“?”represents no MS/MS fragment; “/” represents without network pharmacological analysis; “*” represents with references.

通過KEGG富集分析得到信號(hào)通路，根據(jù)＜0.01篩選，共得到187條通路，其中主要涉及到糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-糖基化終末產(chǎn)物受體信號(hào)（receptor for advanced glycation end products，RAGE）通路（AGE-RAGE signaling pathway）、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、表皮生長(zhǎng)因子-酪氨酸激酶抑制劑抵抗（epidermal growth factor receptor，EGFR-tyrosine kinase inhibitor resistance）、雌激素信號(hào)通路（estrogen signaling pathway）、缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路（hypoxia inducible factor-1，HIF-1 signalingpathway）、松弛素信號(hào)通路（relaxin signaling pathway）、白介素-17信號(hào)通路（interleukin-17，IL-17 signaling pathway）、Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase，JAK；signal transducer and activator of transcription，STAT）（JAK-STAT signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、環(huán)鳥苷單磷酸蛋白激酶信號(hào)通路（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG signaling pathway）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）、環(huán)核苷酸信號(hào)通路（cAMP signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）等信號(hào)通路。每條通路富集多個(gè)基因，體現(xiàn)了保元湯在治療疾病過程中多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。以基因富集數(shù)目多，值大小為選擇依據(jù)，選取前20個(gè)通路制作富集氣泡圖見圖7。

表3 代表性成分代謝產(chǎn)物信息

圖4 入血成分“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

表4 保元湯中8個(gè)成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)

3.5 疾病預(yù)測(cè)

將上述String數(shù)據(jù)庫得到的KEGG信號(hào)通路再經(jīng)FDR值小于0.001篩選后得到的前5條信號(hào)通路（hsa04933：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，hsa05200：pathways in cancer，hsa05215：prostate cancer，hsa05417：lipid and atherosclerosis，hsa05161：hepatitis B）輸入到CTD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行疾病預(yù)測(cè)，共得到284種疾病，從中篩選均涉及上述5個(gè)通路的疾病共有24種：心臟衰竭、心肌病、心肌炎、心肌梗死、心肌缺血、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、乙型肝炎、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕、急性腎損傷、肺纖維化、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、肝硬化、2型糖尿病、結(jié)直腸癌、高血壓、腦缺血、黑色素瘤。

節(jié)點(diǎn)注釋：圓從小到大，相應(yīng)節(jié)點(diǎn)的顏色從深藍(lán)色-淺藍(lán)色-米色-黃色-棕色-紅棕色代表節(jié)點(diǎn)degree值從小到大；邊注釋：線從細(xì)到粗，相應(yīng)線的顏色從深藍(lán)色-淺藍(lán)色-米色-黃色-棕色-紅棕色代表combined score值從小到大

4 討論

課題組在前期的血漿前處理中，以檢測(cè)到物質(zhì)最多為標(biāo)準(zhǔn)，比較了乙腈、甲醇、異丙醇沉淀以及樣品的處理方法，最終確定血漿樣品前處理選擇4倍量甲醇沉淀蛋白，再過固相萃取小柱富集、除雜，以70%甲醇復(fù)溶后液質(zhì)進(jìn)樣分析為最佳方案。

綜合各種可參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可知，保元湯原藥材含有至少389個(gè)化學(xué)成分。運(yùn)用高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)，從保元湯水提液中共鑒定得到133個(gè)化合物。本實(shí)驗(yàn)制備的保元湯水提液符合臨床使用實(shí)際，故對(duì)保元湯進(jìn)行藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析時(shí)，基于實(shí)驗(yàn)所得133個(gè)化合物更有針對(duì)性。

圖6 GO富集分析

圖7 KEGG通路富集分析

經(jīng)多次多天大鼠ig給藥后，發(fā)現(xiàn)保元湯有35個(gè)原型成分可以被吸收入血在體循環(huán)中穩(wěn)態(tài)分布，并且在大鼠含藥血漿成分檢測(cè)中，包含35種原型成分在內(nèi)共鑒別了43個(gè)化合物，藥物吸收入血后會(huì)代謝轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，共鑒別14個(gè)代謝產(chǎn)物，其中有6個(gè)既是原型成分，也是代謝產(chǎn)物，分別為毛蕊異黃酮、大豆異黃酮、甘草素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rd、18β-甘草次酸；其余8個(gè)化合物為原型成分的代謝產(chǎn)物，因而推測(cè)其主要成分的代謝類型有葡萄糖基水解、葡萄糖醛酸水解、葡萄糖醛酸化、氫化、硫酸化、甲酯化等過程。本實(shí)驗(yàn)以入血的原型成分作為保元湯在體內(nèi)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，故以鑒別出的35個(gè)原型成分為基準(zhǔn)。

保元湯可通過人參皂苷Rb1、丹皮酚、大豆異黃酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水楊酸等8個(gè)關(guān)鍵成分作用于EP300、MAPK1、TP53、AKT1、RELA、STAT3、MAPK14、PIK3R1、TNF、CREB1、AR、CDKN1A等核心靶點(diǎn)，通過AGE-RAGE、EGFR、JAK-STAT、cGMP-PKG、cAMP、PI3K-Akt信號(hào)通路等多種途徑發(fā)揮藥效作用，推測(cè)保元湯除治療慢性心力衰竭外，還對(duì)阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥等具有潛在治療優(yōu)勢(shì)。更值得一提的是，本課題組在化合物靶點(diǎn)和通路等靶標(biāo)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)多種化學(xué)成分中既有單一成分對(duì)接多個(gè)靶點(diǎn)、又有多個(gè)類似同類成分對(duì)接同一靶點(diǎn)的情況，由此可佐證“中藥（復(fù)方）多成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用”理論與“中藥多成分單靶點(diǎn)疊加作用”假說。中藥復(fù)方能從多途徑、多靶點(diǎn)、多層次、多系統(tǒng)的對(duì)疾病進(jìn)行干預(yù)，突顯了中藥復(fù)方治療疾病的潛力和優(yōu)勢(shì)，即中藥（復(fù)方）具備“多成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用”特征。蔡少青等[26-27]提出中藥“多成分單靶點(diǎn)疊加作用”假說，認(rèn)為中藥多成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用網(wǎng)絡(luò)中局部靶點(diǎn)可存在相似多成分的藥效疊加作用。

保元湯藥效物質(zhì)關(guān)聯(lián)治療的潛能分析。保元湯作為臨床上常用的經(jīng)典名方，對(duì)心血管系統(tǒng)疾病，如慢性心力衰竭、擴(kuò)張型心肌病[28]、心肌炎、心絞痛等具有良好的效果[29-30]。通過多通路靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用，慢性心力衰竭發(fā)病與VEGF、TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)[31]以及MAPK、JAK-STAT、NF-κB等信號(hào)通路[32]相關(guān)；擴(kuò)張型心肌病的發(fā)病與MAPKs、PI3K-Akt、cGMP-PKG等通路密切相關(guān)。上述兩種疾病涉及到的信號(hào)通路與文章通過GO和KEGG功能富集得到保元湯作用主要信號(hào)通路AGE-RAGE、EGFR、JAK-STAT、cGMP-PKG、cAMP、PI3K-Akt等信號(hào)通路均相對(duì)應(yīng)，推測(cè)保元湯可能通過細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞組分調(diào)節(jié)PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE、TNF等通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等作用。

本實(shí)驗(yàn)所提示的保元湯潛在治療優(yōu)勢(shì)病種除傳統(tǒng)治療心衰外，還有23種預(yù)測(cè)疾病?！盎衔?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，保元湯中人參皂苷Rb1、丹皮酚、大豆異黃酮、刺甘草查耳酮、6-姜辣素、甘草查耳酮A、刺芒柄花素、水楊酸等8個(gè)成分的潛在作用靶點(diǎn)較多，推測(cè)它們?cè)诒Ｔ獪珜?duì)疾病的治療中發(fā)揮重要作用。有研究表明人參代表性成分人參皂苷Rb1能顯著降低心肌梗死面積，可能是通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶磷酸化、激活mTOR信號(hào)通路和調(diào)控線粒體功能實(shí)現(xiàn)；人參皂苷Rb1同時(shí)有治療阿爾茨海默病癥的潛力，人參皂苷Rb1通過改變?chǔ)?淀粉樣前體蛋白裂解途徑，減少Aβ的生成，抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性反應(yīng)；通過抑制細(xì)胞凋亡因子Bax、Caspase-3表達(dá)，激活抗細(xì)胞凋亡因子Bcl-2，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞從而改善癡呆鼠的認(rèn)知功能[33]，臣藥黃芪中主要活性成分皂苷和黃酮類，已有臨床研究證明[34]，黃芪能通過抑制氧化應(yīng)激的激活與擴(kuò)散，減輕心肌損傷，從而起到保護(hù)心肌的作用。黃芪中芒柄花素能通過抑制ERK1/2、p38及NF-κB磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；還可通過PGC-1α通路、NF-NRF-2/HO-1通路抑制高脂血癥誘導(dǎo)的炎癥，改善認(rèn)知功能[35]。毛蕊異黃素可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路及Bcl-2、Bax，增加H9c2細(xì)胞的細(xì)胞活性，并通過抑制氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡改善阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[36]。甘草中活性成分大豆苷元能通過活化ERα對(duì)MG-63細(xì)胞IL-6的表達(dá)起抑制作用[37]，IL-6是骨代謝過程中重要的調(diào)節(jié)因子，與雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失密切相關(guān)，婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，很可能是由于患者的雌激素下降致使IL-6分泌水平升高[38]。通過GO功能和KEGG富集結(jié)果顯示雌激素信號(hào)通路也是保元湯作用主要信號(hào)通路之一。也有研究表明大豆苷元有防治阿爾茨海默癥的作用及其抑制Aβ神經(jīng)毒性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[39]。此外，甘草查耳酮A抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的活化并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞自噬[40]；刺甘草查耳酮能通過抑制NLRP3炎癥小體的異?；罨瘡亩委煻喾N炎癥性疾病[41]。研究發(fā)現(xiàn)[42]6-姜酚能夠通過抑制細(xì)胞內(nèi)PDE4蛋白表達(dá)而抑制環(huán)磷腺苷水解，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，從而發(fā)揮其抗炎作用。

綜上所述，結(jié)合疾病預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)保元湯除了對(duì)臨床常規(guī)治療疾病心臟衰竭、心肌病、心肌炎、心肌梗塞、心肌缺血等心血管疾病外，還對(duì)阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、多種炎癥疾病等具有治療潛力。

因此，本研究基于UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)，明確鑒定了保元湯水提液中133個(gè)化合物，其中，皂苷類54個(gè)、黃酮33個(gè)、生物堿4個(gè)、有機(jī)酸17個(gè)、其他類25個(gè)；鑒定到入血成分35個(gè)，代謝產(chǎn)物8個(gè)，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法對(duì)保元湯入血原型成分的主要作用靶點(diǎn)及分子水平作用機(jī)制進(jìn)行探討，預(yù)測(cè)了12個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)基因，8個(gè)主要入血藥效活性成分，發(fā)現(xiàn)保元湯藥效分子機(jī)制主要涉及炎癥相關(guān)通路、氧化應(yīng)激等方面，對(duì)阿爾茨海默癥、再灌注損傷、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、多種炎癥疾病有治療潛力，本次研究可為保元湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量標(biāo)志物、擴(kuò)大臨床適應(yīng)癥等研究提供參考，進(jìn)一步拓展保元湯的臨床應(yīng)用，也可以為古代經(jīng)典名方的現(xiàn)代開發(fā)應(yīng)用提供研究方法學(xué)借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on pharmacodynamic substances and molecular mechanism of ancient classical formula Baoyuan Decoction

LI Shu-hui1, 2, WANG Ya2, TIAN Jun3, GUO Yu-xuan1, ZHANG Shu-han1, MU Yue1, WENG Xiao-gang1, SUN Yi1

1. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. School of Life Sciences and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China 3. JiangSu Wanbang Biopharmaceuticals, Xuzhou 221001, China

To elucidate the pharmacodynamic substances and the molecular mechanism of the ancient classical formula Baoyuan Decoction (BYT), in order to explore more potential clinical application advantages of BYT.The UPLC- QTOF-MS/MS technology was was used to perform gradient elution on a Waters ACQUITY UPLC-HSS T3column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) with 0.1% formic acid water (A)-acetonitrile (B) as mobile phase system. High resolution time-of-flight mass spectrometry electrospray ionization source (ESI) and positive and negative ion scanning modes were used to detect and identify the chemical components of BYT, and the prototype chemical components and metabolites in the drug-containing plasma of BYT rats after multiple and multi-day ig administration were analyzed. Furthermore, key targeting effects and the therapeutic potential of the absorbed prototype components of BYT into blood were predicted using network pharmacological methods through TCMSP database and drug information database.According to accurate relative molecular mass data and multistage mass spectrometry fragment ions, combined with reference products, databases and literature reports, a total of 133 chemical components in BYT were identified, and it was determined that 35 components could be absorbed into the blood through oral absorption to achieve stable plasma concentration after rats were given BYT by ig. The “component-target” network map of the absorbed prototype components of BYT into blood, core target gene gene ontology (GO) functional enrichment analysis, Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis, and disease prediction analysis indicated that BYT might act on mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), tumor protein p53 (TP53), signal transducer and activator of transcription and other core targets through eight key components, including ginsenoside Rb1, paeonol, formononetin, echinatin, daidzein, licochalcone A, 6-gingerol and salicylic acid, and exert medicinal effects through the signaling pathways of advanced glycation end products- receptor for advanced glycation end-products (AGE-RAGE), epidermal growth factor receptor (EGFR), janus kinase-signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT). It suggests that BYT has many potential therapeutic advantages on such as Alzheimer disease, reperfusion injury, postmenopausal osteoporosis, besides chronic heart failure. There were several derivatives of the same components in the 35 absorbed prototype components of BYT,, and one compound can dock with multiple targets, as well multiple analogues dock with the same target, which supporting the theoretical understanding of “multi-component, multi-target synergy of traditional Chinese medicine (formula)” and “multi-component, single-target superposition of traditional Chinese medicine”.Applying the UPLC-QTOF-MS/MS, network pharmacological and its database, which could provide a feasible scientific method for exploring the pharmacodynamic substances of traditional Chinese medicine (formula) and its molecular mechanism of action, as well clarifying the absorbed prototype components of BYT into blood and identifying some metabolites of some prototype components. And the target of action based on these prototype components was explained from the molecular level, and its potential therapeutic advantages were revealed, so as to provide reference for expanding the clinical application of this prescription and explore more clinical therapeutic potential.

Baoyuan Decoction; UPLC-QTOF-MS/MS; pharmacodynamic substances; molecular mechanism; network pharmacology;ginsenoside Rb1; paeonol; formononetin; echinatin; daidzein; licochalcone A; 6-gingerol; salicylic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2023)21 - 6971 - 17

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.006

2023-03-04

中國中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CI2021A04514）

李淑慧，在讀碩士，從事中藥質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。Tel: (010)64021051 E-mail: 1744140302@qq.com

通信作者：孫 奕，研究員，從事中藥化學(xué)與天然藥物化學(xué)研究。Tel: (010)64020151 E-mail: ysun@icmm.ac.cn

翁小剛，研究員，主要從事中藥復(fù)方配伍、藥動(dòng)學(xué)研究。E-mail: xgweng@icmm.ac.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]