陳祖喬,王 芳,尹濤源

缺血性心臟病具有較高的發(fā)病率和死亡率,缺血后,由手術或藥物引起的溶栓再灌注可能進一步促進心臟損害,這種現(xiàn)象稱為心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)損傷[1-2]。MI/R損傷的潛在機制尚未明確,關鍵因素包括能量代謝紊亂、氧化應激、鈣超載、心肌細胞凋亡、自噬及血管內皮細胞功能障礙[3]。在臨床上,MI/R損傷對病人的治療策略有較大影響,可能引發(fā)一系列不良并發(fā)癥,通過干預MI/R損傷后心肌內相關反應可延緩或減輕心肌損傷,是改善MI/R損傷的重要策略。

依托咪酯是一種非巴比妥類靜脈鎮(zhèn)靜藥,也是咪唑衍生物靜脈麻醉劑,通過與外周α2B受體結合,引起外周血管收縮,并在誘導麻醉期間維持穩(wěn)定的血流動力學狀態(tài)[4]。依托咪酯可避免麻醉誘導后低血壓發(fā)生,降低心肌損傷發(fā)生率,改善心臟術后病人預后[5]。相關研究表明,依托咪酯對腦缺血再灌注與MI/R損傷均有一定的保護作用[6-7]。本研究通過構建MI/R大鼠模型,觀察依托咪酯對MI/R大鼠心肌功能的作用基礎上探討可能作用的相關機制,并測定其對脂代謝的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級SD大鼠65只,雄性,6～8周齡,體質量260～300 g,由海南藥物研究所有限責任公司提供。將大鼠飼養(yǎng)于無菌動物飼養(yǎng)箱內,環(huán)境溫度22～25 ℃,相對濕度40%～50%,12 h/12 h晝夜交替,期間大鼠自由飲水、攝食。本研究通過我院倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑與材料

依托咪酯[江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司,批號:H20020511;規(guī)格:10 mL(20 mg)];酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(R&D Systems公司);總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒(北京中生生物工程公司),脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物研究所);末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(北京博奧森生物公司);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司);抗體Beclin-1、p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ(英國Abcam公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和β-actin抗體(美國Santa Cruz公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和增強型電化學發(fā)光(ECL)溶液(南京凱基生物有限公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物模型制備

大鼠消毒后,注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉麻醉,將其仰臥固定在動物實驗臺上,氣管插管并連接動物呼吸器進行機械通氣,并進行心電監(jiān)護。在大鼠左側第3肋骨、第4肋骨處約0.5 cm處剪開皮膚,進行開胸剖腹手術,剪開心包,使心臟完全暴露,使用6-0絲線穿過左冠狀動脈前降支下約2 mm作一活結結扎,阻塞左冠狀動脈前降支,結扎30 min,松開結扎線后再灌注120 min,觀察缺血時心電圖出現(xiàn)ST段抬高或T波高聳,心肌組織顏色發(fā)白,呈發(fā)紺狀,缺血區(qū)在再灌注后心電圖S-T段下移50%以上,心肌顏色逐漸恢復為紅色,提示MI/R損傷模型制備成功[8],之后立即關閉胸腔,縫合腹部切口,消毒后置于無菌動物飼養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。假手術組大鼠僅暴露心臟,不進行結扎,其余操作均相同。術后給予大鼠注射1.5 mL/kg的硫酸慶大霉素,每日1次,持續(xù)3 d,避免傷口感染。

1.4 動物分組與處理

50只SD大鼠制備MI/R模型,造模過程中有5只大鼠失敗或死亡。將45只大鼠隨機分為心肌缺血再灌注組(MI/R組)、依托咪酯低劑量組和依托咪酯高劑量組,每組15只;另取15只SD大鼠制備假手術模型,作為假手術組。術后參照文獻[7],依托咪酯低劑量組和依托咪酯高劑量組大鼠分別腹腔注射10、20 mg/kg的依托咪酯,假手術組和MI/R組注射等體積生理鹽水,每日1次,持續(xù)14 d。

1.5 心功能指標測定

給藥結束后,利用小動物BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司,批號:2014012)評估各組大鼠心功能參數(shù)變化。注射10%水合氯醛麻醉大鼠,將其固定在手術臺上,進行超聲心動圖檢查,測定射血分數(shù)(EF)、縮短分數(shù)(FS)、左室收縮末期內徑(LVESD)及左室舒張末期內徑(LVEDD)。

1.6 心肌損傷指標及脂代謝指標測定

給藥結束后,經(jīng)大鼠尾靜脈采血2 mL,室溫靜置2 h后,將采集到的各組大鼠血液置于4 ℃低溫離心機中,以4 000 r/min離心20 min,制備血清、血漿。將樣品加入各反應孔,使用大鼠特異性ELISA試劑盒檢測血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、乳酸脫氫酶(LDH)含量;按照試劑盒說明書測定TC、TG、HDL-C含量及LPL、HL活性,所有步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.7 HE染色檢測心肌組織病理變化

采血完成后,處死各組大鼠,獲取左心室心肌組織,生理鹽水沖洗干凈,并固定在4%多聚甲醛緩沖液中,固定后乙醇脫水,進行常規(guī)石蠟包埋,切片機上切成厚度約為5 μm切片,切片脫蠟水化后,HE染色法觀察心肌組織病理學變化。蘇木素染色10 min,流水沖洗掉表面多余染液,1%乙醇-鹽酸分化數(shù)秒,伊紅染色1 min,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,采用SMZ745型光學顯微鏡(日本尼康公司)觀察各組大鼠心肌組織損傷情況并采集圖片。

1.8 TUNEL檢測心肌細胞凋亡情況

將心肌組織石蠟切片在60 ℃烘箱烘烤2 h,冷卻后,置于20 μg/mL蛋白酶K中室溫孵育15 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗切片,加入50 μL TUNEL試劑液,37 ℃孵育 1 h,加入過氧化物酶轉化劑,37 ℃繼續(xù)孵育30 min,PBS清洗切片,采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察并計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù),TUNEL陽性細胞呈綠色熒光,陰性細胞不著色,顯微鏡下隨機選擇6個視野計數(shù),TUNEL陽性細胞率=(TUNEL陽性細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目)×100%。

1.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關蛋白表達

在無菌條件下將心肌組織剪碎,加入液氮研磨,采用預冷的RIPA緩沖液進行裂解,提取總蛋白樣品,參照說明書的步驟采用BCA法檢測蛋白濃度。取等量各組蛋白樣品通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質,分離后電轉移至PVDF膜上,室溫下在5%脫脂奶粉中封閉2 h,之后加入稀釋的兔抗Beclin-1(1∶1 000)、p62(1∶1 000)、LC3-Ⅰ(1∶1 000)、LC3-Ⅱ(1∶1 000)作為一抗抗體,4 ℃孵育過夜。次日,TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(1∶5 000)作為二抗抗體,室溫下孵育1 h,TBST再次洗膜,滴加增強的ECL化學發(fā)光液顯色曝光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,通過Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件對各蛋白條帶進行分析,以β-actin作為內參對各蛋白條帶的灰度進行定量。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 依托咪酯對MI/R大鼠心功能的影響

與假手術組比較,MI/R組大鼠EF和FS降低,LVESD和LVEDD升高(P<0.05);相較于MI/R組,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05)。詳見圖1、表1。

表1 各組大鼠心功能指標EF、FS、LVESD及LVEDD比較(±s)

圖1 各組大鼠超聲心動圖圖像

2.2 依托咪酯對MI/R大鼠血清心肌損傷標志物水平的影響

與假手術組比較,MI/R組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH含量均升高(P<0.05);相較于MI/R組,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組血清CK-MB、cTnI、LDH含量均下降(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組CK-MB、cTnI、LDH含量均下降(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH含量比較(±s)

2.3 依托咪酯對MI/R大鼠心肌組織病理變化的影響

HE染色結果顯示,假手術組大鼠心肌細胞核排列整齊,結構清晰,心肌纖維緊密,未觀察到心肌纖維或膠原組織增生;MI/R組大鼠心肌細胞排列紊亂,心肌纖維變大,膠原組織增生,多數(shù)心肌纖維斷裂,有大量炎性細胞浸潤;與MI/R組比較,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組心肌細胞和心肌纖維損傷程度均減輕,其中依托咪酯高劑量組大鼠心肌組織病理現(xiàn)象改善更顯著。詳見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學變化(HE染色)

2.4 依托咪酯對MI/R大鼠心肌細胞凋亡的影響

與假手術組比較,MI/R組大鼠心肌組織染色細胞較多,TUNEL陽性細胞比例升高(P<0.05),說明凋亡細胞增加;與MI/R組比較,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組大鼠心肌組織中染色細胞減少,TUNEL陽性細胞比例均下降(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組染色細胞減少,TUNEL陽性細胞比例下降(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠心肌細胞凋亡圖

圖4 各組大鼠心肌細胞凋亡陽性率比較的柱狀圖(MI/R組與假手術組比較,＊P<0.05;與MI/R組比較,#P<0.05;與依托咪酯低劑量組比較,△P<0.05)

2.5 依托咪酯對MI/R大鼠心肌組織自噬的影響

與假手術組比較,MI/R組大鼠心肌組織中Beclin-1蛋白表達上調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,p62蛋白表達下調(P<0.05);與MI/R組比較,依托咪酯低劑量組、依托咪酯高劑量組大鼠心肌組織中Beclin-1蛋白表達下調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,p62蛋白表達上調(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組心肌組織中Beclin-1蛋白表達下調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降(P<0.05)。詳見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織中自噬相關蛋白表達(A為各組自噬相關蛋白條帶圖;B為各組Beclin-1蛋白表達比較柱狀圖;C為各組p62蛋白表達比較柱狀圖;D為各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較柱狀圖。a為假手術組;b為MI/R組;c為依托咪酯低劑量組;d為依托咪酯高劑量組。與假手術組比較,＊P<0.05;與MI/R組比較,#P<0.05;與依托咪酯低劑量組比較,△P<0.05)

2.6 依托咪酯對MI/R大鼠脂代謝的影響

與假手術組比較,MI/R組大鼠血清TC、TG濃度升高,HDL-C濃度、血漿LPL和HL含量降低(P<0.05);與MI/R組比較,依托咪酯低劑量組和依托咪酯高劑量組大鼠血清TC、TG濃度降低,HDL-C濃度、血漿LPL和HL含量升高(P<0.05);與依托咪酯低劑量組比較,依托咪酯高劑量組大鼠血清TC、TG濃度降低(P<0.05),HDL-C濃度、血漿LPL和HL含量升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠TC、TG、HDL-C、LPL、HL含量比較(±s)

3 討 論

MI/R是一種常見的病理現(xiàn)象,涉及心肌代謝紊亂和結構重塑。闡明MI/R的潛在機制并探索MI/R的有效治療策略,是臨床中攻克的難點之一。本研究通過冠狀動脈結扎法構建MI/R大鼠模型,觀察依托咪酯在大鼠MI/R損傷中的作用,并初步探究其機制。

大量研究表明,依托咪酯在多種疾病手術中發(fā)揮著有益作用。Li等[9]在脛骨骨折手術中使用依托咪酯進行麻醉,可抑制下肢缺血/再灌注損傷所致的氧化應激反應,并降低炎性因子水平。徐召溪等[10]研究顯示,依托咪酯可增加大鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活,其機制可能與降低細胞內Ca2+水平、抑制蛋白激酶C(PKC)/核轉錄因子(NF)-κB信號通路相關。已有研究表明,依托咪酯對缺血再灌注大鼠的心肌損傷可發(fā)揮保護作用[7]。本研究結果顯示,經(jīng)依托咪酯治療的MI/R大鼠EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低,血清心肌損傷標志物CK-MB、cTnI及LDH含量均下降,心肌病理學改變得到改善,進一步明確依托咪酯具有減輕MI/R損傷、改善心功能的作用。

自噬是一種高度保守的機制,在代謝壓力下觸發(fā)降解細胞質大分子物質或細胞器,可為自身提供能量,是細胞內蛋白質質量控制系統(tǒng)的主要組成部分之一,也是細胞中普遍存在的降解機制,可去除受損的細胞器,維持細胞穩(wěn)態(tài)[11]。在各種病理情況下,包括各種缺血再灌注損傷,相關器官組織可迅速誘導自噬發(fā)生。在基礎狀態(tài)下,自噬可維持心肌細胞的活性與結構,從而維持心臟發(fā)揮正常功能。短暫的缺氧應激可誘導自噬增強,通過回收受損的細胞器和蛋白質促進細胞存活。然而,長時間缺氧和再灌注導致過度自噬,引起心肌細胞死亡[12-13],因此,抑制MI/R引起的過度自噬可能是預防MI/R損傷的有效目標。Luo等[14]研究顯示,京尼平苷可減小大鼠心肌梗死面積,改善心功能,其機制可能與抑制自噬與激活蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路有關。Zuo等[15]研究顯示,川芎嗪降低了MI/R大鼠和H/R心肌細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與Beclin-1表達,通過調控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Bcl-2信號級聯(lián)反應,緩解自噬功能障礙,從而對MI/R發(fā)揮保護作用。Beclin-1是自噬的關鍵調節(jié)劑,在其啟動和進程中均發(fā)揮著重要作用,通過激活各種細胞信號通路調控自噬發(fā)生。存在于細胞質中的p62與經(jīng)泛素化蛋白結合,與LC3-Ⅱ結合形成復合物,在溶酶體內發(fā)生降解。本研究結果與上述結果一致,經(jīng)過依托咪酯治療后,MI/R大鼠中Beclin-1表達下調,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,且p62蛋白表達上調,說明依托咪酯抑制了MI/R后誘導的心肌細胞過度自噬,從而發(fā)揮心肌保護功能。

越來越多的研究表明,MI/R損傷涉及多項生物過程和信號傳導途徑,如細胞內鈣超載、活性氧積累、心肌細胞凋亡及炎癥反應等。MI/R損傷發(fā)生后,在缺血缺氧刺激下,細胞核內凋亡相關蛋白基因呈高表達,進一步促進細胞凋亡發(fā)生[16]。心肌細胞正常的凋亡程序被擾亂,導致心臟重塑,引起心功能衰竭[17],因此,在改善MI/R損傷中抑制心肌細胞凋亡是一個關鍵環(huán)節(jié)。本研究結果顯示,通過依托咪酯治療的MI/R大鼠心肌組織內TUNEL染色細胞減少,說明依托咪酯可能抑制了MI/R大鼠心肌細胞凋亡。

在心肌缺血條件下,由于管腔變窄及心臟對氧氣需求的增加,可能引起心肌代謝變化,脂代謝紊亂是MI/R過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象之一。心肌缺血可抑制脂肪酸代謝,而非酯化脂肪酸水平升高。隨著有害產(chǎn)物的積累,脂酰輔酶A合成酶受到抑制,心肌組織內脂肪酸水平上升,脂肪酸攝取下降[18-19]。有研究顯示,心肌缺血后血清非酯化脂肪酸增高,心肌組織內含量隨之升高[20]。本研究結果顯示,MI/R大鼠經(jīng)過依托咪酯治療后,血清TC、TG濃度降低,HDL-C濃度、血漿LPL和HL含量升高。LPL和HL為脂蛋白代謝過程中關鍵的兩種酶,LPL活性升高可降低TG、LDL水平以預防高脂血癥;LPL和HL均可催化水解微粒中的TG[21-22]。

綜上所述,依托咪酯通過抑制大鼠MI/R誘導的心肌細胞過度自噬,改善心肌功能,減少心肌損傷,調節(jié)血脂代謝。這些發(fā)現(xiàn)為臨床應用依托咪酯治療MI/R損傷提供了實驗依據(jù)。關于依托咪酯對MI/R的保護機制需在今后的工作中繼續(xù)深入探討。