尤紅俊,趙倩倩,茍棋玲,董夢(mèng)雅

特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病(pediatric idiopathic dilated cardiomyopathy,PIDC)是兒童常見的心肌病,是造成兒童心力衰竭的主要原因之一,同時(shí)導(dǎo)致惡性心律失常、血栓栓塞和猝死在內(nèi)的一系列不良結(jié)局。目前小兒擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)的早期診治水平不斷提高,但病因不明、缺乏精準(zhǔn)治療,此類患兒預(yù)后不容樂觀[1-2]。本研究基于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus,GEO)中PIDC的二代測(cè)序數(shù)據(jù),尋找疾病的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),通過基因本體(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析探討發(fā)病機(jī)制,并構(gòu)建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò),篩選其中的核心基因,整合其與心肌病及心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,輔以免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析,尋找疾病發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因,為疾病的精準(zhǔn)靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及預(yù)處理

在GEO[3-4]中搜索“pediatric idiopathic dilated cardiomyopathy”,選取數(shù)據(jù)集GSE99321,其由美國(guó)科羅拉多大學(xué)藥理學(xué)系Tatman P等科研人員免費(fèi)提供,采用GPL16791 Illumina HiSeq 2500 (Homo sapiens)為平臺(tái),收錄14例小兒左心室組織二代測(cè)序數(shù)據(jù),其中7例小兒PIDC作為試驗(yàn)組,另7例無心力衰竭小兒作為對(duì)照組。數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化預(yù)處理。

1.2 差異表達(dá)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件R語(yǔ)言(版本4.1.1)“DESeq2”[5]包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。以|log2(fold change)|≥1,P<0.05為DEGs的篩選條件。運(yùn)用R語(yǔ)言ggplot2和pheatmap包繪制火山圖和熱圖,進(jìn)行DEGs可視化分析。

1.3 GO功能富集和KEGG通路富集分析

使用R語(yǔ)言clusterProfiler和org.Hs.eg.db(Homo sapiens)包對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析[6-7]。GO富集分析分別在生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)三方面對(duì)基因進(jìn)行功能注釋[8]。KEGG分析展示基因參與的信號(hào)通路。利用R語(yǔ)言ggplot2包將結(jié)果可視化。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將DEGs導(dǎo)入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,http://string-db.org/cgi/input.pl),進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析[9]。設(shè)定可信度confidence為0.4,輸出TSV格式文件,用于Cytoscape分析[10]。

1.5 核心基因篩選

使用Cytoscape 3.7.3 軟件插件CytoHubba篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。CytoHubba利用12種評(píng)分策略剖析PPI網(wǎng)絡(luò),包括最大相關(guān)準(zhǔn)則(maximum correlation criterion,MCC)、度值(Degree值)等,該12種拓?fù)渌惴o優(yōu)劣之分[11]。MCC代表基因/蛋白間最大相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn),以MCC值排序,居前5位的基因?yàn)镻PI網(wǎng)絡(luò)的核心基因。

1.6 利用CTD數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估核心基因與心肌病和心力衰竭的關(guān)聯(lián)性

利用比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(comparative toxicogenomics database,CTD)(http://ctdbase.org/)分析核心基因與心肌病及心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。CTD整合了化合物-基因/蛋白質(zhì)相互作用、化合物-疾病和基因-疾病關(guān)系的信息,探索與疾病機(jī)制相關(guān)的假設(shè)[12]。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)[13]根據(jù)表達(dá)譜計(jì)算每個(gè)基因的rank值,分析得到每個(gè)樣本的免疫細(xì)胞的相對(duì)含量,有助于了解疾病狀態(tài)下組織中所有免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況,探討其與疾病轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。采用ssGSEA算法分析PIDC中28種免疫細(xì)胞在免疫浸潤(rùn)微環(huán)境中的比例。運(yùn)用R語(yǔ)言pheatmap包和vioplot包繪制熱圖和小提琴圖進(jìn)行可視化免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因差異表達(dá)分析

對(duì)原始矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理(見圖1A、圖1B)后,與對(duì)照組比較,PIDC左心室組織中有137個(gè)DEGs,其中70個(gè)表達(dá)上調(diào)、67個(gè)表達(dá)下調(diào)。對(duì)DEGs繪制火山圖進(jìn)行可視化分析(見圖1C)。取差異顯著前100個(gè)基因繪制熱圖(見圖1D)。

圖1 PIDC基因差異表達(dá)分析(A為原始矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理前;B為原始矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理后;C為基因差異表達(dá)分析火山圖;D為基因差異表達(dá)分析熱圖。其中紅色表示上調(diào);藍(lán)色表示下調(diào))

2.2 DEGs富集分析

GO功能富集分析顯示:DEGs主要參與對(duì)外部刺激的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、中性粒細(xì)胞的激活和介導(dǎo)的免疫、細(xì)胞-基質(zhì)黏附的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)等。詳見圖2A。KEGG通路富集分析顯示:DEGs參與細(xì)胞凋亡、胰島素抵抗、花生四烯酸代謝和缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信號(hào)通路等。詳見圖2B。

圖2 GO功能富集和KEGG通路富集分析氣泡圖(A為GO富集分析;B為KEGG富集分析)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心基因篩選

對(duì)DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,將離散節(jié)點(diǎn)隱去后,構(gòu)建的初始PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(基因/蛋白)135個(gè)、邊(蛋白互作關(guān)系)186條,平均節(jié)點(diǎn)度值為2.76,PPI富集P值<1.0e-16。輸出TSV格式文件并導(dǎo)入Cytoscape軟件,以CytoHubba插件進(jìn)行拓?fù)溆?jì)算,取MCC排名居前5位的基因作為核心基因,即信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activitor of transcription 3,STAT3)、CD68、高親和力IgE受體γ亞基基因(high-affinity IgE receptor gamma subunit gene,FCER1G)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1,CCND1)和CD163。亮色標(biāo)記的節(jié)點(diǎn)為核心基因,顏色深淺代表MCC值大小,共36個(gè)節(jié)點(diǎn)、100個(gè)邊,詳見圖3A。以分組比較呈現(xiàn)兩組5個(gè)核心基因的差異表達(dá),詳見圖3B。

圖3 差異基因構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)中鑒定核心基因及分組比較(A為鑒定核心基因;B為分組比較柱狀圖。＊P<0.05,＊＊P<0.01。色彩鮮明的節(jié)點(diǎn)為5個(gè)核心基因)

2.4 核心基因與心肌病、心力衰竭的關(guān)系

核心基因與心肌病、心力衰竭的相互作用評(píng)分分析提示,5個(gè)核心基因STAT3、CD68、FCER1G、CCND1和CD163與心肌病、心力衰竭關(guān)聯(lián)緊密。詳見圖4?？梢姾诵幕蚺c心肌病、心力衰竭關(guān)聯(lián)性得分情況,得分越高提示關(guān)聯(lián)性越大。

2.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

與對(duì)照組比較,試驗(yàn)組左心室組織中央記憶型CD8+T細(xì)胞含量較高,活化的樹突樣細(xì)胞、骨髓來源的抑制性細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞含量較低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5、圖6。圖中紅色表示上調(diào),藍(lán)色表示下調(diào)。

圖5 PIDC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析熱圖

圖6 PIDC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析小提琴圖

3 討 論

PIDC具有較高的發(fā)病率、死亡率,是小兒心臟移植的主要原因之一,嚴(yán)重威脅兒童身心健康。該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,尚未明確,因而治療難度較大。本研究基于生物信息學(xué)分析,探討免疫相關(guān)的分子機(jī)制,并篩選出核心基因及浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞,從而為探討疾病機(jī)制、尋求治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

首先,本研究發(fā)現(xiàn)PIDC左心室組織中存在137個(gè)DEGs。其次,GO功能富集和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs的功能主要集中在對(duì)外部刺激的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、中性粒細(xì)胞的激活和介導(dǎo)的免疫、細(xì)胞-基質(zhì)黏附的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)等;這些差異基因主要富集在細(xì)胞凋亡、胰島素抵抗、花生四烯酸代謝和HIF-1信號(hào)通路等。免疫介導(dǎo)的炎癥損傷是DCM發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵過程之一[14]。已有研究報(bào)道,炎癥反應(yīng)由凋亡分子Fas配體(Fas ligand,FasL)通過心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular-signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)被激活,最終誘導(dǎo)DCM和心力衰竭的發(fā)生。阻斷ERK1/2通路、抑制炎癥等可阻止疾病的進(jìn)展[15]。有研究顯示,DCM中炎癥趨化因子水平顯著升高[16]。中性粒細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的重要參與者,其水平的高低與DCM心力衰竭的嚴(yán)重程度相關(guān)[17]。心臟細(xì)胞外基質(zhì)是一個(gè)動(dòng)態(tài)分子網(wǎng)絡(luò),為心臟功能提供結(jié)構(gòu)支撐。細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的改變、細(xì)胞外基質(zhì)重塑被認(rèn)為是心肌擴(kuò)張過程中細(xì)胞重構(gòu)的重要組成部分[18-19]。細(xì)胞外基質(zhì)重塑通過影響細(xì)胞歸巢、成纖維細(xì)胞激活、局部黏附蛋白表達(dá)參與DCM等,導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生發(fā)展[20]。

同時(shí)本研究結(jié)果顯示,細(xì)胞凋亡是PIDC發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵致病因素之一。轉(zhuǎn)錄因子p53是人體重要的管家基因,可維持正常的心臟結(jié)構(gòu)和生理功能。已有研究報(bào)道,p53水平升高促進(jìn)DCM中的心臟重構(gòu),這可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯實(shí)現(xiàn)的[21]。有研究顯示,基因PPP1R13L雙等位變異與PIDC強(qiáng)烈相關(guān),而PPP1R13L的功能是編碼p53蛋白的促凋亡蛋白抑制劑[22]。阿霉素作為一種化療藥物,可提高腫瘤病人生存率,但其誘導(dǎo)DCM的作用也有報(bào)道,認(rèn)為這種不良反應(yīng)是阿霉素通過增加線粒體膜通透性,進(jìn)而增加心肌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的[23]。本研究結(jié)果顯示,胰島素抵抗在PIDC中有致病作用。胰島素抵抗通過增加游離脂肪酸氧化,造成心肌細(xì)胞能量代謝障礙,促進(jìn)DCM的形成;反之,DCM通過促炎細(xì)胞因子釋放、兒茶酚胺等激素釋放,交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活,進(jìn)一步加重胰島素抵抗[24]。上述研究均提示,干預(yù)細(xì)胞凋亡和胰島素抵抗可能成為PIDC的治療方向。有研究顯示,花生四烯酸CYP450酶代謝的產(chǎn)物可能在克山病和DCM的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,如CYP2C19基因上調(diào)和蛋白表達(dá)頻繁可能是一種保護(hù)性補(bǔ)償反應(yīng),而CYP1A1可能加重心肌損傷[25]。本研究富集分析結(jié)果顯示,差異基因顯著參與花生四烯酸代謝通路,提示該通路可能作為PIDC心力衰竭治療的靶點(diǎn)[26]。HIF-1是缺氧/缺血血管反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,驅(qū)動(dòng)數(shù)百個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄激活,涉及血管反應(yīng)、血管生成及骨髓源性血管生成細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢[27]。特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病表現(xiàn)為血管生成缺陷,且心外膜血管疏松與HIF-1增加相關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因以下調(diào)方式參與HIF-1信號(hào)通路中,提示該通路可能被抑制。干預(yù)HIF-1信號(hào)通路,可影響心肌血管生成,可能是PIDC的治療靶點(diǎn)之一。

其次,本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選了5個(gè)與心肌病及心力衰竭關(guān)系密切的核心基因。STAT3是對(duì)心臟具有保護(hù)作用的轉(zhuǎn)錄因子,STAT3的激活通過增強(qiáng)心肌細(xì)胞的預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)、抗炎、誘導(dǎo)生存基因表達(dá)、維持線粒體功能等多種方式發(fā)揮心臟保護(hù)作用。既往研究顯示,STAT3通路的下調(diào)可誘發(fā)DCM的心肌不良重構(gòu)[29]。有研究表明,心肌細(xì)胞特異性STAT3通過維持肌萎縮蛋白和α-肌聚糖的表達(dá)水平,防止擴(kuò)張表型的發(fā)生和發(fā)展[30]。本研究發(fā)現(xiàn)STAT3的水平在PIDC中是顯著下調(diào)的。CD68是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志,目前關(guān)于其在心肌病和心力衰竭中作用的研究結(jié)果存在爭(zhēng)議。有研究顯示,巨噬細(xì)胞作為炎癥過程的重要參與者,其在慢性炎癥的心力衰竭病人中水平顯著升高[31]。相關(guān)研究顯示,與健康對(duì)照組相比,DCM病人心肌細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞數(shù)量無顯著變化[32-33]。CD163是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志,其在DCM中的研究結(jié)果存在爭(zhēng)議。有研究報(bào)道,CD163陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的增加與DCM病人較差的預(yù)后顯著相關(guān),是心肌組織中膠原含量的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,可能參與DCM的心室重塑[34]。有研究顯示,CD163水平與DCM的嚴(yán)重程度無關(guān)[35]。本研究分析發(fā)現(xiàn)CD68和CD163的水平在PIDC病人中均是降低的。這些結(jié)果提示巨噬細(xì)胞可能通過復(fù)雜的機(jī)制參與PIDC的發(fā)生發(fā)展,仍需進(jìn)一步研究。FCER1G作為固有免疫基因,參與炎癥通路,誘導(dǎo)多種疾病發(fā)生[36]。一項(xiàng)體細(xì)胞和單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的綜合分析發(fā)現(xiàn),FCER1G參與DCM的免疫過程[37],其與DCM或心力衰竭的關(guān)系,在這2種疾病病理生理狀態(tài)中的作用仍待進(jìn)一步研究。CCND1是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白,促進(jìn)細(xì)胞周期從DNA合成前期(G1期)到DNA復(fù)制期(S期)的轉(zhuǎn)換,其水平的上調(diào)參與多種腫瘤的進(jìn)展[38]。基因肌聯(lián)蛋白(TTN)的功能是編碼肌節(jié)中最大的結(jié)構(gòu)蛋白,其截段突變導(dǎo)致TTN缺乏是家族性和散發(fā)性DCM的主要原因。Liao等[39]研究顯示,CCND1上調(diào)可抑制TTN缺乏引起的DCM,結(jié)果提示TTN不足導(dǎo)致DCM促進(jìn)心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期治療,CCND1是其中一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)。核心基因在PIDC的發(fā)病機(jī)制仍待研究,可能成為治療PIDC和DCM的新靶點(diǎn)。

最后,本研究進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,試驗(yàn)組6種細(xì)胞含量有顯著差異。CD8+T細(xì)胞在PIDC的心肌組織中含量升高。Luppi等[40-41]研究顯示,DCM病人心肌組織中有CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。Rao等[42]進(jìn)一步研究提示,增多的CD8+T細(xì)胞主要位于纖維化的心肌中。上述研究結(jié)果提示CD8+T細(xì)胞在PIDC的發(fā)病機(jī)制,特別在心室重構(gòu)中發(fā)揮著重要的致病作用。DCM和心力衰竭病人中樹突樣細(xì)胞減少[32,43]。本研究分析發(fā)現(xiàn)樹突樣細(xì)胞在PIDC的心肌組織中含量降低。關(guān)于骨髓來源的抑制性細(xì)胞與DCM的研究較少,Zhang等[44]研究顯示,DCM病人循環(huán)中數(shù)量顯著升高,且與N末端腦鈉肽前體呈正相關(guān),與左室射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。本研究分析發(fā)現(xiàn),骨髓來源的抑制性細(xì)胞在PIDC病人心肌組織中減少,不一致的研究結(jié)果提示其在DCM發(fā)生發(fā)展中的作用有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn),PIDC心肌組織中自然殺傷T細(xì)胞含量減少。有研究顯示,自然殺傷T細(xì)胞在DCM中含量降低[45]。已有基礎(chǔ)研究顯示,DCM小鼠脾臟中自然殺傷T細(xì)胞數(shù)量減少,補(bǔ)充外源性的樹突樣細(xì)胞可激活體內(nèi)的自然殺傷T細(xì)胞,延長(zhǎng)DCM小鼠生存,預(yù)防心臟收縮功能下降,抑制間質(zhì)纖維化[46]。這些結(jié)果提示免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)治療可能成為治療DCM的新策略。

綜上所述,炎癥及免疫反應(yīng)在PIDC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,5個(gè)核心基因和6種免疫細(xì)胞與PIDC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),是其防治的潛在靶點(diǎn)。本研究對(duì)PIDC關(guān)鍵基因及信號(hào)通路進(jìn)行了分子機(jī)制探討,并輔以免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析,后期仍需進(jìn)一步深入探討免疫浸潤(rùn)細(xì)胞與關(guān)鍵基因或通路的關(guān)聯(lián)性。