吳遠(yuǎn)波，張鴻，劉宇政，焦?jié)?，冷紅文，吳克勤，吳靚

（1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，江西南昌，330006；2.丹東市市場(chǎng)監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部，遼寧丹東，118002）

0 引言

2021年2月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局在《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（ 以下簡(jiǎn)稱《技術(shù)要求》）［1］中，首次以官方文件的形式提出了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的概念：“標(biāo)準(zhǔn)湯劑系遵循中醫(yī)藥理論，按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮，固液分離，經(jīng)適當(dāng)濃縮制得并經(jīng)適宜方法干燥制得，為衡量單味中藥配方顆粒是否與其相對(duì)應(yīng)的單味中藥飲片臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準(zhǔn)?！痹谥兴幣浞筋w粒的研制過程中，標(biāo)準(zhǔn)湯劑起到了重要的橋連作用，中藥配方顆粒的所有藥學(xué)研究均須與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行對(duì)比。

草豆蔻為姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadaiHayata）的干燥近成熟種子［2，3］，具有燥濕行氣、溫中止嘔的功效，用于寒濕內(nèi)阻、脘腹脹滿冷痛、曖氣嘔逆、不思飲食［2］。草豆蔻主要含有揮發(fā)油、黃酮、二苯庚烷等［4，5］，具有保護(hù)胃黏膜、抗胃潰瘍、促胃腸動(dòng)力、鎮(zhèn)吐、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用［5］。本研究選用主產(chǎn)區(qū)且符合藥典要求的10批草豆蔻飲片制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，以山姜素、喬松素為指標(biāo)成分，并進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算兩成分的含量轉(zhuǎn)移率［6］，測(cè)定各批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油含量并計(jì)算其轉(zhuǎn)移率，測(cè)定出膏率，并以標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，為草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為物質(zhì)基準(zhǔn)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

1.1.1 儀器

Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher 公司，包括四元梯度泵，WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-3000RS柱溫箱，DAD-3000檢測(cè)器）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）； EX125ZH電子天平（奧豪斯儀器有限公司，感量0.01mg）；LE204E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器〈上?！涤邢薰?，感量0.1mg）；CP213電子天平（奧豪斯儀器有限公司，感量 1mg）；SZCL-3A型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DKM610C干燥箱（重慶雅馬拓科技有限公司）；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.1.2 試劑與樣品

試藥：山姜素對(duì)照品（批號(hào)：PS010886，純度大于98%）、喬松素（批號(hào)：PS010411，純度大于98%）、小豆蔻明對(duì)照品（批號(hào)：PS000964，純度大于98%）、榿木酮對(duì)照品（批號(hào)：PS010412，純度大于98%）、草豆蔻對(duì)照藥材（批號(hào)：PS030099），均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司。乙腈和甲醇為色譜純，水為怡寶純凈水，甲醇及無(wú)水乙醇等其他試劑均為分析純。

樣品：10批不同來(lái)源草豆蔻飲片，經(jīng)丹東市市場(chǎng)監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部焦?jié)鞴苤兴帋熻b定為草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）的干燥近成熟種子，草豆蔻信息見表1。

表1 10 批草豆蔻來(lái)源信息表

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 草豆蔻飲片的檢測(cè)

取草豆蔻飲片按《中國(guó)藥典》2020年版一部“草豆蔻”飲片項(xiàng)下［2］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果符合藥典規(guī)定。

1.2.2 草豆蔻飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備［7-9］

取草豆蔻飲片，搗碎，稱取100.0g，加8倍量水浸泡30min，接揮發(fā)油提取器回流提取2h，接出揮發(fā)油，水提液趁熱過濾，在藥渣中再加6倍量水，接揮發(fā)油提取器回流提取30min，接出揮發(fā)油，水提液趁熱過濾，合并兩次濾液［10］，減壓濃縮至適量，將2次提取的揮發(fā)油合并，加入濃縮液中，定容至500mL，充分搖勻，得到規(guī)格為0.2g/mL的草豆蔻飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

1.2.3 草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指標(biāo)成分含量測(cè)定

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（60：40）；檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為5μL。該色譜條件下，供試品溶液各指標(biāo)成分峰分離良好，見圖1。

圖1 山姜素對(duì)照品與喬松素對(duì)照品（A）、草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑（B）HPLC圖

1.2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

取適量山姜素、喬松素對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含山姜素40μg、喬松素40μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

1.2.3.3 供試品溶液的制備

取草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑搖勻，精密量取1mL，置于10mL量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至接近刻度，超聲處理（功率500W，頻率40KHz）10min，冷卻，用無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得［11，12］。

1.2.3.4 線性關(guān)系考察

取適量山姜素、喬松素對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含山姜素100.0μg、喬松素105.6μg的混合對(duì)照品溶液。精密吸取該溶液配成系列濃度的對(duì)照品溶液，按“1.2.3.1”項(xiàng)下選定的條件測(cè)定，進(jìn)樣5μL，記錄峰面積。以每個(gè)對(duì)照品的進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到2個(gè)成分的線性回歸方程及線性范圍，見表2。

表2 山姜素、喬松素的線性回歸方程及線性范圍

1.2.3.5 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份對(duì)照品溶液5μL，按“1.2.3.1”項(xiàng)下選定的條件，連續(xù)進(jìn)行6次的進(jìn)樣測(cè)定，記錄2個(gè)指標(biāo)成分的峰面積。山姜素、喬松素的峰面積的RSD分別為0.8%、0.9%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.2.3.6 重復(fù)性

取同一批樣品（批號(hào)：2302001），按“1.2.3.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液6份，按“1.2.3.1”項(xiàng)下選定的條件進(jìn)行測(cè)定，記錄山姜素、喬松素的峰面積，計(jì)算2個(gè)指標(biāo)成分的含量。結(jié)果顯示，山姜素的平均含量為0.31mg/mL，RSD為1.0%；喬松素的平均含量為0.31mg/mL，RSD為0.9%。結(jié)果表明該含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

1.2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑同一份供試品溶液，分別在制備后0h、4h、8h、12h、24h，按“1.2.3.1”項(xiàng)下選定的條件進(jìn)樣5μL，記錄2個(gè)指標(biāo)成分的峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。計(jì)算得山姜素、喬松素的峰面積的RSD分別為1.3%、1.4%。結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取6份已知含量的樣品（批號(hào)：2302001）搖勻，取6份，每份精密量取0.5mL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中山姜素、喬松素的含量按1：1的比例添加對(duì)照品［6］（山姜素159.9μg、喬松素160.1μg），按“1.2.3.3”項(xiàng)下的方法制備，按“1.2.3.1”項(xiàng)下選定的條件測(cè)定，計(jì)算得山姜素平均回收率為103.6%，RSD為1.8%；喬松素平均回收率為101.1%，RSD為1.2%。結(jié)果表明本法具有良好的回收率。

1.2.3.9 樣品測(cè)定

取10批草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，精密量取1mL，按“1.2.3.3”項(xiàng)下的方法制備，按“1.2.3.1”項(xiàng)下選定的條件測(cè)定，記錄山姜素、喬松素的峰面積，計(jì)算10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中山姜素和喬松素的含量。結(jié)果見表3。

表3 草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑山姜素、喬松素含量及轉(zhuǎn)移率

1.2.4 指標(biāo)成分及揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率和出膏率

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中山姜素和喬松素的含量測(cè)定結(jié)果，計(jì)算兩個(gè)指標(biāo)成分的含量轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中揮發(fā)油含量測(cè)定結(jié)果，計(jì)算揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表4。

表4 草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果

出膏率測(cè)定方法：取草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，搖勻，精密吸取10mL置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，取出，置于干燥器中冷卻30min，稱定重量［13，14］。出膏率結(jié)果見表4。

1.2.5 草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜測(cè)定

1.2.5.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～45min，40%～52%A；45～60min，52%～100%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為262nm，柱溫為40℃，流速為0.8mL/min；進(jìn)樣量為10μL?；旌蠈?duì)照品與標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖見圖2。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)［2，15］，并比對(duì)對(duì)照品色譜圖，判別1、2、6、8號(hào)峰分別為山姜素、喬松素、小豆蔻明和榿木酮。以保留時(shí)間適中、出峰穩(wěn)定、有對(duì)照品的2號(hào)峰（喬松素）為參照峰（S），計(jì)算草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑中主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積［16］。

1.2.5.2 參照物溶液的制備

取山姜素、喬松素、小豆蔻明和榿木酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含山姜素40μg、喬松素40μg、小豆蔻明20μg、榿木酮20μg的混合溶液，即得對(duì)照品參照物溶液。取草豆蔻對(duì)照藥材0.5g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，超聲處理（功率500W，頻率40KHz）30min，放冷［17］，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得對(duì)照藥材參照物溶液。

1.2.5.3 供試品溶液的制備

取“1.2.3.3”項(xiàng)制得的溶液，即得。

1.2.5.4 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑同一份供試品溶液10μL，按“1.2.5.1”項(xiàng)下選定的條件，連續(xù)進(jìn)行6次進(jìn)樣測(cè)定，記錄液相色譜圖。以喬松素峰為參照，求得其余7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.5%，相對(duì)峰面積RSD＜5%，這表明精密度較好。

1.2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，按“1.2.3.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.5.1”項(xiàng)下選定的條件進(jìn)行測(cè)定。以喬松素峰為參照，求得其余7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.5%，相對(duì)峰面積RSD＜5%，這表明重復(fù)性良好。

1.2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑（同一份供試品溶液），分別于制備后0h、4h、8h、12h、24h，按“1.2.5.1”項(xiàng)下選定的條件進(jìn)樣10μL。以喬松素峰為參照，求得其余7個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.5%，相對(duì)峰面積RSD＜5%，這表明標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.5.7 樣品測(cè)定與分析

取10批草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按“1.2.3.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“1.2.5.1”項(xiàng)下選定的條件進(jìn)行測(cè)定，記錄10批色譜圖，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版）”進(jìn)行分析［18］，生成對(duì)照指紋圖譜，具體見圖3、圖4。10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度依次為0.978、0.934、0.969、0.987、0.984、0.988、0.989、0.991、0.930、0.920。草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜中確定了8個(gè)共有峰，10批草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度均＞0.9［16］。

圖3 10批草豆蔻飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S1～S10）的高效液相指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜（R）

圖4 草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜

1.2.5.8 對(duì)照藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜比較

取對(duì)照藥材參照物溶液，按“1.2.5.1”項(xiàng)下選定的條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見圖5。結(jié)果顯示，對(duì)照藥材具有與標(biāo)準(zhǔn)湯劑相同的8個(gè)共有峰，表明兩者化學(xué)成分無(wú)明顯變化，具有一定的等效性與相關(guān)性［19］。

圖5 草豆蔻對(duì)照藥材指紋圖譜（A）與標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜（B）

2 結(jié)果與討論

草豆蔻富含揮發(fā)油，為了更好地保留這類成分，制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑時(shí)，需要將其單獨(dú)提取出來(lái)，參考文獻(xiàn)中的提取工藝［7-9］，將提取得到的草豆蔻揮發(fā)油兌入濃縮的湯劑中。本研究所用的10批草豆蔻飲片的揮發(fā)油含量為1.01%～1.72%（mL/g），草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑的揮發(fā)油含量為0.66%～0.98%（mL/g），揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率為50.6%～79.2%。數(shù)據(jù)顯示，草豆蔻標(biāo)準(zhǔn)湯劑揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率較高。

草豆蔻飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以水為溶媒經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝提取的，其提取物大部分為水溶性物質(zhì)。在《中國(guó)藥典》2020年版草豆蔻飲片［2］的4個(gè)含量測(cè)定指標(biāo)成分中，我們選取了水溶性相對(duì)高的山姜素和喬松素作為標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指標(biāo)成分，考察其含量轉(zhuǎn)移率。而小豆蔻明和榿木酮的水溶性較差，含量轉(zhuǎn)移率較低，我們將該兩種成分放在指紋圖譜測(cè)定中加以監(jiān)控。

在指紋圖譜分析方法建立過程中，使用DAD檢測(cè)器在190～400nm全紫外波長(zhǎng)掃描樣品光譜圖，提取254nm、262nm、280nm、300nm處的色譜圖進(jìn)行比對(duì)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)［15］，綜合考慮色譜峰數(shù)、色譜信號(hào)、分離情況、基線平穩(wěn)情況等方面因素，最終選擇262nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)，考察30℃、35℃、40℃柱溫對(duì)色譜分離的影響。結(jié)果顯示，柱溫對(duì)色譜分離效果有較大影響，40℃時(shí)所得指紋圖譜的分離效果較好，故建議柱溫設(shè)定為40℃。

3 結(jié)論

本研究選取10批合格的草豆蔻作為研究用樣品，建立了質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，得出山姜素的含量轉(zhuǎn)移率范圍為31.7%～56.3%，喬松素的含量轉(zhuǎn)移率范圍為15.5%～35.6%，揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率范圍為50.6%～79.2%，出膏率范圍為8.8%～13.7%，均符合《技術(shù)要求》的范圍要求；建立了HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了8個(gè)共有峰，指認(rèn)了山姜素、喬松素、小豆蔻明和榿木酮峰，各標(biāo)準(zhǔn)湯劑圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9。本文研究的標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、指標(biāo)成分和揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜三個(gè)參數(shù)是其作為物質(zhì)基準(zhǔn)的重要依據(jù)。本文的研究結(jié)果可以為草豆蔻配方顆粒后續(xù)的工藝研究、質(zhì)量控制方法制定等提供參考［6， 20］。