蔣如夢， 黃佳薇， 王永紅

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237）

眾所周知，不良的飲食習(xí)慣是一系列可預(yù)防的全球性疾病的主要誘因，尤其是一些糖和脂肪攝入量高，而纖維、水果和蔬菜攝入量低的飲食習(xí)慣[1-2]。飲食中的糖在代謝和腎臟類疾病中的作用越來越被人們所注意，常見的食品中的添加糖 (如蔗糖和高果糖玉米糖漿)都是由葡萄糖和果糖組成的，會使飲食能量密集但營養(yǎng)素缺乏，人長期大量攝入會促使更高的總能量攝入，容易造成脂肪堆積，進(jìn)而影響生理代謝[3-5]。研究表明，飲食中過量的糖是代謝紊亂、肥胖、糖尿病和心血管病等代謝類疾病的主要誘因[6-7]。除糖以外，咖啡因也是現(xiàn)代人飲食中的一種常見物質(zhì)?？Х纫蚴且环N植物次生代謝物，主要用于咖啡、茶、巧克力和軟飲料中，是人類已知的最廣泛使用的精神活性物質(zhì)，它在人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起到甲基黃嘌呤類興奮劑的作用[8-9]。咖啡因在攝入后通過胃腸道迅速被吸收到血液中，可以自由穿過所有生物膜，包括血腦屏障，它一般通過與廣泛分布于胃腸道、心血管、腎臟和大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的腺苷受體拮抗，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[10-11]。通過抑制腺苷受體，咖啡因增加腦能量代謝、皮質(zhì)活動和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，進(jìn)而產(chǎn)生外周血管收縮、血壓升高和產(chǎn)熱等生理效應(yīng)[12-13]。

奶茶是一種深受年輕人喜愛的新型含糖飲品，很多年輕人每天飲用大量的奶茶。奶茶中含有大量糖和咖啡因，長期飲用可能會影響生理代謝，并引發(fā)一系列代謝類疾病，但其對人體生理代謝的具體影響尚不明確。本文通過對小鼠持續(xù)灌胃蔗糖和咖啡因來模擬人長期攝入蔗糖和咖啡因，以體重、血糖、血脂、炎癥因子和組織學(xué)檢查為評價(jià)指標(biāo)來探討其對小鼠生理代謝的影響，以期為人們飲食行為提供參考，同時(shí)為預(yù)防和治療因蔗糖和咖啡因持續(xù)攝入所導(dǎo)致的代謝紊亂等疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔗糖：分析純，生工生物工程有限公司；氫氧化鈉：分析純，上海泰坦科技股份有限公司；鹽酸：分析純，凌峰化學(xué)試劑有限公司；3、5-二硝基水楊酸（DNS）試劑：實(shí)驗(yàn)室配制；三氯乙酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；咖啡因：分析純，Sigma-Aldrich 公司；咖啡和奶茶：購自超市；小鼠總膽固醇 (TC)、總甘油三酯 (TG)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒：生化試劑，南京建成生物工程研究所；固定液、油紅染液、蘇木素染液、分化液、返藍(lán)液、甘油明膠封片劑和蘇木精-伊紅 (HE)染色套裝：生化試劑，Servicebio 公司；OCT 包埋劑和中性樹膠：生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SPF 級C57 BL/6J 雄性小鼠：購買于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司。常規(guī)飼料 (蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪的熱量分?jǐn)?shù)分別為19.7%、72.3%和10%)：上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司；高糖高脂飼料 (蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪的熱量分?jǐn)?shù)分別為19.8%、31.7%和48.5%)：北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

酶標(biāo)儀 (美國賽默飛世爾科技公司，Varioskan lux 型)；分析天平 (上海 舜宇橫平科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A1004 型)；島津高效液相色譜 (日本島津，DGU-20A 型)；旋渦混合器 (上海琪特分析儀器有限公司，XW-80A 型)；離心機(jī) (上海亭科學(xué)儀器廠，TGL-16B型)；羅氏血糖儀 (德國 Roche)；冰凍切片機(jī) (美國賽默飛世爾科技公司)；病理切片機(jī) (上海徠卡儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 奶茶中總糖和咖啡因含量的測定

(1)總糖含量的測定。采用DNS 法對奶茶中總糖含量進(jìn)行測定，向各比色管中加入0.5 mL 稀釋200 倍的樣品，然后加入0.375 mL、6 mol/L 的鹽酸，混勻后于100 ℃沸水浴中水解5 min，冷卻至室溫后先加入0.5 mL、6 mol/L 的NaOH 溶液，再加入0.75 mL的DNS 試劑，搖勻后于100 ℃沸水浴中進(jìn)行5 min顯色反應(yīng)，待冷卻至室溫后定容至5 mL，用漩渦振蕩儀混勻，分別吸取200 μL 上述溶液至酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀測定各樣品在550 nm 處的吸光度。將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，再乘以稀釋倍數(shù)即可得到原樣品的總糖含量。每個樣品重復(fù)測定3 次。

(2)咖啡因含量的測定。采用高效液相色譜法對奶茶中咖啡因含量進(jìn)行測定。色譜條件：Unitary C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm)，柱溫為25 ℃，流動相為甲醇和水 (甲醇與水體積比為24∶76)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為272 nm，進(jìn)樣量為10 μL。將樣品和質(zhì)量濃度為10 g/L 的三氯乙酸溶液按體積比1∶10 進(jìn)行混合，搖勻經(jīng)濾膜過濾后上機(jī)檢測，將測得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再乘以稀釋倍數(shù)即可得原樣品的咖啡因濃度。每個樣品重復(fù)測定3 次。

1.2.2 動物實(shí)驗(yàn)灌胃劑量換算與確定 選取樣品中總糖和咖啡因測定結(jié)果的中值（分別約為70 g/L和550 mg/L）。按照每人每天飲用一杯700 mL 奶茶計(jì)算，相當(dāng)于攝入49 g 的糖和385 mg 的咖啡因。結(jié)合中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告[14]，以成人體重65 kg 為標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)小鼠為C57 BL/6J 雄性小鼠，進(jìn)行灌胃劑量的換算，換算式如下：

式中：A為小鼠的劑量 (mL/kg)，B為人的劑量 (mL/kg)，Km1=37，Km2=3[15]。

設(shè)定體重為65 kg 的人每天喝700 mL 的奶茶，可計(jì)算出對應(yīng)小鼠的奶茶攝入標(biāo)準(zhǔn)為132.82 mL/kg，此時(shí)小鼠攝入對應(yīng)的蔗糖劑量為9.30 g/kg，咖啡因劑量為73.05 mg/kg；20 g 小鼠攝入0.4 mL 蔗糖與咖啡因混合溶液所需的蔗糖質(zhì)量濃度為464.75 g/L、咖啡因質(zhì)量濃度為3.653 g/L，所含能量約為3.11 kJ。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動物分組設(shè)計(jì)與飼養(yǎng) 對36 只6 周齡C57 BL/6J 雄性小鼠用常規(guī)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)，一周后采用隨機(jī)分組的方式分為6 組，分別為常規(guī)飼料組(ND)、常規(guī)飼料加蔗糖組 (ND+S)、常規(guī)飼料加蔗糖和咖啡因組 (ND+SC)、高糖高脂飼料組 (HSD)、高糖高脂飼料加蔗糖組 (HSD+S)、高糖高脂飼料加蔗糖和咖啡因組 (HSD+SC)。其中ND 組喂食常規(guī)飼料并灌胃生理鹽水，ND+S 組喂食常規(guī)飼料并灌胃蔗糖溶液，ND+SC 組喂食常規(guī)飼料并灌胃蔗糖和咖啡因的混合溶液，HSD 組喂食高糖高脂飼料并灌胃生理鹽水，HSD+S 組喂食高糖高脂飼料并灌胃蔗糖溶液，HSD+SC 組喂食高糖高脂飼料并灌胃蔗糖和咖啡因的混合溶液。實(shí)驗(yàn)過程中每天12 h 光照和黑暗循環(huán)，保持實(shí)驗(yàn)房室溫(22±2)℃，濕度50%～60%，定期更換墊料，每籠小鼠讓其自由進(jìn)食與飲水，本文中所有實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查指南。

1.2.4 動物實(shí)驗(yàn)樣品采集和測定方法

(1)小鼠血液樣品的收集處理。實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)定期測量小鼠進(jìn)食量、飲水量和體重并記錄，每兩周使用羅氏血糖儀測定小鼠空腹血糖并尾靜脈采血，采集的血樣離心后取上層血清置于-80 ℃冰箱保存待測。每次測空腹血糖和取血時(shí)提前12 h 對小鼠禁食，但不禁水。

(2)口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)。小鼠解剖前一周進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)，按照2 g/kg (葡萄糖用量/體重)的標(biāo)準(zhǔn)給小鼠灌胃200 g/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在灌胃后第0、15、30、60、90 min 和120 min 時(shí)測定小鼠的血糖值并記錄。糖耐量實(shí)驗(yàn)前12 h 對小鼠禁食，但不禁水。

(3)小鼠組織樣本的收集。糖耐量實(shí)驗(yàn)完成一周后對小鼠實(shí)行安樂死，并進(jìn)行解剖，取出小鼠下腹部兩側(cè)附睪丸脂肪、腎周脂肪和肝臟稱重，并置于40 g/L 的多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，留待之后做切片觀察。解剖前12 h 對小鼠禁食，但不禁水。

(4)血清樣品的測定。使用TC、TG、TNF-α和IL-6 試劑盒對上述保存的血清樣品進(jìn)行測定，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

(5)小鼠組織固定與觀察。將上述置于40 g/L多聚甲醛溶液中的新鮮組織固定24 h 后，對脂肪和肝臟組織進(jìn)行石蠟切片的制作和HE 染色，同時(shí)對肝臟組織進(jìn)行冷凍切片的制作和油紅O 染色。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用均值±平均標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較采用Duncant 單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用GraphPad 8.0 軟件進(jìn)行繪圖。本文所有圖中數(shù)值與ND 組的差異性比較用#表示 (#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，###表示P＜0.001)，與HSD 組的差異性比較用*表示 (*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001)。

2 結(jié)果與討論

2.1 市售奶茶樣品中總糖和咖啡因含量

本研究選取了市面上幾種品牌的熱銷奶茶對其中的總糖和咖啡因含量進(jìn)行了測定，測定結(jié)果如表1所示。所測樣品中的總糖質(zhì)量濃度范圍為25～135 g/L，其中無糖奶茶實(shí)際上也含有一定量的糖；咖啡因質(zhì)量濃度范圍為190 ～853 mg/L。研究結(jié)果表明，鮮奶茶和拿鐵中的咖啡因含量比普通奶茶高，港式奶茶中的咖啡因含量要高于其他奶茶。綜合考慮總糖和咖啡因含量，所測樣品中一點(diǎn)點(diǎn)的五分糖拿鐵和厝內(nèi)小眷村的總糖和咖啡因質(zhì)量濃度相近，總糖質(zhì)量濃度約為70 g/L，咖啡因質(zhì)量濃度約為550 mg/L，接近整個選取樣品中總糖和咖啡因質(zhì)量濃度的中值。按照一杯奶茶700 mL 體積計(jì)算，若每人每天飲用一杯奶茶，相當(dāng)于每天攝入49 g 的糖和385 mg 的咖啡因，均接近世界衛(wèi)生組織建議每日食用量上限，因此以上述兩種奶茶中的總糖和咖啡因含量為基準(zhǔn)進(jìn)行下一步動物實(shí)驗(yàn)。

表1 奶茶中的總糖和咖啡因含量Table 1 Sugar and caffeine content in bubble tea

2.2 蔗糖和咖啡因的持續(xù)攝入對小鼠生理代謝的影響

2.2.1 蔗糖和咖啡因的持續(xù)攝入對小鼠能量攝入的影響 對各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行16 周的差異化飼養(yǎng)和灌胃，每天記錄各組小鼠攝入飼料量。16 周內(nèi)小鼠平均日總能量攝入結(jié)果如圖1 所示，其中灌胃蔗糖和灌胃蔗糖加咖啡因的小鼠攝入的總能量是指消耗的飼料與蔗糖能量的總和。與ND 組相比，ND+S、ND+SC、HSD+S 和HSD+SC 組小鼠能量攝入無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HSD 組小鼠能量攝入增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)；與HSD 組相比，HSD+S 組小鼠能量攝入減少但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HSD+SC 組小鼠能量攝入減少且有差異(P＜0.05)。有研究表明，大鼠攝入咖啡因后食欲被抑制從而降低能量的攝入[16]，本研究中單獨(dú)的高糖高脂飲食會導(dǎo)致能量攝入顯著增高，高糖高脂飲食下補(bǔ)充蔗糖和咖啡因會使小鼠攝入能量降低。

圖1 各組小鼠日總能量攝入Fig.1 Daily total energy intake of mice in each group

2.2.2 蔗糖和咖啡因的持續(xù)攝入對小鼠體重的影響 對各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行16 周的差異化飼養(yǎng)和灌胃，各組小鼠每周的體重變化和16 周的總體重增量分別如圖2 (a)和2(b)所示。與ND 組相比，ND+S組小鼠體重持續(xù)上升但實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體重增長量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ND+SC 組小鼠體重增長平緩，增長量低于ND 組但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；HSD 和HSD+S 組小鼠體重持續(xù)上升且體重增長量有極顯著差異 (P＜0.001)；HSD+SC組小鼠體重增長平緩且增長量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與HSD 組相比，HSD+S 組小鼠體重增長量比HSD 組少但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HSD+SC 組的小鼠體重增長量比HSD 組少且有顯著差異 (P＜0.01)。以上結(jié)果表明單純攝取高熱量的高糖高脂飼料能夠使小鼠體重明顯上升；在常規(guī)飼料基礎(chǔ)上攝取一定量的蔗糖能夠使小鼠體重上升，而在高糖高脂飼料基礎(chǔ)上攝取一定量蔗糖的小鼠，其體重增長量比單純飼喂高糖高脂飼料還要低，這可能是由于對小鼠灌胃蔗糖減少了小鼠對高糖高脂飼料的攝入量，而灌胃蔗糖所含能量低于減少攝取的高糖高脂飼料所含能量；但在攝入蔗糖的基礎(chǔ)上攝入一定量的咖啡因能夠使體重增加速度下降，尤其是在攝取高糖高脂飼料和蔗糖的基礎(chǔ)上攝取咖啡因甚至能夠使小鼠體重下降到常規(guī)飼料組水平，這與楊哲[16]所報(bào)道的攝入咖啡因能夠使大鼠體重增速明顯放緩的結(jié)果相一致。

圖2 16 周內(nèi)不同飼喂條件下小鼠體重的變化Fig.2 Changes of body weight in mice under different feeding conditions during 16 weeks

2.2.3 蔗糖和咖啡因的持續(xù)攝入對小鼠空腹血糖的影響 對各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行16 周的差異化飼養(yǎng)和灌胃，每周測定各組小鼠的空腹血糖 (Fasting blood glucose, FBG)濃度，其每兩周的FBG 濃度和第16 周的FBG 濃度分別如圖3 (a)和3(b)所示。在整個實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，ND 組FBG 濃度沒有明顯變化，在4.5 mmol/L上下波動。與ND 組相比，ND+S 組小鼠的FBG 濃度在整個周期內(nèi)有上升趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ND+SC 組小鼠的FBG 濃度有上升趨勢且有顯著差異 (P＜0.01)； HSD、 HSD+S 和HSD+SC 組小鼠的FBG 濃度從第4 周開始升高，到第10 周時(shí)穩(wěn)定在較高水平，且實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)這3 組小鼠的FBG 濃度與ND 組有極顯著差異 (P＜0.001)。與HSD 組相比，HSD+S 組小鼠的FBG 濃度偏低但在整個實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)也呈上升趨勢，HSD+SC 組小鼠的FBG 濃度上升，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明在常規(guī)飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上長期持續(xù)灌胃蔗糖加咖啡因能夠促使小鼠的FBG 濃度上升，但長期喂食高糖高脂飼料能夠使小鼠的FBG濃度更早且更顯著上升。

圖3 16 周內(nèi)不同飼喂條件下小鼠FBG 的變化Fig.3 Changes of FBG in mice under different feeding conditions during 16 weeks

2.2.4 蔗糖和咖啡因的持續(xù)攝入對小鼠葡萄糖耐量的影響 在16 周的差異化飼養(yǎng)和灌胃后，對各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn) (Oral glucose tolerance test, OGTT)，結(jié)果如圖4 所示。與ND 組相比，ND+S 和ND+SC 組小鼠在灌胃葡萄糖后曲線下面積 (Area under curve, AUC)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HSD、HSD+S 和HSD+SC 組的AUC 比ND 組大，且有極顯著差異 (P＜0.001)；與HSD 組相比，HSD+S 和HSD+SC組小鼠的AUC 無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明飼喂常規(guī)飼料基礎(chǔ)上持續(xù)攝入蔗糖及蔗糖加咖啡因的混合液對小鼠血糖調(diào)節(jié)能力無明顯影響，但飼喂高糖高脂飼料能夠使小鼠的血糖調(diào)節(jié)能力明顯變差，對葡萄糖的耐受性降低，這與高偉華[17]的研究中脂肪含量為40%左右的高脂飼料能夠使小鼠血糖的調(diào)節(jié)和耐受能力下降這一結(jié)果具有一致性，結(jié)合2.2.3 節(jié)中高糖高脂飼料喂養(yǎng)下小鼠FBG 濃度上升這一結(jié)果，表明本研究中高糖高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠有Ⅱ型糖尿病發(fā)病前期跡象。

圖4 16 周后不同飼喂條件下小鼠口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of OGTT in mice under different feeding conditions after 16 weeks

2.2.5 蔗糖和咖啡因的持續(xù)攝入對小鼠脂質(zhì)代謝的影響 總膽固醇（TC）和總甘油三酯（TG）是反映脂質(zhì)代謝水平的重要指標(biāo)。膽固醇是哺乳動物細(xì)胞膜的主要成分，TC 濃度過高容易導(dǎo)致其沉積在血管上，引起動脈粥樣硬化；甘油三脂是由長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，TG 濃度過高時(shí)提示體內(nèi)會有脂肪堆積，易于引起血液黏稠度上升進(jìn)而增加患心血管相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

在16 周的差異化飼養(yǎng)和灌胃后，對各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TC 和TG 濃度進(jìn)行測定。血清中TC 濃度的測定結(jié)果如圖5 (a)所示。與ND 組相比，ND+S和ND+SC 組TC 濃度無明顯變化，HSD、HSD+S 和HSD+SC 組的TC 濃度上升，且有極顯著差異 (P＜0.001)；與HSD 組相比，HSD+S 和HSD+SC 組小鼠的TC 濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明長期單純的蔗糖和咖啡因攝入不會使小鼠TC 水平發(fā)生顯著性改變，而含高膽固醇的高糖高脂飼料能夠使小鼠TC 水平顯著上升。有研究表明，長期攝入脂肪能量為40%左右的高脂飼料能夠使小鼠血清中的TC 水平顯著上升[18-19]，本研究與上述研究結(jié)果一致。各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TG 濃度測定結(jié)果如圖5 (b)所示。與ND 組相比，ND+S、HSD 和HSD+S 組的TG 濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ND+SC 和HSD+SC 組的TG 濃度有差異性降低 (P＜0.05)；與HSD 組相比，HSD+S 組的TG 濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HSD+SC 組的TG 濃度有差異性降低(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，無論飼喂何種飼料，持續(xù)每天攝入咖啡因能夠降低小鼠血清中TG 濃度，而在目前實(shí)驗(yàn)條件下持續(xù)攝入蔗糖溶液和高糖高脂飼料喂養(yǎng)對小鼠血清里的TG 濃度無顯著影響。

圖5 16 周后不同飼喂條件下小鼠血清中TC 和TG 濃度Fig.5 Concentration of serum TC and TG in mice under different feeding conditions after 16 weeks

2.2.6 蔗糖和咖啡因的持續(xù)攝入對小鼠血清中炎癥因子的影響 炎癥反應(yīng)是一種級聯(lián)反應(yīng)，是機(jī)體對不同病理刺激和組織損傷做出的回應(yīng)。TNF-α是脂肪組織產(chǎn)生的促炎因子，其濃度升高可以抑制胰島素信號，使胰島素抵抗能力增強(qiáng)。IL-6 是激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌的促炎因子，能被白細(xì)胞介素-1β和TNF-α誘導(dǎo)，可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并參與炎癥反應(yīng)。

在16 周的差異化飼養(yǎng)和灌胃后，對各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的TNF-α和IL-6 質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，結(jié)果分別如圖6(a)和6(b)所示。與ND 組相比，ND+S、ND+SC、 HSD、 HSD+S 和HSD+SC 組的TNF-α和IL-6 質(zhì)量濃度均上升，且有顯著差異 (P＜0.01)；與HSD 組相比，HSD+S和HSD+SC 組的TNF-α和IL-6 質(zhì)量濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明持續(xù)攝入蔗糖、蔗糖和咖啡因混合溶液以及高糖高脂飼料均能夠使小鼠機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。

圖6 16 周后不同飼喂條件下小鼠血清中TNF-α 和IL-6 的質(zhì)量濃度Fig.6 Mass concentration of serum TNF-α and IL-6 in mice under different feeding conditions after 16 weeks

2.2.7 蔗糖和咖啡因的持續(xù)攝入對小鼠組織的影響

在16 周的差異化飼養(yǎng)和灌胃后，對各實(shí)驗(yàn)組小鼠脂肪和肝臟組織進(jìn)行觀察比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠組織質(zhì)量如圖7 所示。與ND 組相比，ND+S 組的各組織質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ND+SC 組的肝臟質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、附睪丸脂肪減少且有極顯著差異 (P＜0.001)、腎周脂肪減少但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，HSD 組的肝臟、附睪丸脂肪和腎周脂肪的質(zhì)量都增加，且有極顯著差異(P＜0.001)。與HSD 組相比，HSD+S 組的附睪丸脂肪質(zhì)量增加且有極顯著差異 (P＜0.001)。肝臟和腎周脂肪質(zhì)量增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；HSD+SC 組的肝臟、附睪丸脂肪和腎周脂肪質(zhì)量均減少，且有極顯著差異(P＜0.001)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂高糖高脂飼料能極顯著地增加肝臟和脂肪組織質(zhì)量，小鼠無論在常規(guī)飼料還是高糖高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，補(bǔ)充蔗糖的攝入都能在一定程度上造成附睪丸脂肪的增加和肝臟脂肪的堆積，在蔗糖攝入基礎(chǔ)上再補(bǔ)充咖啡因的攝入能有效緩解因蔗糖攝入所造成的附睪丸脂肪增加和肝臟脂肪堆積現(xiàn)象，尤其是在高糖高脂飼料加蔗糖攝入的基礎(chǔ)上補(bǔ)充咖啡因?qū)τ诰徑膺@一現(xiàn)象有非常顯著的效果。

圖7 16 周后不同飼喂條件下小鼠組織 (肝臟和附睪丸脂肪、腎周脂肪)質(zhì)量Fig.7 Mass of tissue (liver, epididymal fat and perirenal fat) in mice under different feeding conditions after 16 weeks

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織HE 染色結(jié)果如圖8 所示。正常組 (ND)細(xì)胞排列整齊，肝索清晰，無明顯的炎性細(xì)胞浸潤和炎癥灶。與ND 組相比，ND+S 和ND+SC 組細(xì)胞排列不整齊，肝索不清晰，有輕微的炎癥灶；HSD 組細(xì)胞核擠向一邊，肝細(xì)胞氣泡樣變大，細(xì)胞排列不整齊，肝索不清晰，胞漿內(nèi)有較多的空泡 (脂肪滴)。與HSD 組相比，HSD+S組胞漿內(nèi)空泡數(shù)量增加，HSD+SC 組空泡數(shù)量減少但有炎癥灶，提示炎癥較強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟組織油紅O 染色結(jié)果如圖9 所示。與ND 組相比，ND+S 組的紅色面積有輕微增加，ND+SC 組的紅色面積減少，HSD 組的紅色面積明顯增加。與HSD 組相比，HSD+S 組的紅色面積增加，HSD+SC 組紅色面積明顯減少。小鼠肝臟組織油紅O 染色結(jié)果中染上紅色的面積與肝臟脂肪堆積程度呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，蔗糖和高糖高脂飼料的攝入會增加肝臟組織的脂肪堆積，而在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充咖啡因的攝入能夠減弱上述脂肪堆積現(xiàn)象；此外切片染色結(jié)果顯示無論是在常規(guī)飼料還是高糖飼料的基礎(chǔ)上補(bǔ)充蔗糖和咖啡因的攝入都會使肝臟組織發(fā)生炎癥。

圖8 各組小鼠肝臟組織HE 染色結(jié)果 (200×)Fig.8 HE staining of liver tissues of mice in each group (200×)

圖9 各組小鼠肝臟組織油紅O 染色結(jié)果 (200×)Fig.9 Oil red O staining of liver tissues of mice in each group (200×)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪丸脂肪HE 染色結(jié)果如圖10 所示。與ND 組相比，ND+S 和HSD 組的脂肪細(xì)胞發(fā)生氣球樣變，面積變大，其中HSD 組的氣球樣變化更明顯，面積更大，ND+SC 組的脂肪細(xì)胞發(fā)生氣球樣變，但面積變??；與HSD 組相比，HSD+S組的脂肪細(xì)胞面積輕微增大，HSD+SC 的脂肪細(xì)胞發(fā)生氣球樣變，但面積變小。小鼠的附睪丸脂肪HE染色結(jié)果中脂肪細(xì)胞變大表示脂肪的積累增多，且脂肪細(xì)胞的大小與附睪丸脂肪質(zhì)量呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，蔗糖和高糖高脂飼料的攝入會使小鼠的附睪丸脂肪組織細(xì)胞面積變大，提示小鼠附睪丸脂肪積累增多；在持續(xù)攝入蔗糖的基礎(chǔ)上增加咖啡因的攝入能使小鼠的附睪丸脂肪組織細(xì)胞面積減小，減少小鼠附睪丸脂肪的積累。

3 討 論

奶茶因其良好的飲用口感而越來越流行，導(dǎo)致部分人群長期飲用大量的奶茶。有研究顯示，在一個363 人的問卷調(diào)查中，高達(dá)35.7%的人每周飲用兩杯以上的奶茶[20]，但市售奶茶中含有大量的糖和咖啡因，長期飲用可能會對人體造成一定的傷害，并引發(fā)代謝類疾病。本研究首先廣泛調(diào)研并測定了市面上流行品牌奶茶中的總糖和咖啡因含量，結(jié)果表明所調(diào)研奶茶中總糖質(zhì)量濃度范圍為25～135 g/L，咖啡因質(zhì)量濃度范圍為190～853 mg/L，本研究選取的樣品中總糖和咖啡因質(zhì)量濃度的中值分別為70 g/L 和550 mg/L。世界衛(wèi)生組織建議，健康成人每日糖攝入量最好在25 g以下，不超過50 g；咖啡因單次攝入量200 mg 以下，全天攝入量不超過400 mg，若每人每天飲用一杯700 mL上述奶茶，相當(dāng)于攝入49 g 的糖和385 mg 的咖啡因，接近于世界衛(wèi)生組織所建議的每日糖和咖啡因食用量的上限。

本研究對C57 BL/6J 小鼠飼喂不同飼料同時(shí)灌胃蔗糖和咖啡因溶液，模擬不同飲食方式的人每天喝1 杯700 mL 奶茶所攝入的蔗糖與咖啡因，并研究其對小鼠生理代謝的影響。結(jié)果表明，在常規(guī)飼料喂養(yǎng)情況下，蔗糖的持續(xù)攝入能使小鼠的體重和空腹血糖上升，附睪丸脂肪細(xì)胞發(fā)生一定的氣球樣變，肝臟有少量的脂肪堆積，肝臟組織發(fā)生炎癥，血清中促炎因子TNF-α和IL-6 質(zhì)量濃度增加，但對TC、TG和血糖調(diào)節(jié)能力無顯著影響；在高糖高脂飼料喂養(yǎng)情況下，增加蔗糖的持續(xù)攝入對小鼠體重、FBG、TC、TG、附睪丸脂肪細(xì)胞的氣球樣變和肝臟脂肪的堆積均無明顯進(jìn)一步影響。無論是在常規(guī)飼料還是在高糖高脂飼料喂養(yǎng)情況下，在蔗糖持續(xù)攝入的基礎(chǔ)上補(bǔ)充咖啡因的攝入都能夠使小鼠的體重和TG 濃度下降，減少附睪丸脂肪積累，清除肝臟的脂肪堆積；但會使小鼠FBG 濃度上升，血清中促炎因子TNF-α和IL-6 質(zhì)量濃度增加。有報(bào)道[21]顯示小鼠長期食用富含58%脂肪和25%碳水的高糖高脂飼料能夠使小鼠的體重增加，同時(shí)肝臟組織發(fā)生一定程度的脂肪堆積，本研究結(jié)果中高糖高脂飼料喂養(yǎng)和蔗糖灌胃下小鼠體重的上升和脂肪的堆積與上述報(bào)道一致。食物中一定量的糖質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后通過一系列消化酶的作用被水解為單糖后吸收，這些單糖在胰島素的作用下，進(jìn)入肌肉和脂肪組織轉(zhuǎn)化為能量被利用，該過程中通過抑制糖消化酶可以防止血糖上升，有研究表明，咖啡中的咖啡因?qū)Ζ?葡萄糖苷酶的活性無抑制作用[22]。本研究結(jié)果顯示灌胃蔗糖加咖啡因能使小鼠FBG 濃度上升，可能是由于咖啡因?qū)Ζ?葡萄糖苷酶的活性無抑制作用，但其具體原因還有待進(jìn)一步研究。有報(bào)道顯示，機(jī)體營養(yǎng)過剩會導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分泌趨化因子，提供趨化梯度，吸引單核細(xì)胞進(jìn)入脂肪組織成為巨噬細(xì)胞并分泌促炎因子如TNF-α和IL-6，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素靶細(xì)胞的胰島素敏感性降低[23-24]。本研究結(jié)果表明，長期蔗糖和高糖高脂飼料的攝入能夠使小鼠體內(nèi)脂肪積累增多，從而增加促炎因子的釋放，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上持續(xù)攝入一定量的咖啡因雖然能清除脂肪細(xì)胞的積累但不能逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，長期持續(xù)攝入一定量的蔗糖能夠使機(jī)體的體重、空腹血糖和促炎因子增加，在此基礎(chǔ)上持續(xù)攝入一定量的咖啡因能夠使體重下降但會促進(jìn)血糖濃度進(jìn)一步上升。隨著奶茶等含大量糖和咖啡因飲料的流行，本研究對人們選擇該類飲品有一定的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。