何莉 曹璐璐 廖廣霖 杜圣蔚 陳見(jiàn)昂 陳國(guó)榮 陳涵斌

原發(fā)性肝癌在全球癌癥死亡原因中排第3 位，肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型[1]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的核心，泛素相關(guān)基因（ubiquitin-related genes，URGs）的失調(diào)與多種疾病相關(guān)[2]。已發(fā)現(xiàn)以泛素結(jié)合酶（ubiquitin binding enzyme，UBE）2C 為代表的URGs 在各種癌癥中常異常表達(dá)[3-4]，靶向URGs 的抑制劑成為當(dāng)前研究腫瘤治療的熱點(diǎn)[5-7]。因此探索URGs 在HCC 組織中的表達(dá)及意義，對(duì)臨床診療具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)、qRT-PCR 技術(shù)和免疫組化技術(shù)探索并驗(yàn)證HCC 組織中UBE2C 表達(dá)及其臨床意義，并構(gòu)建基于URGs 預(yù)測(cè)HCC 患者預(yù)后的臨床模型，以期為臨床診療提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2022 年3 月至2022 年6 月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮HCC 組織22 例及癌旁組織（距離癌邊緣至少1 cm）28 例。收集2018 年1 月至2019 年12 月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院切除的174 例HCC 組織和62 例癌旁組織，利用手動(dòng)組織芯片儀制作石蠟組織芯片，其中HCC 組織為7 行9 列，每樣本3 孔；癌旁組織為4 行8 列，每樣本2 孔。所有納入樣本均經(jīng)過(guò)病理診斷，具有完整隨訪(fǎng)資料，術(shù)前未接受放療或化療，無(wú)自身免疫性疾病或合并其他惡性腫瘤。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：KY2022-R130），免除患者知情同意。

1.2 生物信息學(xué)分析 從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https:/portal.gdc.cancer.gov/）中獲得344 例HCC 患者的RNA 測(cè)序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息，篩選URGs，并就URGs 的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行排序。以差異表達(dá)最明顯的UBE2C 為對(duì)象，按UBE2C 中位值將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分為高、低表達(dá)兩組，分析兩組性別、年齡、腫瘤分級(jí)、腫瘤-淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis，TNM）分期、T 分期等臨床病理特征，并基于UBE2C 表達(dá)水平構(gòu)建HCC 預(yù)后模型。

1.3 UBE2C mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用qRT-PCR法。使用Trizol 法提取新鮮HCC 組織和癌旁組織內(nèi)總RNA，根據(jù)TOROIVD?qRT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海TOROIVD 公司，批號(hào)：RTQ-100）方法獲得cDNA，根據(jù)TOROGreen?HRM qPCR Mix 試劑盒（上海TOROIVD 公司，批號(hào)：QET-100）方法對(duì)cDNA 產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。UBE2C 引物序列：F-5'-GCTTGGGTTGGGACATGAGG-3'，R-5'-CTCGGCAGCATGTGTGTTCA-3'。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列：F- 5'GATTCCACCCATGGCAAATTC，R-5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算各樣本中UBE2C mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 UBE2C 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系分析采用免疫組化法鑒別UBE2C 蛋白表達(dá)量，采用HE 染色法鑒別UBE2C 蛋白的表達(dá)位置。取石蠟組織芯片，脫蠟水化，加3%過(guò)氧化氫溶液阻斷10 min；抗原修復(fù)后加入U(xiǎn)BE2C 一抗（美國(guó)abcam 公司，批號(hào)：ab154022），4 ℃冰箱過(guò)夜。加入二抗（美國(guó)賽默飛公司，批號(hào)：A48275），37 ℃孵育30 min，復(fù)溫5 min，用PBS 沖洗數(shù)次，加入二氨基聯(lián)苯胺（中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9017）顯色，清水沖洗，蘇木素（中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLI-9610）復(fù)染50 s。使用光鏡觀察細(xì)胞核染色情況。根據(jù)視野中著色細(xì)胞數(shù)量占細(xì)胞總數(shù)量評(píng)分，＜1%為0 分，1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分；根據(jù)細(xì)胞核染色（棕色）強(qiáng)度評(píng)分，不著色為0分，弱著色為1 分，中度著色為2 分，強(qiáng)著色為3 分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘得到最后的評(píng)分，0～1 分記為陰性（-），2～3分記為弱陽(yáng)性（+），4～6 分記為陽(yáng)性（++），7～9 分記為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），其中陰性和弱陽(yáng)性記為UBE2C 低表達(dá)，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性記為UBE2C 高表達(dá)。陽(yáng)性率=（弱陽(yáng)性+陽(yáng)性+強(qiáng)陽(yáng)性）/總標(biāo)本數(shù)×100%。收集患者性別、年齡、腫瘤分化、腫瘤大小、血管侵犯、肝硬化、血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、HBsAg、TNM 分期等臨床信息，分析UBE2C蛋白表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系。

1.5 UBE2C 蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系分析 根據(jù)患者病例或隨訪(fǎng)記錄，收集患者生存狀態(tài)，末次隨訪(fǎng)時(shí)間為2022 年12 月。繪制Kaplan-Meier 曲線(xiàn)，分析UBE2C 蛋白表達(dá)情況與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.6 UBE2C 的基因文庫(kù)富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 使用GSEA 軟件（http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）在線(xiàn)分析UBE2C 高表達(dá)組的基因富集通路。

1.7 基于UGRs 的預(yù)后模型構(gòu)建 利用MSigDB 數(shù)據(jù)庫(kù)“REACTOME”蛋白“UBIQUITINATION”基因集中提取URGs；登錄TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載HCC 患者轉(zhuǎn)錄組矩陣中這些基因的表達(dá)情況，繪制成新的矩陣，篩選出其中差異表達(dá)的URGs。采用多因素Cox 回歸分析找出其中對(duì)HCC 患者生存結(jié)局有影響的URGs。為防止數(shù)據(jù)過(guò)度擬合，再次進(jìn)行Lasso 回歸分析，最終找出與HCC 預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵URGs，構(gòu)建基于URGs 的預(yù)后模型。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，比較兩組預(yù)后。采用時(shí)間依賴(lài)ROC 曲線(xiàn)分別計(jì)算1、2、3 年生存期該模型曲線(xiàn)的AUC。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。UBE2C 蛋白表達(dá)情況與HCC 臨床病理特征的關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)。采用單因素Cox 回歸分析UBE2C 及臨床病理特征與HCC 預(yù)后的關(guān)系，并將得到的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)納入多因素Cox回歸分析，預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)指標(biāo)。繪制Kaplan-Meier 曲線(xiàn)，分析URGs、UBE2C與臨床預(yù)后的關(guān)系，分析高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后。P＜0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UBE2C mRNA 表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 生物信息學(xué)分析和qRT-PCR 結(jié)果均顯示，與癌旁組織相比，UBE2C mRNA 在HCC 組織中高表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖1。高表達(dá)的UBE2C 與腫瘤分級(jí)、T分期、TNM 分期均有關(guān)（均P＜0.01），但與患者性別無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表1；多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，UBE2C 是影響HCC 患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表1 基于癌癥基因組圖譜的HCC患者UEB2C表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

表2 基于癌癥基因組圖譜的HCC多因素風(fēng)險(xiǎn)分析

圖1 UBE2C mRNA 在HCC 組織與癌旁組織中表達(dá)的比較（A：癌癥基因組圖譜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，B：qRT-PCR數(shù)據(jù)）

2.2 UBE2C 蛋白表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示，UBE2C 蛋白在HCC 組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P＜0.01），見(jiàn)表3；HCC 組織中可見(jiàn)細(xì)胞核染色明顯，提示UBE2C 表達(dá)主要位于細(xì)胞核，而癌旁組織中未見(jiàn)，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。高表達(dá)的UBE2C 與腫瘤分化程度、TNM 分期、血清AFP 和HBsAg 有關(guān)（均P＜0.05），與腫瘤大小、血管侵犯、肝硬化、患者性別和年齡無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表4。

表3 不同組織中UBE2C的免疫組化染色結(jié)果（例）

表4 基于組織芯片的HCC患者UBE2C蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

圖2 不同組織中UBE2C 染色結(jié)果（A：HCC 組織；B：HCC 組織中的UBE2C 表達(dá)；C：癌旁組織；D：癌旁組織中的UBE2C 表達(dá)）

2.3 HCC 患者UBE2C 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 基于TCGA的Kaplan-Meier曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，UBE2C mRNA高表達(dá)組HCC 患者累積生存率低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3A。174例患者隨訪(fǎng)時(shí)間為2～67個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為47 個(gè)月。生存分析結(jié)果顯示，UBE2C 蛋白高表達(dá)組HCC 患者累積生存率低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3B。

2.4 UBE2C 的基因富集通路 將TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的UBE2C 的基因文庫(kù)使用GSEA 軟件在線(xiàn)從京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）中分析UBE2C 高表達(dá)組的基因富集通路，上調(diào)的UBE2C 基因主要富集在堿基切除修復(fù)、細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制、同源重組、核苷酸切除修復(fù)、p53 信號(hào)通路、嘌呤代謝、嘧啶代謝、剪接體、泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑等10 條通路，見(jiàn)圖4（插頁(yè)）。

圖4 UBE2C 的基因富集圖（顯示前10 位富集通路）

2.5 基于URGs 的HCC 臨床預(yù)后模型 MSigDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中共提取出79 個(gè)URGs，其中UBE2C、DNA 依賴(lài)性蛋白激酶（protein kinase DNA-activated catalytic polypeptide，PRKDC）、含WW 域銜接因子卷曲螺旋（WW domain containing adaptor with coiled-coil，WAC）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、UBE2L3、UBE2S、UBE2E1、環(huán)指蛋白20（ring finger protein 20，RFP20）、UBE2J2、UBE2D2、泛素結(jié)合酶B（ubiquitin-conjugating enzyme B，UBB）等11 個(gè)URGs 均與HCC 預(yù)后緊密相關(guān)。用該組基因建立臨床預(yù)后模型，高風(fēng)險(xiǎn)患者總生存率低于低風(fēng)險(xiǎn)組（P＜0.05），見(jiàn)圖5A；該模型預(yù)測(cè)HCC 患者術(shù)后1、2、3 年生存期的AUC 分別為0.762、0.708、0.683，見(jiàn)圖5B。

圖5 基于URGs 的HCC 臨床預(yù)后模型（A：兩組患者的生存曲線(xiàn)；B：預(yù)后模型的時(shí)間依賴(lài)ROC 曲線(xiàn)）

3 討論

目前HCC 中新型生物標(biāo)志物研究多處于臨床前的研發(fā)與驗(yàn)證中[8]。URGs 是人體蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的核心[9]，還參與DNA 損傷和修復(fù)、細(xì)胞凋亡和存活、細(xì)胞分化以及耐藥性相關(guān)因子的調(diào)控[10]。有研究發(fā)現(xiàn)HCC組織中存在URGs 表達(dá)失調(diào)[11]。因此，探索HCC 中URGs 的表達(dá)及臨床意義具有重要價(jià)值。

URGs 包括泛素、泛素激活酶、泛素結(jié)合酶、泛素連接酶、去泛素化酶以及26S 蛋白酶體。UBE2C 是泛素結(jié)合酶基因中的一員，目前已發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)[11-12]。在頭頸部鱗癌中，UBE2C 可通過(guò)抑制放療導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[13]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌和肺癌中UBE2C 的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了順鉑的耐藥性[14-15]。Xiong 等[16]也發(fā)現(xiàn)沉默UBE2C 增加了HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性，而索拉非尼是晚期肝癌患者的一線(xiàn)化療藥物。因此，推測(cè)UBE2C 可能是HCC 預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志，靶向UBE2C 的治療可能成為HCC 治療的新策略。

本研究發(fā)現(xiàn)UBE2C 是HCC 中差異表達(dá)最高的URGs，數(shù)據(jù)庫(kù)信息轉(zhuǎn)錄組信息、石蠟組織蛋白表達(dá)檢測(cè)、新鮮組織mRNA 含量檢測(cè)均證明UBE2C 在肝癌中過(guò)表達(dá)。UBE2C 表達(dá)與腫瘤分級(jí)、TNM 分期有關(guān)，分級(jí)或分期越高，UBE2C 的表達(dá)越高，這種表達(dá)特征同樣在乳腺癌、胃癌、宮頸癌中被發(fā)現(xiàn)[17-19]。UBE2C 過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞往往呈現(xiàn)出生長(zhǎng)速度提升、密度增加，表明UBE2C 有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和惡性轉(zhuǎn)化的能力[20]。UBE2C高表達(dá)預(yù)示著較差預(yù)后，進(jìn)一步證實(shí)了UBE2C 與腫瘤惡性程度相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)UBE2C 高表達(dá)還與T 分期（腫瘤大小）及患者年齡相關(guān)，與以往研究結(jié)果一致[21-22]。然而，UBE2C 的表達(dá)在Ⅲ級(jí)與Ⅳ級(jí)、Ⅳ期與前3 期間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與Ⅳ級(jí)和Ⅳ期患者信息過(guò)少導(dǎo)致數(shù)據(jù)存在偏倚、Ⅳ級(jí)和Ⅳ期患者中往往包括一些分化差的病例導(dǎo)致原有的生物標(biāo)志丟失等因素有關(guān)。有研究表明，編碼蛋白質(zhì)合成的相關(guān)基因隨年齡增加表達(dá)水平整體呈下降趨勢(shì)，而下降的原因仍在進(jìn)一步探討之中[23]。因此高年齡組患者中UBE2C的表達(dá)下降可能與衰老引起的蛋白質(zhì)合成功能減弱相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)UBE2C 是影響HCC 患者總生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素；結(jié)合免疫組化結(jié)果可知，UBE2C 高表達(dá)不僅與腫瘤分級(jí)、TNM 分期有關(guān)，還與血清中AFP、HBsAg 相關(guān)。Wang 等[12]將368 例肝癌患者根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分為AFP 高表達(dá)組和AFP 低表達(dá)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFP 高表達(dá)組UBE2C 呈高表達(dá)（P＜0.01），說(shuō)明UBE2C 的表達(dá)與AFP 表達(dá)存在正相關(guān)。目前暫未有研究證實(shí)UBE2C 表達(dá)水平與HBsAg 的直接相關(guān)性，但Chen 等[22]對(duì)1 344 例無(wú)HBV 感染者、1 560 例HBV 攜帶者和1 057 例HBV 相關(guān)HCC 患者的對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，UBE2L3 不僅是HBV 感染的易感基因，還是HBV 相關(guān)HCC 的易感基因。UBE2L3 與UBE2C 同屬E2s 家族[23]，在本研究中兩者共同參與構(gòu)成HCC 泛素化相關(guān)預(yù)后模型。這些證據(jù)表明UBE2C 是HCC 不良預(yù)后的生物標(biāo)志。

本研究用篩選得到的11 個(gè)URGs（UBE2C、PRKDC、WAC、PCNA、UBE2L3、UBE2S、UBE2E1、RNF20、UBE2J2、UBE2D2、UBB）來(lái)構(gòu)建HCC 預(yù)后模型，該模型預(yù)測(cè)HCC 患者1、2、3 年生存期的AUC 值分別為0.762、0.708、0.683；依此將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)患者總生存率低于低風(fēng)險(xiǎn)組。表明此組基因在HCC 中具有預(yù)測(cè)不良預(yù)后的能力，尤其是短期預(yù)測(cè)意義最為精確?？梢?jiàn)URGs 在HCC 的發(fā)展中存在重要作用，靶向URGs 的研究在HCC 中可能成為新的方向。