樸松哲 蔡仙國(guó) 柯莽 鄭蘭 周高波 陳超前

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）是腎癌最常見(jiàn)的病理類型，約占80%，細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)脂滴積聚。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修飾是近年來(lái)腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，研究表明m6A 修飾是真核細(xì)胞中豐度最高的RNA 修飾方式，參與基因表達(dá)調(diào)控中的多個(gè)環(huán)節(jié)，如RNA 剪切、成熟、出核、翻譯及降解，并影響多種生理、病理進(jìn)程，如胚胎發(fā)育、代謝穩(wěn)態(tài)維持和腫瘤發(fā)生、發(fā)展。越來(lái)越多的研究顯示m6A 修飾在腎癌，尤其是KIRC 演進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Wang 等[1]發(fā)現(xiàn)在KIRC 中抑制甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，METTL）14 基因表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)，且METTL14 mRNA 高表達(dá)患者總生存期（overall survival，OS）較低表達(dá)患者明顯延長(zhǎng)。Li等[2]發(fā)現(xiàn)METTL13 基因和蛋白在KIRC 組織中呈低水平表達(dá)，敲低METTL3 可明顯促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲功能，并誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1細(xì)胞周期停滯。然而烷烴羥化酶同源5 基因（alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5，ALKBH5）在KIRC 中的相關(guān)研究較少。最新研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5 作為m6A 去甲基化酶與腎癌代謝重編程和腫瘤細(xì)胞線粒體含量調(diào)節(jié)有關(guān)[3-4]。本研究利用生物信息學(xué)探討ALKBH5 mRNA 和蛋白在KIRC 組織中的表達(dá)情況，分析ALKBH5 與KIRC 患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為尋找KIRC 新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 本研究基于腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)與基因型和基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)（genotype-tissue expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)。登陸UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.xebabrowser.net），下載經(jīng)Toil 流程[5]統(tǒng)一處理的KIRC（531 例KIRC組織和72 例癌旁組織）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（kidney papillary renal cell carcinoma，KIRP）（291 例KIRP 組織和32例癌旁組織）及嫌色細(xì)胞癌（kidney chromophobe renal carcinoma，KICH）（66 例KICH 組織和25 例癌旁組織）項(xiàng)目的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNAseq）數(shù)據(jù)、患者臨床病理參數(shù)和OS 資料；登陸GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)，下載28 例正常腎組織RNAseq 數(shù)據(jù)。

1.2 表達(dá)差異分析 利用R 軟件（V4.0.0）“l(fā)imma”和“ggplot2”程序包比較KIRC 組織和癌旁組織中ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平。應(yīng)用阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校癌癥數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)庫(kù)（the University of Alabama at Birmingham cancer data analysis portal，UALCAN）（http://ualcan.path.uab.edu/ index.html）分析KIRC（110 例）和癌旁組織（84 例）中ALKBH5 蛋白的表達(dá)水平。

1.3 臨床信息分組 根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中KIRC 患者臨床資料對(duì)患者分組，去除無(wú)意義、缺失或重復(fù)的數(shù)據(jù)，根據(jù)年齡分為≤60 歲（271 例）和＞60 歲（275 例）；根據(jù)性別分為男（355 例）、女（191 例）；根據(jù)種族分為白人（474 例）和有色人種（亞裔+非洲裔，65 例）；根據(jù)美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)（American joint committee on cancer，AJCC）2007 分期分為Ⅰ～Ⅳ期，其中Ⅰ期276例，Ⅱ期59 例，Ⅲ期125 例，Ⅳ期83 例；根據(jù)組織學(xué)分級(jí)分為G1～G4級(jí)，其中G1級(jí)14 例，G2級(jí)238 例，G3級(jí)208例，G4級(jí)78 例。登陸UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)KIRC 分子亞型分為A 亞型（205 例）和B 亞型（175 例）[6]。酵母交換型轉(zhuǎn)換/蔗糖不發(fā)酵（yeast switch in mating type/sucrose non fermentation，SWI/SNF）是一種ATP 依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物，SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合物缺陷被認(rèn)為與腎癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。根據(jù)SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物是否突變分為突變組（98 例）和未突變組（84例），并比較兩組ALKBH5蛋白的表達(dá)水平。

1.4 ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平對(duì)KIRC 患者預(yù)后的影響 從UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取KIRC 患者信息，去除正常組織、無(wú)臨床信息及重復(fù)的數(shù)據(jù)，根據(jù)ALKBH5 mRNA 中位表達(dá)水平分為高、低表達(dá)組；按性別將KIRC 患者分為不同亞組（男性高表達(dá)組和男性低表達(dá)組、女性高表達(dá)組和女性低表達(dá)組），對(duì)不同亞組進(jìn)行生存分析，采用log-rank 檢驗(yàn)比較不同組間的生存率。

1.5 基因文庫(kù)富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 使用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.linkedomics.org/login.php）的LinkFinder 模塊分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)KIRC 隊(duì)列（479 例）中與ALKBH5 相關(guān)的差異表達(dá)基因。結(jié)果采用Spearman 秩相關(guān)分析。使用Linked-Omics 的Link-Interpreter 模塊對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路和網(wǎng)絡(luò)分析。采用GSEA 對(duì)LinkFinder 結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行基因功能富集分析，顯著富集的閾值為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25 且P＜0.05。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用R（4.0.3）軟件，分別使用ggplot2（3.3.6）、stats（4.2.1）、car、pROC（1.18.0）、survival用于統(tǒng)計(jì)和圖形分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，繪制ROC 曲線評(píng)估ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平對(duì)KIRC、KIRP 和KICH 的診斷價(jià)值；采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank 檢驗(yàn)生存曲線并評(píng)估患者總生存率。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALKBH5 mRNA 和蛋白在KIRC 組織和癌旁組織中表達(dá)的比較 與癌旁組織比較，KIRC 組織中ALKBH5 mRNA 顯著高表達(dá)（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。與癌旁組織比較，KIRC 組織中ALKBH5 蛋白也顯著高表達(dá)（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。

圖1 ALKBH5 mRNA 和蛋白在KIRC 組織和癌旁組織中表達(dá)的比較（A：基于FPKM 的ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平比較；B：基于CPTAC z 值的ALKBH5 蛋白表達(dá)水平比較）

2.2 不同臨床病理特征KIRC 患者KIRC 組織中ALKBH5 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較 不同年齡、種族、病理分期、組織學(xué)分級(jí)的KIRC 患者KIRC 組織中ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。相比男性KIRC 患者，女性KIRC 患者KIRC組織中ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。相比B 亞型KIRC 患者，A 亞型KIRC 患者KIRC 組織中ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。相比SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合物未突變組KRIC 患者，SWI/SNF 復(fù)合物突變組患者ALKBH5 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 不同臨床病理特征KIRC 患者KIRC 組織中ALKBH5 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較（A：年齡；B：種族；C：病理分期；D：性別；E：組織學(xué)分級(jí)；F：分子亞型；G：SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合物突變情況）

2.3 ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平對(duì)不同類型腎癌的診斷價(jià)值 ROC 曲線分析顯示，ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平診斷KIRC 的AUC 為0.813（95%CI：0.775～0.850），最佳截?cái)嘀禐?.583，靈敏度為0.667，特異度為0.900；診斷KIRP 的AUC 為0.605（95%CI：0.530～0.680），最佳截?cái)嘀禐?.110，靈敏度為0.218，特異度為0.950；診斷KICH的AUC 為0.707（95%CI：0.607～0.807），最佳截?cái)嘀禐?.086，靈敏度為0.818，特異度為0.604。ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平對(duì)KIRC 的診斷價(jià)值最大，見(jiàn)圖3。

圖3 ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平診斷不同類型腎癌的ROC 曲線

2.4 ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平與KIRC 患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 生存曲線表明，ALKBH5 mRNA 高表達(dá)組患者總生存率高于低表達(dá)組（P＜0.01）。亞組分析顯示，男性KIRC 患者ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平對(duì)預(yù)后無(wú)顯著影響（P＞0.05）；但對(duì)女性KIRC 患者，與ALKBH5 mRNA 低表達(dá)組比較，ALKBH5 mRNA 高表達(dá)組總生存率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平與KIRC 患者預(yù)后的關(guān)系（A：KIRC 患者總生存率分析；B：女性亞組總生存率分析；C：男性亞組總生存率分析）

2.5 ALKBH5 在KIRC 中可能參與的信號(hào)通路GSEA 富集分析結(jié)果顯示，ALKBH5 mRNA 在糖酵解通路中的標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)為2.30，F(xiàn)DR＜0.01，P＜0.01；在果糖和甘露糖代謝通路中的標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)為2.27，F(xiàn)DR＜0.01，P＜0.01；在氨基酸生物合成通路中的標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)為2.18，F(xiàn)DR＜0.01，P＜0.01，見(jiàn)圖5。

圖5 ALKBH5 在KIRC 中可能參與的信號(hào)通路（A：糖酵解；B：果糖和甘露糖代謝；C：氨基酸生物合成）

3 討論

ALKBH5 基因位于染色體17p11.2，其編碼蛋白含有394 個(gè)氨基酸殘基，分子量約43 kD，屬于非血紅素鐵（Ⅱ）/雙加氧酶的α-烷烴羥化酶（alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase，ALKB）家族，是高度保守的mRNA 結(jié)合蛋白。至今為止在哺乳動(dòng)物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)9個(gè)ALKB 家族成員，分別為ALKBH1～8 和fat mass-and obesity-associated（FTO），其中ALKBH5 和FTO 同為m6A 去甲基化酶。不同于FTO，ALKBH5 對(duì)N6，2-O-二甲基腺苷（N6，2-O-dimethyladenosine，m6Am）無(wú)活性，可直接催化m6A 甲基化腺苷去除甲基，從而降低靶基因的m6A 水平，調(diào)控基因表達(dá)參與細(xì)胞生命活動(dòng)及功能調(diào)節(jié)，且不產(chǎn)生中間產(chǎn)物。目前研究認(rèn)為ALKBH5 在腫瘤細(xì)胞中既可發(fā)揮促癌作用亦可發(fā)揮抑癌作用。Chao 等[10]研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5 在肺腺癌組織中高表達(dá)，通過(guò)人叉頭框蛋白M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）mRNA 翻譯效率來(lái)提高腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。在乳腺癌中，低氧刺激可上調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ALKBH5 mRNA 水平，介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中乳腺癌干細(xì)胞的富集[11]。相反，ALKBH5 在胰腺癌中低表達(dá)，能夠提高胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[12]。但目前ALKBH5 在腎癌中的研究相對(duì)較少。

本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)探索ALKBH5 基因在KIRC 中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KIRC 組織中ALKBH5 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均高于癌旁組織，與以往研究結(jié)果一致[3，13]。Guimar?es-Teixeira 等[13]研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5 mRNA 在KIRC 中的表達(dá)水平高于KIRP 和KICH。本研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5 診斷KIRC 的AUC 為0.813，高于KIRP（AUC=0.633）和KICH（AUC=0.707），說(shuō)明ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平可較好區(qū)分KIRC 和其他類型腎細(xì)胞癌，有望成為KIRC 診斷的生物標(biāo)志物。結(jié)合KIRC 患者的臨床資料進(jìn)行生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)女性KIRC 患者腫瘤組織中ALKBH5 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均高于男性患者，提示ALKBH5 基因和蛋白表達(dá)水平可能與性別、性激素水平等因素有關(guān)。值得注意的是，KIRC 具有顯著的異質(zhì)性。Brooks 等[6]基于34 個(gè)基因?qū)IRC 分成低風(fēng)險(xiǎn)（A 型）和高風(fēng)險(xiǎn)（B 型）兩種分子亞型。本研究發(fā)現(xiàn)，A 型KIRC 組織ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平顯著高于B 型KIRC 組織，且生存分析發(fā)現(xiàn)ALKBH5 mRNA 低表達(dá)的KIRC 患者預(yù)后不良，與Brooks 等[6]的研究結(jié)果一致。SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物被證明與KIRC 進(jìn)展關(guān)系密切[14-15]。本研究中SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合物突變組ALKBH5 蛋白表達(dá)水平高于SWI/SNF 復(fù)合物未突變組。人類SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合體由15 個(gè)組分組成，包括1 個(gè)催化ATP 酶亞基[SWI/SNF related,matrix associated，actin dependent regulator of chromatin，subfamily A，member 4，（SMARCA4）或SMARCA2]和其他3 個(gè) 核 心 亞 基（SMARCB1、SMARCC1 和SMARCC2）[16]。雙植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain，PHD）鋅指家族3（double PHD fingers 3，DPF3）屬于D4 蛋白家族，是SWI/SNF 復(fù)合體的非催化亞基。DPF3 表達(dá)DPF3a 和DPF3b 兩種剪接變體。Cui等[17]通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DPF3a 可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移，這與臨床觀察到的DPF3a 在KIRC 轉(zhuǎn)移患者中顯著上調(diào)的結(jié)果一致[18]。在機(jī)制上，過(guò)表達(dá)DPF3a 可上調(diào)TGF-β 信號(hào)通路相關(guān)的基因表達(dá)[17]，而TGF-β 是上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）表型的主要誘導(dǎo)因子，是促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路。有研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）中，過(guò)表達(dá)ALKBH5 可抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT，并增強(qiáng)NSCLC 細(xì)胞的侵襲能力[19]。然而在KIRC 細(xì)胞系769-P 中敲低ALKBH5 可下調(diào)間質(zhì)化分子標(biāo)志物蛋白波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)水平[20]。推測(cè)ALKBH5 在不同組織中、在腫瘤細(xì)胞不同的惡性條件下、不同的細(xì)胞內(nèi)外通路中對(duì)EMT 的調(diào)控作用是有差別的。此外，Colli 等[21]和Protze 等[18]發(fā)現(xiàn)位于DPF3 第1 個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)（rs4903064）可產(chǎn)生一種缺氧反應(yīng)增強(qiáng)子，其活性受Von Hippel-Lindau（VHL）腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)，從而影響體外KIRC 細(xì)胞的增殖能力。在KIRC 患者的VHL 突變較為常見(jiàn)。DPF3 在KIRC 患者中顯著上調(diào)，在存在VHL 突變的患者中尤為明顯。VHL 的缺失導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白水平上調(diào)，進(jìn)而激活參與增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的基因的轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，最新研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5 啟動(dòng)子區(qū)存在HIF-1α 的結(jié)合位點(diǎn)，其核心序列為5'-RCGTG-3'，被稱為缺氧反應(yīng)元件chypoxia-responsive element，HRE），分別位于-486/-482（HRE A）和+265/+269（HRE B）。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和熒光素酶實(shí)驗(yàn)均證實(shí)ALKBH5 HRE A 與HIF-1α 結(jié)合，未與HIF-2α 結(jié)合[22]。低氧條件可誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞中的ALKBH5 基因表達(dá)水平上調(diào)，且該過(guò)程是HIF-1α 依賴性的。因此，本研究推測(cè)在KIRC 中SWI/SNF 復(fù)合物突變（DPF3 基因rs4903064 位點(diǎn)）產(chǎn)生缺氧反應(yīng)增強(qiáng)子，通過(guò)HIF-1α 上調(diào)ALKBH5的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EMT 過(guò)程。

ALKBH5 mRNA 和蛋白高表達(dá)可能在KIRC 的演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。本研究生存分析顯示，ALKBH5 mRNA 高表達(dá)的KIRC 患者總生存率高于低表達(dá)者。Guimar?es-Teixeira 等[13]研究結(jié)果顯示ALKBH5 mRNA表達(dá)水平與患者預(yù)后無(wú)關(guān)。Zhang 等[3]研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5 高表達(dá)與KIRC 腫瘤體積較大、高惡性度、預(yù)后較差相關(guān)。上訴結(jié)果與本研究分析結(jié)果不同，可能與樣本量及研究方法不同有關(guān)。本研究進(jìn)一步按性別進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示在女性KIRC 患者中，與ALKBH5 低表達(dá)組比較，ALKBH5 高表達(dá)組患者總生存率顯著增高；然而，在男性KIRC 患者中，ALKBH5 mRNA表達(dá)水平對(duì)預(yù)后無(wú)顯著影響。提示ALKBH5 mRNA 表達(dá)水平可成為女性KIRC 患者判斷預(yù)后的有效標(biāo)志物，但具體機(jī)制尚不清楚。

本研究的GSEA 富集分析結(jié)果顯示ALKBH5 mRNA 可能參與糖酵解、果糖和甘露糖代謝、氨基酸生物合成等信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5 啟動(dòng)子區(qū)-486/-482 存在HIF-1α 的結(jié)合位點(diǎn),在多種細(xì)胞系中，DNA 損傷和缺氧環(huán)境可以激活A(yù)LKBH 5 基因的轉(zhuǎn)錄[23]。以上結(jié)果說(shuō)明ALKBH5 可能通過(guò)調(diào)控KIRC 的糖酵解過(guò)程在腎癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上可知，ALKBH5 作為促瘤因子在KIRC 發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后評(píng)估過(guò)程中發(fā)揮重要作用，推測(cè)ALKNH5 有成為KIRC 診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在可能，同時(shí)為臨床評(píng)估患者預(yù)后提供理論依據(jù)。