鐘麗萍,王 尖,吳曉花,汪 穎,吳新義,汪寶根,魯忠富,王華森,*,李國(guó)景,*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 園藝科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 311300; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310021)

瓠瓜[Lagenariasiceraria(Molina) Standl.](2n=2x=22)別名葫蘆、夜開花、瓠子、地蒲,最早起源于非洲。瓠瓜在我國(guó)常年種植面積超過13萬(wàn)hm2,產(chǎn)值200多億元,經(jīng)濟(jì)效益十分顯著,是我國(guó)南方夏季特色蔬菜之一,主要栽培地區(qū)為浙江、福建、湖北、安徽、廣東等南方省區(qū)[1]。

白粉病(powdery mildew, PM)是瓠瓜生產(chǎn)上最主要的病害之一,也是葫蘆科其他瓜類作物中共有的病害,其分布廣泛,流行性強(qiáng),嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。因此,選育和推廣抗病品種是目前防治白粉病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法,而挖掘定位抗白粉病基因/QTL、利用白粉病抗性分子標(biāo)記是加快瓜類抗白粉病品種選育的前提和基礎(chǔ)[2]。當(dāng)前,其他葫蘆科作物在白粉病抗病基因定位方面都有不同程度的研究。Zhang等[3]將BSA與SLAF-seq方法相結(jié)合,在黃瓜1號(hào)和6號(hào)染色體上定位到兩個(gè)主要的區(qū)間,挖掘到5個(gè)黃瓜抗白粉病的候選基因;郝俊杰等[4]構(gòu)建分離群體進(jìn)行BSA-seq和精細(xì)定位,將黃瓜白粉病抗性基因精細(xì)定位在5號(hào)染色體上位于兩個(gè)SSR標(biāo)記間約238 kb的候選區(qū)段內(nèi),推測(cè)區(qū)段內(nèi)TIR-NBS-LRR類基因是重點(diǎn)候選基因;Zhang等[5]利用QTL-seq技術(shù)在韓國(guó)黃瓜品種中定位到兩個(gè)主效QTL(pm5.2和pm6.1),并找到抗白粉病的候選基因CsGy5G015660,該基因涉及編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RPK2。Cao等[6]在甜瓜第12號(hào)染色體上鑒定到新的抗白粉病QTL(qCmPMR-12),RNA-Seq分析表明,MELO3C002434基因是最有可能與抗白粉病相關(guān)的候選基因。另外,研究發(fā)現(xiàn)MLO類基因也是白粉病抗病中的一個(gè)大類 。在擬南芥、月季、大麥等植物中已證明某個(gè)或多個(gè)特定MLO基因突變體能夠引起對(duì)白粉病的廣譜抗性[7-9]。而葫蘆科植物中有關(guān)MLO基因的報(bào)道較少,目前在甜瓜、黃瓜、南瓜、西瓜中利用生物信息學(xué)方法對(duì)其MLO基因家族進(jìn)行了鑒定與分析[10-11],甜瓜中的CmMLO2被發(fā)現(xiàn)可能在白粉病的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。但目前僅有少量關(guān)于瓠瓜白粉病抗性的研究報(bào)道,除王玲平等[12]開發(fā)了一個(gè)白粉病連鎖的SCAR標(biāo)記,吳曉花等[13]鑒定到2個(gè)SNPs與白粉病抗性相關(guān)外,沒有抗病基因被精細(xì)定位與克隆。本課題組利用長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)(PacBio、BioNano)構(gòu)建了瓠瓜高質(zhì)量基因組,其contig N50(11.2 Mb)較之前的參考基因組提高了390倍[14]。這為挖掘和定位瓠瓜抗白粉病基因奠定了良好的遺傳基礎(chǔ)。

MAGIC(multi-parent advanced generation inter-cross)群體,是一種較常規(guī)F2、重組自交系等更為復(fù)雜的作圖群體。MAGIC群體親本數(shù)目較多、無(wú)群體結(jié)構(gòu)干擾、重組豐富,多代雜交能有效打破較長(zhǎng)范圍內(nèi)的連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD),可極大提高目標(biāo)QTL定位精度。Islam等[15]利用GWAS分析11個(gè)棉花親本構(gòu)建的MAGIC群體,揭示了GhRBB1_A07基因與棉花優(yōu)良纖維品質(zhì)的功能關(guān)聯(lián);Bossa-Castro等[16]通過GWAS分析水稻的8親本MAGIC群體,檢測(cè)到11個(gè)和抗病相關(guān)的QTLs;Ravelombola等[17]利用GWAS評(píng)估8親本豇豆MAGIC群體的耐鹽性,鑒定到與耐鹽性相關(guān)的SNPs。但至今未有葫蘆科MAGIC群體的相關(guān)研究報(bào)道。

本研究利用8個(gè)瓠瓜親本構(gòu)建的MAGIC群體,以多代自交后純合的F8代203個(gè)株系為材料,通過苗期接種白粉病鑒定不同株系的抗病表型,結(jié)合重測(cè)序獲得的基因型數(shù)據(jù)開展GWAS分析,挖掘與白粉病抗性相關(guān)的顯著SNP位點(diǎn),分析瓠瓜白粉病抗性的候選基因,研究結(jié)果為瓠瓜抗白粉病基因克隆和分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究中MAGIC群體的8個(gè)親本為J083(抗白粉病)、HZCG(感白粉病)、J077、J120、G32、Yaohulu、J104、J098,通過多代人工自交獲得純系F8代203個(gè)株系作為研究MAGIC群體的材料(圖1)[18]。

圖1 八個(gè)MAGIC群體的親本(A)和MAGIC群體構(gòu)建流程圖(B)Fig.1 Eight MAGIC population parents (A) and MAGIC population construction flow chart (B)

1.2 白粉病抗性表型鑒定

將203份材料的種子在3%鹽酸中浸泡15 min,清水洗凈后在28℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽,等種子露白后播于基質(zhì)中,在日光溫室中育苗,待幼苗長(zhǎng)至一葉一心期移栽到18 cm×20 cm的塑料花盆內(nèi),每個(gè)株系共16株(每盆4株,3個(gè)重復(fù),1個(gè)對(duì)照)。分別在2020和2021年對(duì)203個(gè)株系的瓠瓜白粉病抗性進(jìn)行鑒定。白粉病孢子采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海寧試驗(yàn)基地瓠瓜田白粉病病葉,用蒸餾水將孢子制成1×105mL-1的孢子懸浮液,采用溫室噴霧接種法對(duì)二葉一心期的材料進(jìn)行苗期人工接種鑒定,接種白粉病菌10 d后進(jìn)行白粉病病情指數(shù)調(diào)查。根據(jù)不同的發(fā)病情況進(jìn)行病情分級(jí),計(jì)算出最后病情指數(shù)。病情指數(shù)公式:

式中:VDI為病情指數(shù),si為發(fā)病級(jí)別,ni為相應(yīng)病級(jí)級(jí)別的株數(shù),i為病情分級(jí)的各個(gè)級(jí)別,N為調(diào)查總株數(shù)。按照沈鏑等[19]制訂的白粉病病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),分為0～5級(jí)。

1.3 基因型鑒定

使用CTAB法提取新鮮葉片中的DNA,基因組DNA用內(nèi)切酶隨機(jī)打斷成短的DNA片段后,進(jìn)行平末端修復(fù)。然后在DNA片段兩端連接dA尾,并連接測(cè)序接頭。加上接頭的DNA片段經(jīng)過AMPure XP磁珠進(jìn)行純化,并選擇300～400 bp的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建好的文庫(kù)經(jīng)過純化、庫(kù)檢,采用Hiseq X10 PE150進(jìn)行雙末端測(cè)序?；赑LINK v1.9軟件篩選MAGIC群體的SNP標(biāo)記,過濾掉MAF<0.05,H>0.1的SNP標(biāo)記,根據(jù)HZCG參考基因組序列鑒定到221 043個(gè)高質(zhì)量的SNPs用于后續(xù)分析(基因組上標(biāo)記密度為0.059 SNP·kb-1)。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel軟件基于GLM(PCA)、GLM(Q)、MLM(PCA+K)和MLM(Q+K)4種關(guān)聯(lián)分析模型對(duì)瓠瓜MAGIC群體白粉病抗性進(jìn)行GWAS分析,以-lgP≥4為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著相關(guān)的SNP,對(duì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果繪制相應(yīng)的Manhattan-Plot和QQ-Plot,根據(jù)QQ圖期望P值和預(yù)測(cè)P值的擬合程度,綜合考慮后選擇GLM(PCA)的模型進(jìn)行瓠瓜白粉病病情指數(shù)與標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)分析。

1.5 候選基因的預(yù)測(cè)和功能注釋

以瓠瓜HZCG為參考基因組,根據(jù)兩年與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)且表型解釋率較高的位點(diǎn)的物理位置,兩端各延伸群體的LD衰減距離為邊界確定候選區(qū)間的范圍,根據(jù)瓠瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的基因注釋信息(http://www.gourdbase.cn/),對(duì)候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)與功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓠瓜MAGIC群體抗白粉病鑒定結(jié)果

對(duì)2020和2021年的203份株系的MAGIC群體材料進(jìn)行苗期人工接種鑒定,按照病情指數(shù)將所有材料劃分為5種類型:高抗(VDI為0～0.15);抗病(0.150.75)(圖2)。兩年的試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)抗白粉病類型的分布呈現(xiàn)正態(tài)分布(圖2、圖3),在2020年和2021年呈現(xiàn)感病和中等抗性的株系占絕大多數(shù),說明白粉病抗性屬于數(shù)量性狀,在MAGIC群體株系間差異廣泛。

A和B分別表示2020年和2021年的表型數(shù)據(jù)。A and B represent phenotype data in 2020 and 2021 respectively.圖2 瓠瓜MAGIC群體白粉病抗性類型Fig.2 Type of powdery mildew resistance in the MAGIC population of bottle gourd

2.2 群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系及連鎖不平衡分析

基于篩選得到的SNP標(biāo)記,用MEGA軟件進(jìn)行NJ樹的構(gòu)建, MAGIC群體被分成8個(gè)大類(圖4-A)。使用Admixture軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的推斷,分別假設(shè)樣品的分群數(shù)(K值)為1～12,然后進(jìn)行聚類。根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率(cross-validation error, CV error)來確定最優(yōu)分群數(shù)。當(dāng)K=8時(shí),CV error最小,所以群體結(jié)構(gòu)將MAGIC群體分成8個(gè)亞群(圖4-B和D)。進(jìn)行主成分分析,獲得各個(gè)主成分的方差解釋率及群體在各個(gè)主成分中的得分矩陣,可以看出群體的遺傳分類也是分成8個(gè)組(圖4-C)。群體分類情況顯示,MAGIC群體8個(gè)親本親緣關(guān)系分布合理,雜交后代重組充分,為基因定位的良好群體。MAGIC群體親緣關(guān)系是基于TASSEL軟件中pairwise IBS法計(jì)算的,計(jì)算得到的K矩陣代表不同材料間的親緣關(guān)系(圖5-A),K矩陣在關(guān)聯(lián)分析中和Q矩陣效果類似,作為關(guān)聯(lián)分析的協(xié)變量用于減少結(jié)果的假陽(yáng)性。利用PopldDecay軟件對(duì)SNP標(biāo)記之間的R2進(jìn)行計(jì)算,根據(jù)R2估算瓠瓜MAGIC群體的LD水平,LD衰減距離為400 kb左右(圖5-B)。

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)

利用Tassel軟件基于GLM(PCA)、GLM(Q)、MLM(PCA+K)和MLM(Q+K) 4種關(guān)聯(lián)分析模型,以評(píng)價(jià)群體結(jié)構(gòu)(Q)、主成分分析(PCA)和親緣關(guān)系(K)對(duì)控制假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)的效果。比較4個(gè)模型下觀察到的P值和預(yù)期P值之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)MLM(Q+K)和MLM(PCA+K)模型下觀察的P值和預(yù)期P值之間偏離程度較大(圖6),可能造成較高的假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)。綜合分析最終選擇GLM(PCA)對(duì)瓠瓜MAGIC群體白粉病抗性進(jìn)行GWAS分析(圖7)。在2020年的數(shù)據(jù)中檢測(cè)到204個(gè)超過閾值的SNP,在2021年中檢測(cè)到50個(gè)超過閾值的SNP,經(jīng)過分析篩選,兩年內(nèi)重復(fù)檢測(cè)到46個(gè)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)(表1),位于瓠瓜4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、10號(hào)和11號(hào)染色體上,其中33個(gè)位于6號(hào)染色體上且距離較近,可能位于一個(gè)或者兩個(gè)QTL內(nèi),33個(gè)SNP分布在6號(hào)染色體的24～26 MB的位置區(qū)間,其中在6號(hào)染色體上這些位點(diǎn)表型變異解釋的范圍為10%～16%。

2.4 候選基因的預(yù)測(cè)

由于MAGIC群體的LD衰減距離約為400 kb,經(jīng)過與瓠瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的基因注釋信息(http://www.gourdbase.cn/)進(jìn)行對(duì)比,在顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)上下游400 kb內(nèi)共找到32個(gè)與抗病相關(guān)的基因,其中預(yù)測(cè)有9個(gè)基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、有2個(gè)是非典型的R蛋白基因編碼跨膜受體蛋白的富含半胱氨酸受體蛋白,還有1個(gè)基因是典型的MLO基因(表2),這3類蛋白在前人研究中[20-23]已經(jīng)明確地表明與白粉病抗性相關(guān),后續(xù)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。

表2 候選基因的染色體、位置、基因注釋

3 討論

瓠瓜白粉病主要由白粉菌Podosphaeraxanthii(Sphaerothecafuliginea)引起。在高濕高溫的條件下,患病植株由一開始的粉末斑點(diǎn)逐漸蔓延至一層厚厚的白色粉末。目前生產(chǎn)上主要通過種植抗病品種、施用殺菌劑和輪作種植等方法來解決,但防治效果甚微,易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留的食品安全問題。

瓠瓜作為我國(guó)南方地區(qū)夏季重要的特色瓜類蔬菜,在白粉病抗性基因的研究進(jìn)展目前仍處于起步階段。近年來,隨著瓠瓜上大量的SSR、InDel、SNP標(biāo)記的開發(fā)以及高密度遺傳圖譜、高質(zhì)量瓠瓜基因組的構(gòu)建[14,24],挖掘和定位瓠瓜抗白粉病基因的條件已經(jīng)成熟。在傳統(tǒng)的QTL定位中,通常使用雙親群體來確定影響表型性狀基因座的基因組位置和效應(yīng)大小[26-28]。這種方法通常分辨率較低,因?yàn)槊總€(gè)位點(diǎn)只分析2個(gè)等位基因,且遺傳重組有限。構(gòu)建MAGIC有望獲得更高的遺傳多樣性、更小的單倍型區(qū)域、更高的重組率和更好的定位分辨率[29]。此外,由于高通量SNP基因分型平臺(tái)的發(fā)展和統(tǒng)計(jì)方法的進(jìn)步,多親本群體現(xiàn)在對(duì)研究人員具有很大的吸引力。本研究是第一次在葫蘆科作物中構(gòu)建MAGIC群體,結(jié)合GWAS分析進(jìn)行白粉病抗病基因定位。通過構(gòu)建MAGIC可以更加精準(zhǔn)、高效定位到抗病基因。

MAGIC群體親本之一的J083是本課題組多年種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中篩選鑒定出的一份優(yōu)異瓠瓜材料,在大多數(shù)瓠瓜品種都不抗白粉病的情況下,J083對(duì)白粉病的抗性達(dá)到近乎免疫水平?；诳拱追鄄》N質(zhì)材料J083、感病品種HZCG等8個(gè)親本構(gòu)建的MAGIC群體,利用GWAS分析兩年的數(shù)據(jù),篩選出了46個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn),進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)了12個(gè)基因可能與瓠瓜白粉病抗病相關(guān),在已有的相關(guān)報(bào)道中這些都是屬于典型的白粉病抗性基因類別,例如Zhang等[5]利用QTL-seq技術(shù)在韓國(guó)黃瓜品種中找到抗白粉病的候選基因CsGy5G015660,該基因涉及編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RPK2;Xu等[30]在41.1 kb的區(qū)域掃描到一個(gè)顯性遺傳的PM抗性QTL,并從jin5-508衍生的SSSL0.7系中鑒定了兩個(gè)富含半胱氨酸的受體樣激酶基因(Csa1M064780和Csa1M064790)作為候選基因;Cheng等[31]從甜瓜中克隆出MLO基因,并命名為CmMLO2,發(fā)現(xiàn)其可能在白粉病的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用。本研究為克隆抗白粉病基因明確其功能,深入解析瓠瓜抗白粉病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),對(duì)瓠瓜抗白粉病分子育種具有重要意義,同時(shí)為葫蘆科其他作物的抗白粉病研究提供有力支撐。