劉方程,王 峰,畢冬琳,楊東亮,楊曉莉,柏家林,李瓊毅,*

(西北民族大學(xué) a. 生物醫(yī)學(xué)研究中心,生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b. 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

兔出血癥病毒(Rabbithaemorrhagicdiseasevirus, RHDV)是兔出血癥(rabbit haemorrhagic disease, RHD)的病原體,又名兔瘟。1984年,我國(guó)首次報(bào)道了兔出血癥的流行,在之后的12個(gè)月內(nèi)中國(guó)約有1.4億只家兔因兔出血癥死亡[1]。該疾病在短時(shí)間內(nèi)傳播到約50萬(wàn)km2的區(qū)域,并且在接下來(lái)的10年里,該病毒在全球范圍內(nèi)傳播,嚴(yán)重威脅世界范圍內(nèi)養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展[2-6]。

成熟RHDV為單股正鏈RNA病毒,呈球形,直徑約32～35 nm,無(wú)包膜,表面有典型的杯狀凹陷[7]。RHDV基因組全長(zhǎng)約7.5 kb,含有2個(gè)重疊的開(kāi)放閱讀框(ORF),ORF1編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白VP60和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[p16、p23、解旋酶、p29、VPg、蛋白酶和RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)][8];ORF2則編碼次級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白VP10[9]。根據(jù)VP60基因組序列,RHDV可分為GⅠ和GⅡ兩個(gè)基因群:GⅠ包括GⅠ.1～GⅠ.4共4種基因型,其中GⅠ.1(RHDV1)和GⅠ.2(RHDV2)是兔感染RHD的主要病原體,GⅠ.3和GⅠ.4無(wú)致病性;GⅡ包括歐洲棕兔綜合征病毒(EBHSV)和與EBHSV相關(guān)的非致病性兔杯狀病毒(Harecalicivirus, HaCV)[10]。

成年兔對(duì)GⅠ.1型RHDV易感,死亡率達(dá)90%以上;但2月齡幼兔感染后發(fā)病率較低,3周齡幼兔不發(fā)病[1]。幼兔對(duì)RHDV的易感性隨年齡的增加而增加,直到9周齡其發(fā)病率、死亡率與成年兔一樣[11-12]。幼兔對(duì)GⅠ.1型RHDV的天然抗病機(jī)制尚不明確,但可能與幼兔和成年兔肝結(jié)構(gòu)功能不同[12-13]及固有免疫應(yīng)答差異相關(guān)[14-16]。目前,由于沒(méi)有適宜體外復(fù)制增殖的細(xì)胞系,RHDV致病機(jī)制等相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。正因?yàn)橛淄脤?duì)其存在天然抵抗性,故尋找并分析關(guān)鍵的差異蛋白質(zhì)對(duì)RHDV易感性的影響將為其致病機(jī)制研究和疫苗研發(fā)帶來(lái)新突破。本文運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記(tadem mass tags, TMT)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析對(duì)2周齡幼年兔和6月齡成年兔肝中差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,旨在從蛋白質(zhì)水平闡明成年兔和幼年兔對(duì)RHDV易感性差異的分子機(jī)制,為研究RHDV易感染宿主細(xì)胞的潛在靶點(diǎn)和RHDV體外擴(kuò)增細(xì)胞系的構(gòu)建提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

未接種RHDV疫苗的2周齡幼年和6月齡成年新西蘭兔各3只,購(gòu)自甘肅省水思圓智能科技工程有限公司。將兔用空氣栓塞法處死,解剖采集肝組織,切成1 cm×1 cm×1 cm大小方塊,用錫箔紙包裹,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ媚I細(xì)胞系RK-13購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC);TMT分子標(biāo)記試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、乙醇、甲酸、乙腈、丙酮、納升級(jí)肽段分析柱(75 μm×250 mm)和HSPA9兔單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司;4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三氟乙酸(TFA)和甲酸銨均購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)和測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司;三乙基碳酸氫銨(TEAB)和25%氨水購(gòu)自上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司;Sep-Pak C18除鹽柱(100 mg)和高pH反相色譜柱均購(gòu)自上海沃特世有限公司;尿素購(gòu)自美國(guó)英杰生物技術(shù)有限公司;KRT8鼠單克隆抗體、KRT18鼠單克隆抗體、ACAT1兔單克隆抗體、ALDH1A1兔單克隆抗體和GAPDH鼠單克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司;SLBP兔單克隆抗體、山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自上海睿鉑賽生物科技有限公司;Hyper Signal高敏ECL發(fā)光底物購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司;磷酸緩沖鹽液(PBS,pH值7.2～7.4)、10×電轉(zhuǎn)液、RIPA裂解液和TBST緩沖液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 蛋白質(zhì)提取、酶解

將-80 ℃保存的肝組織研磨后加入1.0 mL裂解液,放于冰上超聲破碎10 min,4 ℃、20 000×g離心30 min,取上清液,使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。吸取100 μg蛋白質(zhì)溶液,添加1 mol·L-1三乙基碳酸氫銨(TEAB)至100 μL,加入二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)至終濃度為0.1 mol·L-1,56 ℃還原1 h,加入碘乙酰胺(IAA)至終濃度0.55 mol·L-1,室溫避光孵育1 h;加入預(yù)冷丙酮沉淀蛋白質(zhì),離心收集沉淀;加入1 mL 50%丙酮、50%乙醇溶液混懸沉淀,-20 ℃沉淀3 h以上;離心、收集沉淀,加入100 μL 1 mol·L-1TEAB溶液復(fù)溶沉淀,加入胰蛋白酶37 ℃反應(yīng)12 h,酶解蛋白質(zhì)懸浮液。

1.3 肽段標(biāo)記

根據(jù)TMT分子標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書對(duì)每個(gè)樣品肽段進(jìn)行標(biāo)記,將TMT試劑溶于150 μL異丙醇,取100 μg樣品肽段,加入已溶解的TMT試劑,于室溫下反應(yīng)2 h后,加入100 μL超純水終止反應(yīng);隨后將樣品離心,真空冷凍干燥。

1.4 標(biāo)記肽段除鹽

將標(biāo)記后的干燥樣品溶于400 μL 0.1% TFA、0.5%乙腈溶液,使用200 μL 0.1% TFA、60%乙腈活化除鹽柱,加入400～600 μL 0.1% TFA、1%乙腈溶液平衡除鹽柱,將重溶樣品加入除鹽柱內(nèi),使樣品緩慢流過(guò)除鹽柱,標(biāo)記肽段被除鹽柱捕集,鹽和其他非疏水性小分子流出、舍棄。再添加200 μL 0.1% TFA、0.5%乙腈溶液清洗除鹽柱,洗去殘留鹽類。添加300 μL 0.1% TFA、60%乙腈溶液,使液體緩慢流過(guò)除鹽柱,將肽段洗脫下來(lái),使用新EP管收集洗脫溶液。最后將洗脫溶液冷凍干燥,去除乙腈。

1.5 反相色譜分離與質(zhì)譜

用Waters公司的H-Class超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離,高pH流動(dòng)相A為pH值10.0的0.1 mol·L-1甲酸銨,高pH流動(dòng)相B為pH值10.0的0.1 mol·L-1甲酸銨、90%乙腈,色譜柱為超高效色譜柱(BEH C18 1.7 μm, 2.1 mm×150 mm),上樣量50 μL,流速250 μL·min-1,215 nm紫外光譜檢測(cè)。結(jié)束色譜分離后,用Q Exative質(zhì)譜分析肽段。離子源噴霧電壓為2.0 kV,Q Exative質(zhì)譜儀加熱毛細(xì)管設(shè)定溫度為320 ℃,采用數(shù)據(jù)依賴模式自動(dòng)在MS和MS/MS間切換采集。條件設(shè)置:最大進(jìn)樣時(shí)間50 ms,全掃描分辨率17 500 FWHM,MS/MS分辨率50 000 FWHM,母離子掃描范圍110～2 000 m/z,碰撞能量30 eV。

1.6 蛋白質(zhì)鑒定和定量檢測(cè)

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入到Proteome Discoverer(PD)軟件(version 1.4.0.288, Thermo Fisher Scientific)后,軟件先對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行篩選。PD軟件提取后的譜圖用Mascot(version 2.3.2, Matrix Science)進(jìn)行搜索,搜索結(jié)束后PD軟件根據(jù)Mascot搜索結(jié)果和質(zhì)譜圖進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)組學(xué)原始數(shù)據(jù)庫(kù)已通過(guò)iProX存儲(chǔ)庫(kù)存入國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)共享聯(lián)盟(ProteomeXchange),項(xiàng)目ID號(hào)為IPX0005504001。

1.7 生物信息學(xué)分析

1.7.1 GO功能注釋

使用NCBI BLAST+軟件和Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)對(duì)篩選出的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行搜索,然后利用GO進(jìn)行定位和注釋。

1.7.2 KEGG通路注釋

將篩選出的差異蛋白質(zhì)在京都基因與基因組百科全書Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)(www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行對(duì)比,對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行KO歸類,并獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)序列參與的通路信息。

1.7.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks, PPI)分析

利用IntAct(http://www.ebi.ac.uk/intact/main.xhtml)和STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)查找差異蛋白質(zhì)之間的直接和間接相互作用關(guān)系。使用Cytoscape 3.2.1軟件進(jìn)一步分析功能性蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),并計(jì)算每種蛋白質(zhì)的豐度以評(píng)估蛋白質(zhì)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性,構(gòu)建差異蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)互作圖。

1.8 差異蛋白質(zhì)Western blot驗(yàn)證

收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RK-13細(xì)胞、成年家兔和幼年家兔肝組織,用RIPA(含1%蛋白酶抑制劑PMSF)裂解液裂解,制備好的蛋白質(zhì)樣品分別加入SDS-PAGE膠上樣孔中,每孔上樣量為10 μg;設(shè)置恒壓80 V電泳120 min,電泳完成后,用伯樂(lè)半干轉(zhuǎn)膜儀10 V、1 A條件下轉(zhuǎn)膜30 min,轉(zhuǎn)印至PVDF膜。用脫脂奶粉封閉1 h后加入差異蛋白質(zhì)單克隆抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,用TBST洗膜5次,加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,用TBST洗膜5次,用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)顯色。

1.9 數(shù)據(jù)分析

對(duì)篩選得到的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果采用ImageJ(v1.8.0)軟件進(jìn)行灰度分析,其余數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行多組間單因素方差分析(one-way analysis of variance)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異蛋白質(zhì)的篩選與鑒定

本試驗(yàn)共鑒定了4 353個(gè)蛋白質(zhì),篩選出821個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)。相對(duì)于幼年兔,成年兔肝中顯著上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)294個(gè),顯著下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)527個(gè),差異蛋白質(zhì)表達(dá)火山圖和熱圖如圖1所示。根據(jù)2種月齡兔肝中蛋白質(zhì)定量比值將篩選出的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行排序,篩選出了比值最大的6個(gè)差異蛋白質(zhì),其中醇脫氫酶(aldehyde dehydrogenase 1A1, ALDH1A1)、角蛋白8(keratin 8, KRT8)、角蛋白18(keratin 18, KRT18)和組蛋白結(jié)合蛋白1(histone binding protein 1, SLBP1)共4個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著上調(diào),膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1(cholesterol acyltransferase 1, ACAT1)和熱休克蛋白9(heat shock protein family A member 9,HSPA9)的表達(dá)顯著下調(diào)(表1)。

A,差異蛋白火山圖;B,差異蛋白聚類熱圖。A, Volcano plot of differential proteins; B, Clustering heat map of differential proteins.圖1 差異蛋白質(zhì)的篩選與鑒定Fig.1 Screening and identification of differential proteins

2.2 差異蛋白質(zhì)GO富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示,821種差異蛋白質(zhì)主要富集到生物學(xué)過(guò)程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)3大類(圖2-A)。BP中小分子代謝(small molecule metabolic process)蛋白質(zhì)145個(gè)、氧化還原過(guò)程(oxidation-reduction process)蛋白質(zhì)111個(gè)、代謝過(guò)程(metabolic process)蛋白質(zhì)478個(gè);CC中細(xì)胞外成分(intracellular-part)蛋白質(zhì)528個(gè)、線粒體(mitochondrion)蛋白質(zhì)139個(gè)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasmic part)蛋白質(zhì)366個(gè);MF中催化活性(catalytic activity)蛋白質(zhì)342個(gè)、氧化還原活性(oxidoreductase activity)蛋白質(zhì)93個(gè)、輔酶結(jié)合(coenzyme binding)蛋白質(zhì)50個(gè)(圖2-B)。

A,差異蛋白質(zhì)GO富集分析分類直方圖;B,差異蛋白質(zhì)GO富集分析分類氣泡圖。BP,生物學(xué)過(guò)程;CC,細(xì)胞組分;MF,分子功能。A, Classification histogram of differential proteins by GO enrichment analysis; B, Classification bubble diagram of differential proteins by GO enrichment analysis. BP, Biological process; CC, Cellular component; MF, Molecular function.圖2 差異蛋白質(zhì)GO富集分析結(jié)果Fig.2 The results of GO enrichment analysis of differential proteins

2.3 KEGG信號(hào)通路注釋結(jié)果

對(duì)成年兔和幼年兔肝中的821個(gè)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行通路富集分析,結(jié)果共注釋到47條KEGG信號(hào)通路,排名前10的通路如表2所示。其中,代謝途徑(metabolic pathways)通路中富集的蛋白質(zhì)差異極顯著(P<0.01),且富集的蛋白質(zhì)數(shù)量較多,剩余通路主要包括糖代謝(carbon metabolism)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、剪切小體(spliceosome)等。

2.4 差異蛋白的PPI構(gòu)建分析

由成年兔和幼年兔肝中差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖和柱形圖(圖3-A、3-B)可看出,關(guān)聯(lián)度排名前10位的差異蛋白質(zhì)分別是線粒體核糖體蛋白S15(mitochondrial ribosomal protein S15, MRPS15)、人核糖體蛋白L26(ribosomal protein L26, RPL26)、線粒體核糖體蛋白L11(mitochondrial ribosomal protein L11, MRPL11)、核糖體蛋白L11(ribosomal protein L11, RPL11)、泛醌氧化還原酶亞單位AB1(ubiquinone oxidoreductase subunit AB1, NDUFAB1)、線粒體核糖體蛋白L15(mitochondrial ribosomal protein L15, MRPL15)、小核糖核蛋白多肽F(small nuclear ribonucleo protein polypeptide F, SNRPF)、60S核糖體蛋白L27(60S ribosomal protein L27, LOC100356974)、線粒體核糖體蛋白L17(mitochondrial ribosomal protein L17, MRPL17)、線粒體核糖體蛋白L3(mitochondrial ribosomal protein L3, MRPL3),關(guān)聯(lián)度最高的是MRPS15。以上蛋白質(zhì)均為核糖體蛋白質(zhì),其功能聚類于細(xì)胞功能調(diào)控方面。

2.5 差異蛋白質(zhì)的驗(yàn)證

根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果,用成年兔、幼年兔肝組織和5周齡幼兔腎細(xì)胞系(RK-13)作為樣品,對(duì)篩選獲得的6個(gè)差異蛋白質(zhì)(ALDH1A1、KRT8、KRT18、ACAT1、SLBP和HSPA9)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)水平驗(yàn)證。Western blot結(jié)果表明:幼年兔組和RK-13組的ALDH1A1、SLBP蛋白表達(dá)水平均極顯著(P<0.001)低于成年兔組,且RK-13組的ALDH1A1、SLBP蛋白表達(dá)水平極顯著(P<0.001)低于幼年兔組(圖4A、4-B、圖4-I、4-J);幼年兔組和RK-13組的KRT8蛋白表達(dá)水平極顯著低于成年兔組,且RK-13組顯著(P<0.05)低于幼年兔組(圖4-C、4-D);幼年兔組和成年兔組的KRT18蛋白表達(dá)水平均極顯著(P<0.001)低于RK-13組,幼年兔組KRT18蛋白表達(dá)水平極顯著(P<0.001)低于成年兔組(圖4-E、4-F);成年兔組、RK-13組的ACAT1蛋白表達(dá)水平極顯著(P<0.001)低于幼年兔組,RK-13組的ACAT1蛋白表達(dá)水平極顯著降低于成年兔組(P<0.001)(圖4-G、4-H);幼年兔組和RK-13組的HSPA9蛋白表達(dá)水極顯著(P<0.001)高于成年兔組,但RK-13組與幼年兔組間HSPA9蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖4-K、4-L)。

ALDH1A1,醇脫氫酶;KRT8,角蛋白8;KRT18,角蛋白18;ACAT1,膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1;SLBP,組蛋白結(jié)合蛋白1;HSPA9,熱休克蛋白9;Adult,成年兔;Young,幼年兔。*、**、***分別表示在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平差異顯著。ALDH1A1, Aldehyde dehydrogenase 1A1; KRT8, Keratin 8; KRT18, Keratin 18; ACAT1, Cholesterol acyltransferase 1; SLBP, Histone binding protein 1; HSPA9, Heat shock protein family A member 9; Adult, Adult rabbit; Young, Young rabbit. *, ** and *** meant significa differences at the levels of P<0.05, P<0.01 and P<0.001, respectively.圖4 成年兔和幼年兔肝、5周齡幼兔腎組織細(xì)胞系(RK-13)的差異蛋白表達(dá)水平Fig.4 Differential protein expression levels in livers of adult and young rabbits, and kidney cell lines (RK-13) of 5-week-old rabbits

3 結(jié)論與討論

RHDV是一種在全球范圍傳播的兔急性、高度致死性傳染病,對(duì)家兔養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[17-18]。疫苗是預(yù)防兔出血癥的主要手段,但目前為止,仍尚未構(gòu)建出允許體外培養(yǎng)RHDV毒株的細(xì)胞系[19-20]。因此,深入研究RHDV感染后的體液和細(xì)胞免疫機(jī)制,比較幼年兔和成年兔感染RHDV的機(jī)制,可為合理開(kāi)發(fā)RHD疫苗提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

病毒感染是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程,涉及基因、蛋白質(zhì)、代謝物等物質(zhì)的相互作用,蛋白質(zhì)組學(xué)可較全面地揭示生物系統(tǒng)中差異蛋白質(zhì)對(duì)病毒感染的影響[21]。目前基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法有同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)、多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)(multiple reaction monitoring, MRM)、TMT和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallel reaction monitoring, PRM)等[22],其中TMT是賽默飛世爾科技(Thermo Scientific)公司推出的一種基于體外同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),即利用同位素試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的多肽,可同時(shí)分析多達(dá)16種樣品間的蛋白質(zhì)表達(dá)量,具有不依賴抗體、可同時(shí)測(cè)定多樣品多目標(biāo),易形成標(biāo)準(zhǔn)化操作等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用最為廣泛[22]。本研究采用TMT技術(shù)對(duì)成年兔和幼年兔肝中的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了篩選和分析,共鑒定出4 353個(gè)蛋白質(zhì),篩選出821個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì),其中294個(gè)顯著上調(diào),527個(gè)顯著下調(diào)。差異蛋白質(zhì)GO功能注釋生物學(xué)過(guò)程中主要富集到小分子代謝、氧化還原過(guò)程和代謝過(guò)程;細(xì)胞組分中主要富集到細(xì)胞外成分、線粒體和細(xì)胞質(zhì);分子功能中主要富集到催化活性、氧化還原活性和輔酶結(jié)合。KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)分類注釋到47條KEGG信號(hào)通路,主要涉及代謝途徑、糖代謝、氧化磷酸化、帕金森氏癥、剪接體、阿茲海默病和丙酸代謝等通路。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,本課題組對(duì)角蛋白8、角蛋白18、熱休克蛋白9、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1、醇脫氫酶和組蛋白結(jié)合蛋白進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

熱休克蛋白9屬于熱休克蛋白家族,參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞器蛋白穩(wěn)定、凋亡、蛋白質(zhì)的囊泡運(yùn)輸和神經(jīng)退行性疾病等多個(gè)生理病理過(guò)程[23]。已有研究表明,熱休克蛋白家族作為一種細(xì)胞外的免疫原,可引起主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)交叉呈遞抗原[24]。Neave等[16]研究發(fā)現(xiàn),感染RHDV GI.2株后,幼年家兔肝中的殺傷細(xì)胞受到激活,相關(guān)功能基因(PTPN22、VaV1和ARRB2)表達(dá)下調(diào),推測(cè)幼年家兔肝內(nèi)HSPA9上調(diào)后,雖然會(huì)活化殺傷細(xì)胞,但由于相關(guān)基因被下調(diào),不會(huì)誘導(dǎo)過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)來(lái)阻礙RHDV GI.2株感染。本研究中幼年兔肝內(nèi)HSPA9表達(dá)上調(diào),推測(cè)感染RHDV GI.1株后,幼年兔可同時(shí)活化CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞,激活特異性細(xì)胞免疫進(jìn)而阻礙病毒感染[25]。此外,也有研究表明,HSPA9是坦布蘇病毒(TMUV)在雞成纖維細(xì)胞(DF-1)上的病毒受體,推測(cè)HSPA9可能與病毒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)[26]。

線粒體核糖體蛋白S15(MRPS15)是存在于真核細(xì)胞線粒體內(nèi)的一種核糖體,與線粒體蛋白的翻譯相關(guān)[27]。研究表明,線粒體核糖體蛋白可以與MAVS結(jié)合,促進(jìn)MAVS活化,并且可以從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)并促進(jìn)RIG-I/MDA5的K63連接泛素化[28]。Neave等[16]對(duì)先天免疫因子基因的表達(dá)分析表明,幼年家兔和成年家兔在感染RHDV GI.1株或GI.2株后不同的抵抗效應(yīng)正是基于這些早期免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。本研究中根據(jù)PPI分析,MRPS15關(guān)聯(lián)度最高,推測(cè)由于幼年兔肝中MRPS15表達(dá)較高,當(dāng)受到RHDV刺激后,可能通過(guò)MRPS15與MAVS的互作,進(jìn)一步促進(jìn)MAVS的活化,激活天然免疫并拮抗病毒感染。在幼年兔對(duì)RHDV GI.1株的應(yīng)答中,MHCⅠ型和干擾素誘導(dǎo)的基因上調(diào),導(dǎo)致CD4+T和自然殺傷細(xì)胞的激活活性增強(qiáng),這些結(jié)果可能與幼年兔對(duì)RHDV GI.1株不具有感染性相關(guān)。相反,在感染RHDV GI.2株后,幼年家兔肝中MHCⅠ型和干擾素誘導(dǎo)的基因下調(diào),這可能與幼年家兔對(duì)RHDV GI.2株具有感染性有關(guān)[26]。

角蛋白8(KRT8)屬于角蛋白家族,是消化系統(tǒng)中最大的中間絲蛋白和細(xì)胞骨架的主要組成部分[29]。李文靜等[30]研究發(fā)現(xiàn),丙型肝炎病毒(HCV)感染可導(dǎo)致角蛋白8表達(dá)上調(diào),從而反過(guò)來(lái)促進(jìn)HCV自身的復(fù)制,并且下調(diào)角蛋白8具有抗HCV作用,并增強(qiáng)抗HCV藥物的抗病毒作用。Ye等[23]研究發(fā)現(xiàn),角蛋白8突變體在慢性乙型肝炎病毒(CHBV)感染后表達(dá)上調(diào),其突變體可能阻止細(xì)胞骨架的組裝,并增加人體對(duì)急性肝衰竭的易感性。膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(也稱為甾醇-O-?；D(zhuǎn)移酶,ACAT1)主要功能是催化膽固醇酯的形成并在體內(nèi)發(fā)揮多種功能,包括調(diào)節(jié)膽固醇的儲(chǔ)存和細(xì)胞膽固醇的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[31];Pokhrel等[32]研究發(fā)現(xiàn),膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1抑制劑可抑制諾如病毒(NV)復(fù)制,說(shuō)明膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1和NV復(fù)制相關(guān)。組蛋白結(jié)合蛋白(SLBP)是一種新的RNA結(jié)合蛋白,參與轉(zhuǎn)錄翻譯和mRNA降解,復(fù)制依賴性組蛋白mRNA是其唯一已知的靶點(diǎn)[33]。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn),HIV-1感染者的血漿中TNF-α水平與組蛋白結(jié)合蛋白水平呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明組蛋白結(jié)合蛋白是HIV-1潛在的重要細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。Albright等[35]研究發(fā)現(xiàn),HCMV能夠利用組蛋白結(jié)合蛋白作為另一種途徑來(lái)協(xié)助病毒粒子的產(chǎn)生。這些差異蛋白質(zhì)目前沒(méi)有與RHDV感染機(jī)制相關(guān)的報(bào)道,我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行逐一探索。

本文采用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選鑒定出了成年兔和幼年兔肝中的差異蛋白質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行了相應(yīng)的生物學(xué)分析,有助于進(jìn)一步了解差異蛋白質(zhì)在RHDV感染中的作用,為RHDV體外擴(kuò)增細(xì)胞系構(gòu)建提供新的研究思路。差異蛋白質(zhì)篩選僅僅邁出了第一步,后續(xù)還需在細(xì)胞水平上進(jìn)行差異蛋白質(zhì)對(duì)病毒感染影響的驗(yàn)證。