肖啟蒙

（華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山 063210）

板藍(lán)（Strobilanthes cusia）是爵床科灌木狀多年生草本植物，廣泛分布在我國(guó)的四川、貴州、浙江和福建等地。板藍(lán)全身皆可入藥，根被稱(chēng)為“南板藍(lán)根”，莖和葉經(jīng)加工后可得青黛，能夠治療病毒性肝炎、流感、感冒、肺炎、炎癥、皰疹、丹毒、蛇咬傷等[1]，青黛是牛黃消炎丸、桂林西瓜霜等的主要原料[2-3]。其中，福建馬藍(lán)（板藍(lán)）青黛品質(zhì)最佳，是福建省大宗地道藥材之一[4]。最近，高質(zhì)量板藍(lán)基因組數(shù)據(jù)可獲得[5]，為進(jìn)一步探究板藍(lán)基因組進(jìn)化歷史及生物學(xué)特征奠定了基礎(chǔ)。

多倍化（polyploidy）是物種多樣性演化的重要基因組動(dòng)力，為地球上綠色植物的龐大類(lèi)群的出現(xiàn)做出了巨大貢獻(xiàn)，尤其在被子植物的演化過(guò)程中尤為突出[6]。物種經(jīng)歷多倍化，其早期基因組將以古老的多倍體形式存在，而后會(huì)出現(xiàn)大規(guī)模的染色體重排，以及伴隨發(fā)生的重復(fù)基因丟失現(xiàn)象，這就導(dǎo)致現(xiàn)存物種基因組相對(duì)其祖先，已經(jīng)發(fā)生了復(fù)雜的變化，因此也為研究其古老的演化歷史帶來(lái)了挑戰(zhàn)。板藍(lán)作為真雙子葉植物，至少經(jīng)歷了3 次多倍化事件，包括種子植物共享的全基因組加倍ζ（zeta）事件和被子植物共有的ε（epsilon）事件，以及最近發(fā)生的一次核心真雙子葉植物共同經(jīng)歷的古老六倍體γ（gamma）事件。多倍化事件的鑒定及對(duì)物種進(jìn)化的影響，是基因組研究的一個(gè)熱點(diǎn)，其中對(duì)于古老時(shí)期、且在一個(gè)較短的時(shí)間里，發(fā)生的潛在的由多倍化導(dǎo)致的基因組激變事件的鑒定是一個(gè)難點(diǎn)。地球上真雙子葉植物出現(xiàn)距今有約1.5 億年[7-9]，早期分化關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)幾乎是在同一歷史時(shí)期，對(duì)于板藍(lán)而言，其從核心雙子葉中分化出來(lái)的時(shí)間較早且分化較快，受到輻射性演化的影響，因而增加了這一分化前后的全基因組加倍事件的分析難度。

本研究通過(guò)使用前人開(kāi)發(fā)的方法[10]，將板藍(lán)基因組與兩個(gè)優(yōu)良的參考基因組——葡萄（Vitis vinifera）和漾濞槭（Acer yangbiense）進(jìn)行共線(xiàn)性分析和全基因組比對(duì)分析，旨在厘清板藍(lán)基因組的進(jìn)化歷程，探究板藍(lán)的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 植物基因組數(shù)據(jù)

從不同的網(wǎng)站下載了每個(gè)基因組項(xiàng)目的基因組序列和注釋文件。葡萄的基因組數(shù)據(jù)可以在NCBI 上找到（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），漾濞槭的基因組信息可以在GenBank 找到（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/），板藍(lán)的基因組數(shù)據(jù)可以在CNGB Sequence Archive (CNSA) 找 到（https://ftp.cngb.org/pub/CNSA/data3/CNP0001632/CNS0343944/CNA0019301/）。

1.2 推斷基因組同源性

基因共線(xiàn)性表明基因組之間的基因和基因順序在一定程度上是保守的，這可以反映共同祖先的同源染色體結(jié)構(gòu)；這對(duì)于理解基因組變化，特別是推斷復(fù)雜植物基因組的進(jìn)化至關(guān)重要。通過(guò)BLAST 對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較[11]，E 值＜1e-5，得分＞100。隨后，來(lái)自BLAST 的同源基因信息被用作ColinerScan 軟件[12]的輸入，為了定位同源基因?qū)?，筆者將同源基因之間的最大間隙分別設(shè)置為10、20、40、50、60、80、100 和200 個(gè)干預(yù)基因，并通過(guò)使用這些信息獲得同源基因點(diǎn)圖[13-14]。最后，當(dāng)閾值設(shè)置為50 時(shí)，發(fā)現(xiàn)了最清晰的共線(xiàn)性片段，并確定出旁系同源和直系同源基因。

1.3 同義堿基替換

使用Nei-Gojobori 方法[15]，通過(guò)使用Bioperl 統(tǒng)計(jì)模塊，估計(jì)同義位點(diǎn)（Ks）上的同義核苷酸替換。然后，對(duì)齊多個(gè)基因CDS，并使用ClustalW v2.0 設(shè)置默認(rèn)參數(shù)[16]。

1.4 Ks的核函數(shù)分析

使用核函數(shù)來(lái)分析基因組內(nèi)和基因組之間的同基因同源物的Ks 分布。Ks 分布被認(rèn)為是正態(tài)分布的混合。MATLAB v9.2.0[17]用于估計(jì)每個(gè)Ks 列表的密度并獲得密度分布曲線(xiàn)，而核平滑密度函數(shù)的寬度參數(shù)設(shè)置為0.05。通過(guò)在擬合工具箱工具中執(zhí)行高斯函數(shù)來(lái)擬合曲線(xiàn)，評(píng)估擬合優(yōu)度的參數(shù)R2通常設(shè)置為不小于95%。本文使用Ks分布曲線(xiàn)的最大似然估計(jì)μ（Ks峰值）。

1.5 鑒定染色體的直系和旁系同源區(qū)域

通過(guò)比較與物種分化和特定多倍體事件相關(guān)的同源區(qū)域的Ks值，確定了同源和旁系的染色體區(qū)域。

1.6 全基因組與局部比對(duì)

基于多基因組比對(duì)關(guān)系，使用McScanX 的jcvi 模型展示筆者在參考基因組和板藍(lán)基因組之間選擇的同源基因深度比關(guān)系的信息[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 共線(xiàn)性基因及Ks分布表征

為了探究板藍(lán)的多倍化歷程，筆者比較了板藍(lán)基因組與葡萄、漾濞槭基因組間的共線(xiàn)性關(guān)系（見(jiàn)表1）。在葡萄和漾濞槭基因組中，當(dāng)共線(xiàn)性區(qū)域所包含的共線(xiàn)性基因?qū)Υ笥? 對(duì)時(shí)，分別鑒定出了位于385 和670 個(gè)同源共線(xiàn)性區(qū)域上的3 558 和4 853 對(duì)共線(xiàn)性基因?qū)ΑＨ欢?，在相同條件下，在板藍(lán)基因組內(nèi)鑒定出13 225對(duì)共線(xiàn)性基因?qū)ξ挥? 520個(gè)同源區(qū)域上，這大約是葡萄和漾濞槭基因組內(nèi)共線(xiàn)性基因?qū)Φ?倍左右。隨后，筆者對(duì)基因組間也進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)與葡萄、漾濞槭間分別存在50、51個(gè)長(zhǎng)片段（連續(xù)基因?qū)?shù)量大于50 對(duì)），包括了4 016 和4 673 對(duì)共線(xiàn)性基因?qū)?，值得注意的是，在葡萄與漾濞槭基因組間存在8 611對(duì)共線(xiàn)性基因?qū)Γ@大約是板藍(lán)與兩個(gè)參考基因組間的2 倍。這些基因組比較表明，板藍(lán)基因組中有更多的區(qū)塊，并且它們更小，這表明板藍(lán)可能在ECH后經(jīng)歷了進(jìn)一步的多倍化事件。

表1 板藍(lán)與參考基因組中位于基因組內(nèi)或基因組之間推測(cè)的共線(xiàn)性片段中的同源基因?qū)?shù)量 單位：個(gè)

筆者對(duì)共線(xiàn)性基因?qū)λ幍耐磪^(qū)域進(jìn)行了同義核苷酸替換分析，計(jì)算了多倍化事件和物種分化所對(duì)應(yīng)的Ks峰，并進(jìn)一步推斷了進(jìn)化關(guān)鍵事件發(fā)生的時(shí)間節(jié)點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。葡萄、漾濞槭和板藍(lán)基因組中的共線(xiàn)性基因?qū)Ψ謩e在0.978 9、1.251 和1.09 處存在峰值，并且板藍(lán)基因組存在一個(gè)更小的峰，約為0.929 8，因此筆者推測(cè)前面三個(gè)峰對(duì)應(yīng)核心真雙子葉共享的多倍化事件（core eudicots hexaploidy,ECH），板藍(lán)的較小峰對(duì)應(yīng)板藍(lán)額外經(jīng)歷的多倍化事件。此外，筆者發(fā)現(xiàn)板藍(lán)與葡萄、漾濞槭分化的峰分別為1.31 和1.43，均大于葡萄與漾濞槭分化的峰（0.946 9），表明板藍(lán)先于葡萄、漾濞槭分化，隨后葡萄和漾濞槭再分開(kāi)。進(jìn)一步地，筆者對(duì)板藍(lán)及參考基因組進(jìn)化過(guò)程中的關(guān)鍵進(jìn)化事件進(jìn)行時(shí)間節(jié)點(diǎn)的推斷，利用之前研究中確定的ECH 事件發(fā)生在大約115～130 個(gè)百萬(wàn)年前[9]，筆者推算出板藍(lán)大約在111～126個(gè)百萬(wàn)年前與葡萄、漾濞槭分支發(fā)生分化，隨后在約106～120個(gè)百萬(wàn)年前經(jīng)歷了額外的多倍化事件，最后葡萄與漾濞槭在85～96 個(gè)百萬(wàn)年前發(fā)生分化。從上述結(jié)果中，筆者可以看到，在ECH 事件后，板藍(lán)基因組在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷了多倍化及分化事件，這會(huì)增大多倍化事件的鑒定難度，是板藍(lán)基因組分析中的巨大挑戰(zhàn)。

2.2 確定板藍(lán)額外多倍化事件為三倍化

為了揭示板藍(lán)基因組的多倍化歷程，筆者對(duì)葡萄和板藍(lán)基因組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)的9個(gè)直系染色體區(qū)域與葡萄3 個(gè)由ECH 事件產(chǎn)生的旁系染色體區(qū)域相匹配。比如，葡萄基因組中由ECH 事件產(chǎn)生的Vvi4、Vvi9、Vvi11 與板藍(lán)基因組中的9 個(gè)旁系染色體區(qū)域Scu2、Scu9、Scu10、Scu5、Scu15、Scu16、Scu3、Scu6、Scu8相匹配（見(jiàn)圖2A）。當(dāng)用漾濞槭基因組與板藍(lán)基因組進(jìn)行比較時(shí)，也可觀(guān)察到類(lèi)似的結(jié)果（圖2B）。這些基因組間共線(xiàn)性分析表明，葡萄與板藍(lán)，漾濞槭與板藍(lán)間的直系同源共線(xiàn)性深度比皆為3∶9。進(jìn)一步地，對(duì)板藍(lán)基因組內(nèi)也進(jìn)行全基因組比較，發(fā)現(xiàn)其自身存在兩個(gè)旁系同源區(qū)域，比如，Scu3 和Scu4、Scu6 為旁系同源區(qū)域（圖2C）。綜合基因組間和基因組內(nèi)比較結(jié)果，表明板藍(lán)基因組應(yīng)該在ECH 事件后經(jīng)歷了一次額外的三倍化事件。參考基因組與板藍(lán)間的進(jìn)化關(guān)系如圖2D所示。

2.3 多重基因組比對(duì)與共線(xiàn)性列表的構(gòu)建

在前面鑒定出的直系同源與旁系同源區(qū)域的基礎(chǔ)上，筆者可以區(qū)分出多倍化事件相關(guān)的共線(xiàn)性區(qū)域。葡萄、漾濞槭和板藍(lán)間分化的直系同源關(guān)系如圖3A 所示。比如，葡萄的18 號(hào)染色體有一個(gè)直系同源區(qū)域位于漾濞槭的10 號(hào)染色體上。有3 個(gè)直系同源區(qū)域分別位于板藍(lán)的3、14和16號(hào)染色體上（圖3B）。同時(shí)，由于多倍化后會(huì)存在大量的基因丟失，所以在板藍(lán)和兩個(gè)參考基因組之間的微共線(xiàn)性同源區(qū)域的基因清楚地表明，存在一些基因沒(méi)有顯示出預(yù)期的共線(xiàn)性深度同源比（見(jiàn)圖3B）。

此外，基于三個(gè)比較基因組中同源基因的位置，筆者構(gòu)建了一個(gè)分層次和事件相關(guān)的多基因組比對(duì)表。在這里，以葡萄為參考基因組，筆者將葡萄的所有基因ID填充到第一列，然后根據(jù)多重比對(duì)推斷出的基因組合成，逐列逐種添加葡萄、漾濞槭、板藍(lán)的基因標(biāo)識(shí)符。假設(shè)沒(méi)有基因丟失，來(lái)自ECH 事件的葡萄中的三個(gè)旁系基因中的每一個(gè)都分別在漾濞槭和板藍(lán)中有一個(gè)和三個(gè)同源基因。因此，多基因組比對(duì)表包括15（3+3+9）列，其中包含三列葡萄基因、三列漾濞槭基因和九列板藍(lán)基因。當(dāng)一個(gè)基因在預(yù)期位置缺失時(shí)，通常是由于基因丟失、易位或可能的組裝不充分，筆者在相應(yīng)的位置輸入一個(gè)點(diǎn)來(lái)表示缺失的基因，利用構(gòu)建的列表進(jìn)行多基因組比對(duì)（圖3C）。該表總結(jié)了多重基因組和事件相關(guān)比對(duì)的結(jié)果，反映了遞歸多倍體化導(dǎo)致的三倍同源性，為爵床科生物信息學(xué)的進(jìn)一步深入探究提供了重要的基因組學(xué)資源。

3 討論與結(jié)論

遞歸多倍體化在植物基因組中頻繁發(fā)生，為基因組功能創(chuàng)新提供了巨大的機(jī)會(huì)[19-22]。多倍體化后，植物基因組常常伴隨著基因丟失和染色體重排，這使得基因組更加復(fù)雜，在識(shí)別多倍化事件時(shí)也會(huì)產(chǎn)生巨大的挑戰(zhàn)[23]。比如，對(duì)最好匹配片段的選擇存在差異[24]，多倍體后進(jìn)化速度加快，導(dǎo)致與最近多倍體事件相關(guān)的同源區(qū)塊的Ks值與ECH 事件的Ks值無(wú)法區(qū)分[9]等。在之前對(duì)板藍(lán)基因組的分析中，并沒(méi)有提到板藍(lán)在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了全基因組多倍化事件[5]。本文對(duì)板藍(lán)與參考基因組進(jìn)行了深入的全基因組比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)葡萄與漾濞槭，葡萄與板藍(lán)的直系同源比分別為1∶1，1∶3，表明板藍(lán)基因組在ECH 事件后又經(jīng)歷了一次額外的三倍化事件。這不僅可以成為探究爵床科植物進(jìn)化歷程的模式，也因筆者對(duì)板藍(lán)基因組構(gòu)建的多重基因組比對(duì)列表，而能為后續(xù)爵床科植物基因組學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，本研究為進(jìn)一步加強(qiáng)板藍(lán)育種工作，提高板藍(lán)產(chǎn)量提供了理論基礎(chǔ)。