葉宏宇,劉藝,李芳媛,唐鄰凱,韓甜甜,曹宇

(綿陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 綿陽 621000)

花青素(Anthocyanidin)是一種具有較強(qiáng)抗氧化潛力的酚類化合物[1],具有清除體內(nèi)氧自由基、增強(qiáng)新陳代謝能力、抗衰老、預(yù)防骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)血管彈性等多種作用[2-3]。近年來,花青素還被證明可應(yīng)用于食用膜、生物標(biāo)記、太陽能電池以及可降解材料等領(lǐng)域[4-6]。因?yàn)榛ㄇ嗨鼐薮蟮臐撛趦r(jià)值以及廣闊的應(yīng)用前景,其相關(guān)問題獲得了廣泛的關(guān)注和研究。研究表明,花青素廣泛存在于植物中,尤其是深色的蔬菜和水果中,如葡萄、藍(lán)莓、黑醋栗等[7]。對(duì)不同來源花青素的應(yīng)用價(jià)值、成分以及提取方法等進(jìn)行研究具有實(shí)際意義。近年來,已有文獻(xiàn)對(duì)洋蔥中的花青素進(jìn)行了一定的研究。研究洋蔥花青素含量的測(cè)定、洋蔥中花青素抗氧化活性的測(cè)定等[8]。而專門針對(duì)花青素的提取工藝優(yōu)化的研究還有待進(jìn)一步深入,尤其是有關(guān)于紫色洋蔥皮中黃酮類花青素的提取方法優(yōu)化以及抗氧化活性的研究還較為缺乏?；诖?本研究擬選擇洋蔥中的花青素作為研究對(duì)象,利用傳統(tǒng)的溶劑提取法對(duì)洋蔥中花青素進(jìn)行提取,并且利用單因素和Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化。通過方法優(yōu)化后得到關(guān)于洋蔥皮中花青素提取的最佳工藝條件,并利用洋蔥中花青素對(duì)·OH自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率的大小比較進(jìn)行成果驗(yàn)證,為洋蔥中花青素的進(jìn)一步研究、開發(fā)與利用提供理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料與試劑

紫皮洋蔥(AlliumcepaL.):產(chǎn)地四川。

花青素標(biāo)準(zhǔn)品,純度≥ 98%,合肥博美生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),分析純,合肥博美生物科技有限公司;正丁醇,分析純,天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠公司;十二水合硫酸鐵銨,化學(xué)純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;Vc抗壞血酸,分析純,天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS),分析純,福州飛凈生物科技有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5500紫外-可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司);FA1004B電子天平(蘇州江東精密儀器有限公司);HH-6單列恒溫水浴鍋(常州梅香儀器有限公司)。

1.3 花青素的提取

取洋蔥外表皮3.0 g,剪成約1 cm×1 cm碎片,置于50 mL錐形瓶中,加入適量具有一定pH值的乙醇溶液后置于水浴鍋中恒溫提取,充分提取后以3 000 r/min離心5 min,使提取液與雜質(zhì)分離,取適量提取液置于試管中,供后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 含量測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱定標(biāo)樣25 mg于10 mL容量瓶中,再加入50%乙醇至刻度線,搖勻使標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解,得到質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用移液槍精密吸取2.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL分別于5支帶刻度試管中,再加入50%乙醇至1 mL。采用鐵鹽催化比色法顯色,實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[9-10]。隨行試劑在相同條件下反應(yīng)作為空白組,依次測(cè)定吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.85x+0.063 8(x為花青素質(zhì)量濃度,mg/mL;y為吸光度值),R2=0.999 2。

1.4.3 紫洋蔥皮提取液中花青素提取率計(jì)算

稱取洋蔥外表皮3.0 g,提取方法見1.3,顯色方法同上,用等體積的50%乙醇代替花青素提取液作為空白對(duì)照,將測(cè)定所得的OD547(Optical Density 547 nm)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得質(zhì)量濃度,代入公式(1)[11]求得相應(yīng)提取率。

(1)

式中:δ為提取液中花青素的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取紫洋蔥皮所用50%乙醇體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為紫洋蔥皮的質(zhì)量,g。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考郗艷麗等[11]的研究中對(duì)花青素提取時(shí)的單因素考查條件,以乙醇為提取溶劑,分別考查乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取pH值五個(gè)因素。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1,基礎(chǔ)條件料液比為1∶3,常溫提取,提取時(shí)間為40 min,pH值未調(diào)為乙醇自身pH值。每個(gè)條件下重復(fù)三次試驗(yàn),分別考察上述五個(gè)因素對(duì)洋蔥中花青素提取率的影響。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及對(duì)應(yīng)提取率結(jié)果表

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

基于上述單因素試驗(yàn)所得到的結(jié)果,參照Li等[12]的研究,最終確定以提取率為響應(yīng)值,選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間以及提取液的pH值為因變量,每個(gè)因素選取三個(gè)水平,進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.7 花青素抗氧化試驗(yàn)

1.7.1 提取液對(duì)·OH自由基的清除作用

參照張鏡等[13]的方法并稍作修改,取優(yōu)化后得到的花青素粗提取液測(cè)吸光度,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出質(zhì)量濃度,稀釋得0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/L的花青素粗提取液,于5支試管中分別加入1.0 mL,再向試管中加入9 mmol/L硫酸亞鐵1.0 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL和8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL,最后加蒸餾水至10 mL。充分混勻后37.0 ℃水浴30 min,以同等體積50%乙醇做空白對(duì)照,Vc替代花青素提取液做陽性對(duì)照,在510 nm處測(cè)定樣品吸光度。將OD510代入公式(2)計(jì)算花青素對(duì)·OH自由基的清除率:

(2)

式中:A0為加入隨行試劑做空白對(duì)照溶液的吸光度;A1為加入提取液反應(yīng)后的吸光度;Ax1為不加入過氧化氫時(shí)本底溶液吸光度。

1.7.2 提取液對(duì)DPPH自由基的清除作用

參照邱金東等[14]的方法并結(jié)合實(shí)際情況,實(shí)驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)方法中的DPPH用量進(jìn)行了確定。精密稱定2.3 mg DPPH試劑,加入無水乙醇溶解后,再用無水乙醇在50 mL棕色容量瓶中定容。同1.7.1法取5個(gè)梯度的花青素粗提取液1.0 mL于5支試管中,再向每支試管加入0.08 mol/L的DPPH-乙醇溶液2.0 mL,于30 ℃下避光反應(yīng)40 min,在517 nm處測(cè)定吸光度,Vc替代花青素提取液做陽性試驗(yàn)。代入公式(3)計(jì)算DPPH自由基的清除率:

(3)

式中:A1為加入提取液和DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度值;A2為蒸餾水替代DPPH的吸光度值;A3為加入蒸餾水替代提取液的吸光度值。

1.7.3 提取液對(duì)ABTS自由基的清除作用

參照豐永紅等[15]的方法并稍作修改。精密稱定ABTS 38.4 mg和過硫酸鉀6.7 mg,分別用蒸餾水定容至10 mL容量瓶后,將ABTS溶液和過硫酸鉀溶液1∶1混勻至棕色瓶中放置過夜,得ABTS工作液,于734 nm下測(cè)定吸光度,加適量無水乙醇稀釋至吸光度為0.7±0.02。另用移液槍按1.7.1法分別取質(zhì)量濃度為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/L的花青素粗提取液150 μL于5支試管中,加入3.6 mL稀釋的ABTS工作液,避光反應(yīng)6 min后,于547 nm處測(cè)定吸光度,以Vc做陽性對(duì)照。代入公式(4)計(jì)算ABTS自由基的清除率:

(4)

式中:A0為734 nm處ABTS工作液的吸光度;A1為547 nm處3.6 mL ABTS工作液+150 μL花青素提取液的吸光度。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Origin 2022軟件作圖對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)及抗氧化試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,Design-Expert 10.0.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果見表1,故確定乙醇濃度50%、料液比1∶6 (g∶mL)、60 ℃、70 min、pH值=2為最佳提取條件。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)表2中選取的因素和水平,利用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)了響應(yīng)面法的實(shí)驗(yàn)條件。

通過Design-Expert 10.0.1軟件對(duì)上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行多元回歸分析,得到回歸方程為:Y=17.75+1.55A+0.70×B+1.29×C+0.72×D-0.86×E-0.82×AB-0.47×AC+0.80×AD+0.097×AE-0.47×BC-0.072×BD-0.28×BE+2.62×CD-0.50×CE+0.042×DE-2.73×A2-3.99×B2-4.60×C2-2.45×D2-2.77×E2。

通過Design-Expert 10.0.1軟件分析推出影響本次試驗(yàn)提取率大小的因素為B(料液比)>C(提取溫度)>A(乙醇濃度)>E(pH值)>D(提取時(shí)間)。二次項(xiàng)CD對(duì)響應(yīng)值極顯著(p<0.01),二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2和E2對(duì)響應(yīng)值極顯著(p<0.01)。

通過Design-Expert 10.0.1軟件分析得知:在理想條件下,紫洋蔥皮中花青素的提取率最大值為18.26%,此時(shí)最佳提取條件為:乙醇濃度52.97%,料液比1∶6.05(g∶mL),提取溫度61.35 ℃,提取時(shí)間72.70 min,pH值為1.83。考慮到實(shí)際操作條件,將提取條件修正成:乙醇濃度為53%,料液比為1∶6(g∶mL),提取溫度為61 ℃,提取時(shí)間為73 min,pH值為2。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)優(yōu)化修正后得到的最佳條件,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果為花青素的提取率為18.26%,18.21%,18.30%,花青素的提取率平均值為18.26%±0.04%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%。且相較于微波法提取紫色洋蔥花青素的1∶10(g∶mL)料液比、女貞子花青素的1∶27(g∶mL)料液比、藍(lán)色金銀花漿果的1∶49.42(g∶mL)料液比[8,11,14]等,本實(shí)驗(yàn)提取所用提取溶劑含量更少,證明優(yōu)化可行,具有一定實(shí)用價(jià)值。

2.4 花青素提取液抗氧化試驗(yàn)

抗氧化結(jié)果如表3所示,由表3可知,紫洋蔥皮中花青素提取液對(duì)·OH自由基的清除效果均高于陽性對(duì)照Vc組。與文獻(xiàn)中利用葡萄枝蔓提取的花青素的抗氧化測(cè)定數(shù)據(jù)對(duì)比[9],此實(shí)驗(yàn)在使用比文獻(xiàn)中更小的花青素質(zhì)量濃度下·OH自由基清除率仍高于文獻(xiàn)值。對(duì)DPPH自由基的清除效果均高于陽性對(duì)照Vc組和文獻(xiàn)值[9]。對(duì)ABTS自由基的清除效果均高于陽性對(duì)照Vc組和文獻(xiàn)值[8]。

表3 抗氧化結(jié)果

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析法對(duì)乙醇提取紫洋蔥皮中花青素的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)通過單因素對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行了初步探索,考察了乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間和pH值這5個(gè)因素對(duì)紫洋蔥皮中花青素提取率的影響。在此基礎(chǔ)上,采用了五因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)條件優(yōu)化設(shè)計(jì),通過優(yōu)化后得出的紫洋蔥皮中花青素提取的最佳提取工藝條件是乙醇濃度53%,料液比1∶6(g∶mL),提取溫度為61 ℃,提取時(shí)間為73 min,pH值為2。結(jié)果的方差分析顯示該模型的擬合程度較高。試驗(yàn)條件下,當(dāng)花青素質(zhì)量濃度為2.5 mg/L時(shí),對(duì)ABTS自由基的清除率達(dá)79.66%;當(dāng)質(zhì)量濃度1.0 mg/L時(shí),對(duì)·OH自由基清除率達(dá)70.65%,對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)77.97%。表明紫洋蔥花青素提取液具有良好的體外抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紫洋蔥中的花青素提取率高,具有較大的抗氧化活性,應(yīng)用前景廣闊。高效提取工藝的研究可以為花青素的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。今后,洋蔥中花青素的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和綠色生產(chǎn)將有望成為研究的熱點(diǎn)問題。