劉延鳳,盧紅華,孫建合,伊磊,張貴民

(魯南制藥集團(tuán)股份有限公司,國家手性制藥工程技術(shù)研究中心,山東 臨沂 273400)

西吡氯銨是一種陽離子季銨化合物,用于治療單純性牙齦炎,作為首選機(jī)械性去除局部病因的方法,對牙齒無著色,對口腔粘膜無刺激,能減少牙菌斑的形成[1-2]。西吡氯銨以吡啶、氯代十六烷為起始物料,一步反應(yīng)合成。氯代十六烷為具有警示結(jié)構(gòu)的鹵代烷烴類化合物[3],還可能會引入相近鏈長的氯代十四烷、氯代十五烷、氯代十七烷與氯代十八烷[4]。西吡氯銨含片中氯代烷烴類雜質(zhì)的研究尚未有文獻(xiàn)報道,其中氯代十六烷既是工藝雜質(zhì)又是可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物,需要重點關(guān)注。根據(jù)人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(International Conference on Harmonization,ICH)M7[5]指南規(guī)定,單官能團(tuán)烷基氯化物的TD50在36～108 mg/(kg·d),按更為嚴(yán)格的36 mg/(kg·d),根據(jù)西吡氯銨含片的最大日服用量8 mg·d-1,用線性外推法計算,以上氯代烷烴類雜質(zhì)的限度均不得過標(biāo)示量的0.45%,嚴(yán)控為0.1%。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)檢測西吡氯銨含片中氯代烷烴類雜質(zhì)的含量,用萃取法處理樣品,使水溶性好的西吡氯銨和水溶性差的待測成分分別溶于水相和有機(jī)相,避免了西吡氯銨進(jìn)入色譜儀遇熱分解以致待測成分測得量偏離實際值,同時,采用硝酸銀沉降水相中的氯離子,進(jìn)一步消除了西吡氯銨中十六烷基降解生成氯代十六烷的反應(yīng)條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7890B-7000D型氣相色譜質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司);MS205DU型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 材料

氯代十四烷對照品(純度:98.3%,阿拉丁試劑有限公司);氯代十五烷對照品(純度:99.4%,山東新時代藥業(yè)有限公司);氯代十六烷對照品(純度:98.0%,上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司);氯代十七烷對照品(純度:99.3%,山東新時代藥業(yè)有限公司);氯代十八烷對照品(純度:98.3%,上海麥克林生化科技股份有限公司);西吡氯銨含片(山東新時代藥業(yè)有限公司,批號220501、220502、220503,含量>98.0%);正己烷(德國默克公司,色譜純);硝酸銀(國藥集團(tuán)股份有限公司,分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),以5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液;初始柱溫為60 ℃,保持1 min后,以30 ℃·min-1的速率升溫至300 ℃,保持3 min;進(jìn)樣口溫度350 ℃;載氣為氦氣;柱流速1.0 mL·min-1;分流比10∶1;進(jìn)樣量1 μL。電子轟擊離子化(EI)模式電離,多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)定量分析;離子源電壓-70 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度300 ℃;監(jiān)測離子對m/z 91→55。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶劑

取正己烷作為空白溶劑。

2.2.2 對照品溶液

分別取各雜質(zhì)對照品約13 mg,精密稱定,置量瓶中,用正己烷定容稀釋制成每1 mL中各約含1.3 μg的混合溶液,作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液0.1 mL,置10 mL量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.3 供試品溶液

取西吡氯銨含片研細(xì),取細(xì)粉約25 mg(相當(dāng)于西吡氯銨0.067 mg),精密稱定,置具塞玻璃試管中,精密加入5 mL硝酸銀溶液(取硝酸銀約200 mg,置100 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻),超聲5 min,精密加入5 mL正己烷萃取,取上清液,即得。

2.3 專屬性

取“2.2”項下空白溶劑和對照品溶液,分別依法測定,記錄色譜圖。結(jié)果顯示,空白溶劑對待測成分無干擾;對照品溶液中,氯代十四烷的保留時間為8.098 min、氯代十五烷的保留時間為8.489 min、氯代十六烷的保留時間為8.861 min、氯代十七烷的保留時間為9.217 min、氯代十八烷的保留時間為9.574 min,各組分間均能較好分離。

2.4 精密度、重復(fù)性試驗

精密量取“2.2”項下對照品貯備液0.1 mL置10 mL量瓶中,用正己烷定量稀釋至刻度,搖勻,重復(fù)測定6次,計算氯代十四烷、氯代十五烷、氯代十六烷、氯代十七烷與氯代十八烷峰面積的RSD分別為1.23%,1.08%,1.19%,1.59%與2.01%。結(jié)果表明,本法精密度良好。

取西吡氯銨含片(批號220501)細(xì)粉約25 mg,精密稱定,置具塞玻璃離心管中,精密加入5 mL硝酸銀溶液,加入對照品貯備液100 μL,超聲5 min,精密加入5 mL正己烷萃取,取上清液,平行配制6份,依法測定。氯代十四烷、氯代十五烷、氯代十六烷、氯代十七烷與氯代十八烷測得含量的RSD分別為0.097%,0.10%,0.13%,0.06%與0.22%。結(jié)果表明,本法重復(fù)性良好。

2.5 線性與范圍

精密量取對照品貯備液1 mL置10 mL量瓶中,用正己烷定量稀釋至刻度,搖勻,作為線性貯備液。精密量取線性貯備液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mL分別置10 mL量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,作為線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別依法測定,記錄色譜圖。以各組分的質(zhì)量濃度c(ng·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,回歸方程為氯代十四烷:A=22.296c+1.623,r=0.999 9;氯代十五烷:A=16.256c+0.393,r=0.999 8;氯代十六烷:A=10.528c+3.443,r=0.999 6;氯代十七烷:A=6.967c-0.312,r=0.999 8;氯代十八烷:A=5.337c-2.148,r=0.999 7。結(jié)果表明,待測成分在質(zhì)量濃度2.6～26 ng·mL-1內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.6 回收率

取西吡氯銨含片(批號220501)細(xì)粉約25 mg,精密稱定,置具塞玻璃離心管中,精密加入5 mL硝酸銀溶液,分別加入對照品貯備液80,100,120 μL,超聲5 min,分別精密加入5 mL正己烷萃取,取上清液,作為80%～120%回收率試驗溶液,每個濃度制備三份。分別依法測定,記錄各成分的峰面積。結(jié)果顯示,各成分的平均回收率(n=9)與RSD分別為氯代十四烷:101.28%,2.89%;氯代十五烷:101.96%,3.39%;氯代十六烷:102.02%,2.1%;氯代十七烷:101.30%,3.1%;氯代十八烷:102.55%,3.8%;方法準(zhǔn)確度高。

2.7 定量限與檢測限

取各成分對照品溶液逐級稀釋,分別以信噪比S/N為10和3時的溶液作為定量限溶液與檢測限溶液。定量限溶液重復(fù)測定6次,氯代十四烷、氯代十五烷、氯代十六烷、氯代十七烷和氯代十八烷峰面積的RSD(n=6)依次為:3.1%,3.2%,3.5%,3.1%和3.0%;定量限質(zhì)量濃度依次為0.82,1.27,1.35,3.54和4.39 ng·mL-1;檢測限質(zhì)量濃度依次為0.41,0.64,0.68,1.77和2.20 ng·mL-1;表明本法靈敏度高。

2.8 穩(wěn)定性

取“2.2”項下對照品溶液與供試品溶液,分別于室溫放置0,2,4,6,8,10,12 h時,按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示,12 h內(nèi)待測成分峰面積的RSD均小于10.0%,保留時間的RSD均小于2.0%,表明對照品溶液與供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 耐用性

先后改變初始柱溫(58,62 ℃)、升溫速率(28,32 ℃·min-1)、柱流速(0.9,1.1 mL·min-1),取“2.2”項下空白溶劑、對照品溶液與100%回收率溶液,分別依法測定,考察樣品中待測成分檢出情況。結(jié)果表明,不同耐用性條件下,待測成分檢出結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)條件無明顯差異,耐用性好。

2.10 樣品測定

取三批樣品,按“2.2”項下方法配制對照品溶液與供試品溶液,按“2.1”項下條件進(jìn)樣測定,按外標(biāo)法以峰面積計算。圖1結(jié)果顯示三批樣品中待測成分均未檢出。

圖1 典型色譜圖

3 結(jié)論

西吡氯銨含片中載藥量較低,受輔料影響,難以配制得到含較高濃度西吡氯銨的樣品,采用液相色譜法、氣相色譜法靈敏度均不能達(dá)到檢測要求。采用氣質(zhì)聯(lián)用法,隨進(jìn)樣口溫度升高,氯代十六烷的檢出含量逐漸增大,表明樣品在較高的汽化溫度下降解;而進(jìn)樣口溫度太低,沸點較高的待測成分不能完全汽化,重復(fù)性差。本研究中,創(chuàng)新性地采用萃取法配制樣品,利用西吡氯銨與氯代烷烴類雜質(zhì)的溶解性差異,使兩者分置兩相溶液中,取含有待測組分的有機(jī)相作為供試品溶液,既避免了樣品降解對測定結(jié)果的干擾,又可達(dá)到準(zhǔn)確檢驗待測組分的目的。于水相中加入硝酸銀,使氯離子沉降,消除了樣品降解的條件,同時,鹽析效應(yīng)提高了萃取效率。經(jīng)試驗,對照品溶液萃取前后待測成分的濃度無明顯差異,回收率接近100%,表明待測成分可被充分萃取進(jìn)入有機(jī)相。采用離子監(jiān)測模式對本法的線性與范圍、精密度、回收率、定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性進(jìn)行了驗證,結(jié)果顯示,本法的準(zhǔn)確性好、靈敏度高、溶液穩(wěn)定性好,可用于西吡氯銨含片中氯代烷烴類雜質(zhì)的檢測。