周曉霞

(衡水學(xué)院 化工學(xué)院,河北 衡水 053000)

黃芩苷(Baicalin)是一種從黃芩根中提取分離出來(lái)的黃酮類化合物,是黃芩的主要活性成分,具有顯著的生物活性[1-2]。研究表明,黃芩苷具有抑菌、清熱、降壓、鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗纖維化、抗變態(tài)反應(yīng)等作用[3],還可以抗腫瘤和HIV[4]等疾病。黃芩是十分重要的中草藥,作為黃金草藥的一種,在臨床上的使用已逾兩千年。黃芩不僅能夠治療多種疾病,還可以用于預(yù)防一些病癥。黃芩苷對(duì)黃芩來(lái)說(shuō)是一種非常關(guān)鍵的有效成分。目前關(guān)于黃芩苷的研究主要集中在對(duì)藥物的提取分離方面,對(duì)于含量測(cè)定報(bào)道較少。

迄今為止測(cè)定黃芩苷含量有熒光分光光度法[5]、高效液相色譜法[6]、薄層色譜技術(shù)[7]、紫外分光光度法[8]、高效毛細(xì)管電泳法、微乳液相色譜法[9]等方法。高效液相色譜法測(cè)定黃芩苷含量相對(duì)準(zhǔn)確,但對(duì)于儀器設(shè)備要求高,檢測(cè)周期長(zhǎng)[10]。紫外分光光度法對(duì)于黃芩苷含量的測(cè)定成本高,具有一定的局限性。熒光分光光度法靈敏度高、選擇性好、操作方便,而且被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和環(huán)境的檢測(cè)。本文欲采用分子熒光光度法測(cè)定黃芩中黃芩苷的含量,從而建立一種可行而又簡(jiǎn)便的定量測(cè)定黃芩苷的實(shí)驗(yàn)方法。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

黃芩苷,成都普菲德生物技術(shù)有限公司;5.000 μg·mL-1黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液;0.10 moL·L-1硼砂溶液;1.0 moL·L-1氫氧化鈉溶液;1%吐溫-80溶液;1%十二烷基硫酸鈉溶液。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器

FA2204B 電子天平,上海精密科學(xué)儀器股份有限公司;F-7000 熒光分析儀,日立。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)光譜波長(zhǎng)與發(fā)射光譜波長(zhǎng)的確定

取1支10 mL比色管,移取已配制好的5.000 μg·mL-1的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,固定激發(fā)波長(zhǎng)Ex,掃描發(fā)射波長(zhǎng)Em,固定發(fā)射波長(zhǎng)Em,掃描激發(fā)波長(zhǎng)Ex。重復(fù)上述步驟多次,直至找到激發(fā)(發(fā)射)波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的熒光值最強(qiáng)且穩(wěn)定不變時(shí)為止,得到黃芩苷溶液的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為270 nm,最佳發(fā)射波長(zhǎng)為547 nm。

2.2 黃芩苷溶液在不同硼砂濃度下熒光強(qiáng)度的變化

黃芩苷本身的熒光性比較弱,因此需要硼砂作為熒光增敏物質(zhì)來(lái)增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度。

準(zhǔn)備6支10 mL具塞比色管,分別加入配制好的5.000 μg·mL-1的黃芩苷溶液,再向其分別加入硼砂溶液,使硼砂溶液濃度分別為0.002,0.004,0.008,0.012,0.016,0.020 moL·L-1。分別測(cè)定黃芩苷在相應(yīng)硼砂濃度下的熒光強(qiáng)度值,所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同硼砂濃度與黃芩苷熒光強(qiáng)度的關(guān)系

由圖1可以看出黃芩苷的熒光強(qiáng)度值隨著硼砂濃度的增加而不斷增大,硼砂濃度越大,黃芩苷與硼砂結(jié)合的效果越好,熒光強(qiáng)度就越高。本實(shí)驗(yàn)選用熒光增敏劑硼砂溶液,使其濃度為0.020 moL·L-1。

2.3 黃芩苷在不同酸度下的熒光強(qiáng)度

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶液在弱堿性環(huán)境下,基本上不產(chǎn)生熒光峰,而pH值>11時(shí),熒光強(qiáng)度逐漸發(fā)生變化。

準(zhǔn)備11只10 mL的比色管,分別加入5.000 μg·mL-1的黃芩苷溶液、加入適量硼砂溶液使其濃度為0.020 moL·L-1,滴加已配制好的氫氧化鈉溶液,通過(guò)pH計(jì)調(diào)節(jié)待測(cè)溶液的pH值,根據(jù)酸堿性,分別在pH值為11.0,11.4,11.6,11.9,12.1,12.3,12.6,12.9,13.1,13.2,13.6時(shí)測(cè)定不同pH值下的待測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度值,測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH值與熒光強(qiáng)度的關(guān)系

觀察圖2可知,黃芩苷的熒光強(qiáng)度在pH值>11之后發(fā)生明顯變化,pH值在11～12.5熒光強(qiáng)度值不斷增大,pH值>12.5時(shí),熒光強(qiáng)度值開始逐漸減小。由圖可知,黃芩苷在pH值為12.5時(shí)熒光強(qiáng)度最高。

2.4 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

在上述最佳條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),配制一系列濃度梯度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確配制質(zhì)量濃度為0.500,1.000,1.500,2.000,2.500 μg·mL-1的黃芩苷溶液。

準(zhǔn)備5支10 mL的具塞比色管,分別移取5.000 μg·mL-1的黃芩苷溶液,加入適量硼砂溶液使其濃度為0.020 moL·L-1,并保持溶液的pH值為12.5,分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度值,測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 黃芩苷溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)數(shù)據(jù)分析可得,線性方程為:y=176.89+82.14x,R2=0.999 1。

2.5 樣品的測(cè)定

對(duì)黃芩藥材樣品進(jìn)行預(yù)處理。利用一種采樣器,可以將購(gòu)買的黃芩藥材粉碎成粉末并過(guò)篩,用分析天平準(zhǔn)確稱取0.050 0 g于小燒杯中,加入無(wú)水乙醇溶解,并用無(wú)水乙醇定容至100 mL容量瓶中,浸泡提取24 h。過(guò)濾,將濾液轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,然后用蒸餾水定容至刻度線,搖勻貼上標(biāo)簽,備用。

準(zhǔn)備3支10 mL具塞比色管,分別移取黃芩藥材樣品溶液,調(diào)至上述最佳條件下測(cè)定其熒光強(qiáng)度,結(jié)果見表1。根據(jù)黃芩苷溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算相應(yīng)的黃芩苷含量,平行測(cè)定三次求平均值。

表1 黃芩藥材樣品的熒光強(qiáng)度

通過(guò)線性回歸方程y=176.89+82.14x,R2=0.999 1計(jì)算可得,黃芩藥材中的黃芩苷含量平均值為1.685 μg·mL-1。

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出適宜條件:

1)黃芩苷的最大激發(fā)波長(zhǎng)為270 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為547 nm。

2)硼砂溶液濃度為0.020 moL·L-1,為本實(shí)驗(yàn)熒光增敏物質(zhì);實(shí)驗(yàn)最佳pH值為12.5。

3)上述條件下,測(cè)定得出黃芩苷溶液在0.50～2.5 μg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系,線性方程為:y=176.89+82.14x,R2=0.999 1,在最佳條件下測(cè)定了所選擇黃芩藥材中黃芩苷的含量為1.685 μg·mL-1。

實(shí)驗(yàn)表明,可以通過(guò)分子熒光光度法來(lái)測(cè)定黃芩中黃芩苷的含量,本方法實(shí)現(xiàn)了不經(jīng)分離,即可測(cè)定物質(zhì)的含量,為定量分析黃芩中黃芩苷的含量建立了一種可行且簡(jiǎn)便的方法,這些結(jié)論對(duì)于黃芩以及黃芩苷的進(jìn)一步探究提供了積極意義。