余世祥，班福澤，郭紅瑞，吳紹偉，鄧成松，魯金強，張松梅，張曉梅，柴 俊，張以芳*

(1.德宏州尚善品味農(nóng)業(yè)有限公司 679200；2.云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 650201)

牛焦蟲病又叫做巴貝斯蟲病或牛梨形蟲病，是一種流行性強且比較嚴重的寄生蟲病之一，這種疾病是牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲寄生于牛紅細胞中而引起的血液原蟲病[1]，它依靠蜱蟲進行傳播。臨床癥狀表現(xiàn)為高熱稽留40～42 ℃、食欲減退、心跳加快、反芻緩慢、黃疸、貧血、生長發(fā)育不良、身體消瘦、排血紅蛋白尿等癥狀[2]，一般情況下潛伏周期為14～20 d。同時蜱蟲在6～8月大量繁殖，所以發(fā)病高峰期也集中在這段時間，且大多呈散發(fā)或地方性流行為主[3]。焦蟲感染動物很多，但主要危害牛、羊[4]。該牛臨床檢查時表現(xiàn)為心跳加快、高熱、呼吸急促、食欲減退，治療時用安乃近、頭孢等退燒藥治療無效后死亡，對其進行病理解剖，發(fā)現(xiàn)牛心臟被大量脂肪包裹，血液稀薄，其余沒有發(fā)現(xiàn)明顯病變，初步確診為先天性護心脂肪異常（脂肪心），但因血液稀薄，用安乃近、頭孢等退燒藥無效，疑似感染焦蟲病，為此我們進行血涂片鏡檢觀察和PCR 檢測，具體檢測方法如下。

1 材料及方法

1.1 樣品

云南德宏地區(qū)某牛場疑似患焦蟲病急性病死?？鼓?。

1.2 主要試劑

瑞氏染液；核酸染料（溴化乙啶）購自賽百盛公司；50xTAE 緩 沖 液 購 自BIOWEST；DL2000 DNA Maker、RNasefree Water 均購自寶生物工程（大連）有限公司；2×EasyTaq○R PCR SuperMix(+dye)、血液/細胞基因組DNA 提取試劑盒均購自北京全式金生物科技有限公司。

1.3 實驗器械

電子天平（YP3002）購自BIO-RAD 公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司；移液槍（15599618）購自BIO-RAD 公司；電熱恒溫水浴鍋購自上海比朗儀器制造有限公司；漩渦振蕩器購自江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；電泳儀（BG-power 600）購自北京百晶科技公司；PCR 儀購自BIO-RAD 公司；迷你離心機（LX-200）購自其林貝爾儀器制造有限公司；4℃離心機（1—14K 145870）購自常州電器國華有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc-lt2-310）購自美國UVP 公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SII）購自Thermo Hybaid 公司；數(shù)碼生物顯微鏡（BM2100）購自江南永新光學有限公司。

1.4 牛血液血涂片的制備

取一載玻片放在平坦的實驗桌上，吸取一小滴血液于載玻片中央，右手持推片緩慢靠近血滴，停留片刻使血液向兩邊展開，充分展開后調整推片與載玻片之間的角度，使其成呈45°角，用相同的速度將血液推成血涂片，且血涂片厚薄度要適合，血涂片制好后將其徹底晾干，血液完全晾干后，用瑞氏染液進行染色，用顯微鏡進行觀察有沒有蟲體，如果有則進行下一步檢測，觀察結果如圖1 所示。

圖1 焦蟲血涂片

1.5 引物的設計

根據(jù)GeneBank 中登錄的基因序列，應用Primer6軟件設計引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，正向引物：CTATGCCGACTAGGGATTGG；反向引物：TCCTTACGCTGTCTGGACCT。目的條帶大小為200bp。

1.6 基因組的提取

第一，取200 μL 抗凝血于1.5 mL 離心管中；

第二，加入20 μL 蛋白酶K 溶液，充分混勻，然后加入200 μL 結合液CB，充分混勻，70℃水浴加熱10 min。

第三，冷卻至室溫加入100μL 異丙醇，充分混勻。

第四，取一吸附柱AC 放入收集管中，將上述混合物倒入其中，13000rpm 離心1 min，去掉收集管中的液體。

第五，加入500 μL 抑制物去除液IR，13000 rpm離心30 sec，去除廢液。

第六，加入600 μL 漂洗液WB，13000 rpm 離心30 s，棄除廢液，重復一次。

第七，將吸附柱AC 放入新的收集管中，13000 rpm離心2 min。

第八，取出吸附柱AC，放入一個新的離心管中，加100 μL 洗脫緩沖液EB 于吸附膜中間，靜置5 min，13000 rpm 離心1 min。

第九，提取產(chǎn)物放于-20℃保存，如需長期保存則應放置-80℃冰箱中保存。

1.7 PCR 擴增

將PCR 管進行高壓滅菌，向其中分別加入2×EasyTaq○R PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，焦蟲上游引物和下游引物各1 μL，模板DNA1μL，由于整個體系需保持25μL，所以需要加入雙蒸水9.5μL，充分混勻，然后進行擴增。PCR 擴增條件：預變性94℃2 min，變性94℃30 s，退火56℃30 s，延伸72℃30 s，循環(huán)35 次，循環(huán)結束后72℃孵育7 min，然后保存在4℃條件下。

1.8 瓊脂糖凝膠制備

按每10 mL 1×TAE 溶液，加1.0 g 瓊脂糖粉的比例稱量1×TAE 電泳液與瓊脂糖粉，加熱至完全溶解。

1.9 瓊脂糖凝膠電泳鑒定

瓊脂糖凝膠冷卻至30℃左右時加入核酸染料，然后倒置至膠槽中等待凝固，凝固后取出膠板將膠板放入電泳槽中，添加1xTAE 電泳緩沖液至沒過膠板為止，取7 μL DL2000 DNA Marker 加入第一個上樣孔中，在另一上樣孔中加入7 μL 水作為陰性對照，然后取2 μL loading buffer 與5 μL 待測樣品充分混勻，加入另一上樣孔中。加樣時要注意不要把凝膠底部刺穿。加樣完畢后，接通電源，調節(jié)電壓60～100 V，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm 處時（一般30～60 min），關閉電源，取出膠板，使用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下觀察，并拍照保留，結果如圖2 所示。

圖2 引物擴增結果

1.10 檢測陽性樣品PCR 產(chǎn)物目的片段膠回收

第一，在紫外燈下快速切下凝膠中目的條帶，放入離心管，稱重。凝膠重100 mg 視為100 μL。

第二，加入3 倍凝膠體積GSB 溶液，55℃水浴10 min 融化凝膠塊，每3 min 搖晃，直至凝膠融化。

第三，將融化的凝膠溶液吸入離心柱，靜置2 min。12000 r 離心1 min，棄濾液。

第四，在離心柱中加入700 μL WB 溶液，12000 r離心1 min，棄濾液。

第五，重復步驟四。

第六，12000 r 離心2 min，除剩余WB 溶液。

第七，將離心柱置于新離心管中，在柱中心加入40 μL EB 溶液（于60℃水浴預熱），靜置5 min，12000r 離心2 min，洗脫DNA。

第八，產(chǎn)物-20℃保存。

1.11 DNA 測序及同源性分析

將回收產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序，將測序結果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。

2 結果

2.1 血涂片瑞氏染色結果

血涂片瑞氏染色觀察，可見紅細胞內有環(huán)形、梨形、橢圓形的典型蟲體，結果如圖1 所示。

2.2 PCR 檢測結果

PCR 核酸鑒定檢測出與目的條帶相符條帶，如圖2所示。

2.3 PCR 產(chǎn)物序列及序列比對結果

PCR 產(chǎn)物測序結果如下：

TCTATGCCGACCTGGGATTGGAGGTCGTCAGTTT TTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGA-AAATCAAAGTC TTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAA CTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTG GAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACT CACCAGGTCCAGACAGCGTAAGGAAA

將該序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對，結果顯示該基因與呂氏泰勒蟲同源性為98.97%，下圖3所示。

圖3 序列比對結果部分截圖

綜合以上，形態(tài)染色、PCR 擴增及基因同源性比對結果，確診該發(fā)病牛的主要致病原因是血液呂氏泰勒蟲感染。

3 討論

蜱蟲也叫壁虱、扁虱、狗豆子、草爬蟲，大多生活在森林、灌木叢、草地草原、半荒漠地帶、鳥巢中，同時也常寄生于一些動物身上[5]。焦蟲病由蜱傳播，又稱蜱熱。云南省德宏州是焦蟲病的常發(fā)地區(qū)，發(fā)病季節(jié)為每年6～10 月份。

本次檢查時間為11 月，氣溫逐漸降低，已過蜱蟲大量繁殖期，本不應感染焦蟲病，為此我做出如下分析：第一，焦蟲病是由于攜帶病原的蜱蟲叮咬感染，德宏州屬于亞熱帶濕潤季風氣候，冬無嚴寒，夏無酷暑，雨量充沛，干濕分明，氣候溫暖，年溫差小，牛場所在地又靠近森林，且牛圈旁有一定數(shù)量的草地，適合蜱蟲生活，所以11 月份偶爾有蜱蟲活動，導致牛只患焦蟲病；第二，蜱蟲所攜帶的焦蟲為血液寄生蟲，可造成血液攜氧氣能力下降，氧飽和度降低，加上這段時間處于換季，氣溫逐漸降低，牛只抵抗力相對減弱，在各種因素誘導下造成牛只心臟病發(fā)病，從而導致牛只死亡；第三，牛場養(yǎng)殖模式為圈養(yǎng)，時常有外來牛只在牛場周邊活動，導致消毒滅蜱工作進行不徹底，導致有牛只感染焦蟲病。

家畜養(yǎng)殖過程中寄生蟲病時常發(fā)生，給人們造成較大經(jīng)濟損失，引起了人們高度重視。同時焦蟲病又是流行性強且比較嚴重的寄生蟲病之一。所以在養(yǎng)殖過程中我們要做到以下幾點：第一，養(yǎng)殖過程中“以防為主，防治結合”搞好滅蜱工作，阻斷傳播媒介，根據(jù)蜱蟲生活習性，在蜱蟲大量繁殖季節(jié)每星期用一定比例敵殺死油乳劑對牛體、圈舍及周邊環(huán)境進行滅蜱和清除蟲卵[6]，也可用燒牛糞、堆糞發(fā)酵等方法處理蜱蟲滋生環(huán)境；第二，加強免疫。引進牛只時先隔離觀察，確認健康后才能混養(yǎng)，嚴禁病牛入場，飼養(yǎng)過程中定期對牛進行檢疫；第三，加強藥物預防。在焦蟲病高發(fā)季節(jié)，對牛合理使用中藥或西藥進行預防[7]；第四，加強疫苗預防。每年3～4 月份對牛進行牛焦蟲疫苗免疫接種；第五，加強飼養(yǎng)管理。做好牛圈環(huán)境衛(wèi)生清理，定期對飼養(yǎng)環(huán)境進行消毒，殺滅蚊、蠅、蜱等寄生蟲的中間宿主[8]；加強牛場周邊管理，禁止其他動物靠近牛場周邊。第六，對于放牧牛群，放牧區(qū)可以采取牧場輪換和牧場隔離的方法，切斷蜱蟲吸血來源，來年再進行放牧，這種也是預防焦蟲病的有效方法之一，還可以在放牧前對牧區(qū)進行藥物殺蜱，以防發(fā)病。