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        HPLC-ELSD法和UPLC-MS/MS法評價石斛夜光丸中人參投料摻偽情況

        2023-11-03 04:21:56朱韜何頌華李麗莉羅軼廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測與評價重點實驗室南寧530021
        中南藥學(xué) 2023年10期
        關(guān)鍵詞:夜光西洋參石斛

        朱韜,何頌華,李麗莉,羅軼(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測與評價重點實驗室,南寧 530021)

        石斛夜光丸是治療眼疾的古老傳統(tǒng)名方,處方由石斛、人參、山藥、茯苓、地黃、天冬、山羊角等25味中藥組成,現(xiàn)收載于《中國藥典》2020 年版,具有滋陰補腎、清肝明目的功效[1]?,F(xiàn)代臨床研究表明,石斛夜光丸用于治療干眼癥、玻璃體混濁、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、慢性葡萄膜炎、青光眼術(shù)后、溢淚癥、肝腎陰虧型足跟痛、冠心病及心肌梗死等疾病[2-4]。處方中人參為傘形目五加科人參屬植物人參(PanaxginsengC.A.Mey)的干燥根和根莖,性溫,具有大補元氣、固脫生津、安神益智等功效;西洋參為傘形目五加科人參屬植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根,性涼,具有補氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效,兩者藥效區(qū)別較大,不能混用。

        隨著市場需求不斷提升,商家追求高額利潤,近年來不斷有報道使用西洋參混入中藥制劑冒充人參進行投料生產(chǎn)[5-6]。2020年版《中國藥典》中對于石斛夜光丸的人參質(zhì)量控制僅涉及人參皂苷Rg1和人參皂苷Re兩個成分,但西洋參中也含有這兩種成分[7-8],單純采用這兩個指標(biāo)成分進行定性鑒別,對于是否存在西洋參摻偽投料情況無法評判。兩味藥所含化學(xué)成分極為相似,均以人參皂苷為重要活性成分,但所含皂苷種類與比例存在一定差異,如西洋參特有的擬人參皂苷F11,人參中基本沒有[5,9]。因此本試驗以擬人參皂苷F11為特征標(biāo)志物,進行摻偽檢查的方法研究。由于擬人參皂苷F11沒有紫外吸收,本試驗采用了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)法,同時通過UPLC-MS/MS技術(shù)建立專屬性強的檢查方法,并對收集到的91批樣品進行測試,以期對不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品進行評價,為石斛夜光丸中人參摻偽投料檢測和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供參考。

        1 儀器與材料

        Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent公司),ELSD 6000蒸發(fā)光檢測器(Alltech公司);XP205電子天平(Mettler Toledo 公司,精度0.01 mg);Milli-Q純水儀(Millipore公司)。

        人參(批號:120917-201712)、西洋參(批號:120997-201810)、擬人參皂苷F11(批號:110841-201607)(中國食品藥品檢定研究院),25批不同產(chǎn)地的西洋參和13批西洋參須均購自市場(經(jīng)廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所黃清泉主管中藥師鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliumL.的干燥根和干燥根須),91批不同廠家、不同批次石斛夜光丸均為2020年國家藥品評價性抽驗樣品。乙腈為色譜純,水為純化水,其他試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 HPLC-ELSD法

        2.1.1 色譜條件 色譜柱:Capcell PAK C18 MGIII(S-5)(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相:以乙腈為流動相A,水為流動相B,梯度洗脫(0~20 min:10%→30%A;20~45 min:30%A);流速1.0 mL·min-1;柱溫30℃;檢測器ELSD,漂移管溫度105℃,載氣為氮氣,氣體流速3.0 L·min-1,增益1。

        2.1.2 溶液的制備

        ① 對照品溶液:取擬人參皂苷F11(經(jīng)標(biāo)定,含量為99.9%)適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液,即得。

        ② 供試品溶液:取本品,研碎,取6 g,精密稱定;置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇溶液100 mL,密塞,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,用70%甲醇溶液補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取濾液50 mL,置蒸發(fā)皿中,蒸干,殘渣加水25 mL使溶解,加水飽和正丁醇振搖提取4次,每次25 mL,合并正丁醇提取液,用氨試液洗滌2次,每次50 mL,再用正丁醇飽和水50 mL洗滌,分取正丁醇液,減壓濃縮,回收溶劑至干,殘渣加甲醇適量使溶解,轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        ③ 陰性樣品溶液的制備:按規(guī)定的處方量及工藝自制缺人參的石斛夜光丸陰性樣品,按②項下方法制成陰性樣品溶液。

        ④ 陽性樣品溶液的制備:取陰性樣品6 g 和西洋參3.4 mg(相當(dāng)于6 g 制劑中10%人參的處方量),作為陽性樣品,按②項下方法制成陽性樣品溶液。

        ⑤ 人參供試品溶液的制備:取人參34 mg(相當(dāng)于6 g制劑中人參的處方量),按②項下方法制成西洋參(須)供試品溶液。

        ⑥ 西洋參(須)供試品溶液的制備:分別取西洋參和西洋參須各3.4 mg,按②項下方法制成西洋參(須)供試品溶液。

        ⑦ 摻偽5%西洋參(須)樣品溶液的制備:取陰性樣品6 g 和西洋參(須)1.7 mg(相當(dāng)于6 g 制劑中5%人參的處方量),作為陽性樣品,按②項下方法制成摻偽樣品溶液。

        2.1.3 含量測定 分別精密吸取對照品溶液5 μL、20 μL及供試品溶液10 μL,進樣測定,用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算擬人參皂苷F11的含量。

        2.1.4 專屬性試驗 分別吸取對照品溶液、陰性樣品溶液和對照藥材溶液各10 μL,進樣測定。結(jié)果西洋參和西洋參須在擬人參皂苷F11峰相應(yīng)位置顯示有對應(yīng)色譜峰,陰性樣品和人參在擬人參皂苷F11相應(yīng)位置無色譜峰,表明本方法專屬性較好,色譜圖見圖1。

        圖1 HPLC-ELSD法專屬性試驗色譜圖Fig 1 HPLC-ELSD diagram of specific test

        2.1.5 線性關(guān)系考察 稱取擬人參皂苷F11對照品適量,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.0528、0.1055、0.3165、0.5275、1.0550 mg·mL-1的對照品溶液,進樣測定。以對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X),峰面積對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程為:Y=1.650X+2.315,r=0.9999。結(jié)果表明,擬人參皂苷F11在進樣量為0.528~10.550 μg內(nèi)與峰面積對數(shù)值線性關(guān)系良好。

        2.1.6 耐用性試驗 考察3種不同品牌色譜柱[CAPCELL PAK C18 MGIII(S-5)(5 μm,4.6 mm×250 mm)、Agilent 5TC-C18(2)(5 μm,4.6 mm×250 mm)、菲羅門SuperLu C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)],結(jié)果3種色譜柱測定人參皂苷F11的峰面積RSD為0.79%,表明方法耐用性良好。

        2.1.7 精密度試驗 精密吸取擬人參皂苷F11對照品溶液,連續(xù)測定6次,結(jié)果峰面積的RSD為1.1%,表明本法的儀器精密度較好。

        2.1.8 重復(fù)性試驗 取同一批石斛夜光丸供試品(陽性樣品),平行稱取6份,按“2.1.2”項下方法制成相應(yīng)溶液并測定,結(jié)果擬人參皂苷F11平均含量為149 μg·g-1,RSD為0.81%,表明本方法重復(fù)性較好。

        2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取同一批石斛夜光丸供試品(陽性樣品),按“2.1.2”項下方法的色譜條件,每隔4 h測定一次,共測定6次,結(jié)果擬人參皂苷F11峰面積的RSD為1.4%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.1.10 加樣回收試驗 取陽性供試品6 g,精密稱定,精密加入擬人參皂苷F11對照品溶液(2.4 mg·L-1)100 mL,按“2.1.2”項下方法制成相應(yīng)溶液并測定,結(jié)果加樣回收率為98.7%~104.4%,RSD為2.2%。

        2.1.11 定量限和檢測限 精密吸取擬擬人參皂苷F11對照品溶液(1.1 mg·mL-1),逐級稀釋,進樣測定,S/N為3∶1時確定檢測限,S/N為10∶1時確定定量限,結(jié)果擬人參皂苷F11的定量限、檢測限分別為13 μg·g-1、5.8 μg·g-1。

        2.1.12 限度擬訂 按照2020版《中國藥典》四部0212藥材和飲片檢定通則規(guī)定雜質(zhì)通常不得過3%[10];中藥成方制劑中人參與西洋參顯微鑒別較困難,故放寬限度,以摻偽5%西洋參(須)樣品中擬人參皂苷F11的含量平均值為限度。

        2.1.13 摻偽樣品測定 38份摻偽樣品中擬人參皂苷F11的含量平均值為40 μg·g-1,擬訂限度為石斛夜光丸每1 g含擬人參皂苷F11不得過40 μg。

        2.2 UPLC-MS/MS法

        2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流動相:以0.1%甲酸溶液為流動相A,乙腈為流動相B,梯度洗脫,0~6 min:90%A;6~20 min:90%→50%A;流速:0.25 mL·min-1;柱溫:30℃,進樣量:1 μL。

        2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源,負(fù)離子方式掃描,MRM 模式檢測;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流速:5 L·min-1;霧化氣壓力:40 psi;鞘流氣溫度:350℃;鞘流氣流速:10 L·min-1;毛細(xì)管電壓:3 kV;噴嘴電壓:500 V;選擇m/z845.5→653.4和m/z845.5→490.9作為檢測離子對。

        2.2.3 溶液的制備

        ① 對照品溶液:取擬人參皂苷F11對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含2 μg的混合溶液,即得。

        ② 供試品溶液:精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,微孔濾膜(0.22 μm)濾過,即得。

        2.2.4 專屬性試驗 分別取“2.1.2”項下溶液,精密稀釋10倍,進樣測定。結(jié)果陰性樣品和人參色譜中,均未出現(xiàn)與擬人參皂苷F11對照品色譜保留時間相同的色譜峰,表明處方中其他藥味對該測定方法無干擾,見圖2。

        圖2 UPLC-MS/MS法專屬性試驗色譜圖Fig 2 UPLC-MS/MS chromatogram of specific test

        2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.2”項下對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、1、2 mL,分別置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋并定容,搖勻,進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:Y=3.92×104X+3.04×103,r=0.9998,在0.51~20 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

        2.2.6 耐用性試驗 選取Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、Agilent Eclipse C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、Waters CORTECS C18(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)3種色譜柱,對檢出西洋參摻偽的陽性樣品進樣分析,結(jié)果3種色譜柱的分析結(jié)果一致,擬人參皂苷F11的峰面積RSD為2.0%,表明方法耐用性良好。

        2.2.7 精密度試驗 取擬人參皂苷F11對照品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件,連續(xù)進樣6次,測得峰面積的RSD為1.9%,表明該儀器精密度良好。

        2.2.8 重復(fù)性試驗 取“2.1.8”項下供試品溶液,稀釋10倍,進樣測定,結(jié)果色譜峰面積的RSD為1.7%,結(jié)果表明本法重復(fù)性較好。

        2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.9”項下供試品溶液,稀釋10倍,每隔4 h測定一次,共測定6次,結(jié)果擬人參皂苷F11峰面積RSD為1.2%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.2.10 加樣回收試驗 取陽性供試品6 g,精密稱定,精密加入擬人參皂苷F11對照品溶液(2.51 mg·L-1)100 mL,按“2.2.3”項下方法制成相應(yīng)溶液并測定,結(jié)果加樣回收率為98.03%~106.07%,RSD為3.2%。

        2.2.11 檢測限和定量限 取未檢出的空白樣品制備空白基質(zhì)溶液,精密加入擬人參皂苷F11對照品(80 μg·mL-1)0.1 mL,按“2.2.3”項下方法制備,進樣分析,按信噪比S/N≈3折算,擬人參皂苷F11的檢測限為0.6 μg·g-1;按S/N≈10折算,擬人參皂苷F11的定量限為1.9 μg·g-1。

        2.2.12 限度擬訂 不同西洋參和西洋參須制成的摻偽樣品,擬人參皂苷F11的峰面積差異較大,因此以5%西洋參摻偽樣品的平均峰面積為擬訂限度的參考。

        2.2.13 摻偽樣品測定 38份摻偽樣品的擬人參皂苷F11峰面積平均值為87 398.79,對應(yīng)對照品的質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1。

        2.2.14 判定原則 以擬人參皂苷F11對照品質(zhì)量濃度(2 μg·mL-1)為判定限度,規(guī)定結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為:以m/z845.5→653.4和m/z845.5→490.9提取的供試品離子流色譜中,應(yīng)不得同時出現(xiàn)擬人參皂苷F11保留時間一致的色譜峰;若同時出現(xiàn),則供試品色譜中m/z845.5→653.4的色譜峰面積值應(yīng)不得大于對照品溶液中相應(yīng)的峰面積值。

        3 樣品含量測定

        對91批石斛夜光丸進行檢測,采用HPLCELSD法,結(jié)果35批樣品擬人參皂苷F11含量超出擬訂限度;采用UPLC-MS/MS法檢測,結(jié)果35批樣品擬人參皂苷F11質(zhì)量濃度大于2 μg·mL-1。結(jié)果見表1。

        表1 石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的含量Tab 1 Content of pseudoginsenoside F11 in Shihu Yeguang pills

        4 討論

        4.1 檢測方法的選擇

        本試驗對擬人參皂苷F11的提取方法進行了優(yōu)化,考察了溶劑回流法和超聲提取法,比較了不同溶劑提?。状?、70%甲醇、50%甲醇)、不同溶劑用量(50、100、150 mL)、不同提取時間(45、60、90 min)、洗滌次數(shù)對提取的影響,最終選擇了本研究的提取方法。

        人參與西洋參的區(qū)分方法有薄層色譜和性狀鑒別[11]。本研究前期對薄層色譜方法進行了探索,由于薄層色譜靈敏度低,處方中藥味較多,干擾斑點影響嚴(yán)重,不適用于石斛夜光丸中西洋參的檢查。人參在石斛夜光丸中為原粉入藥,因此不能通過性狀進行鑒別。ELSD作為通用型檢測器,可快速完成對無紫外吸收化學(xué)成分的定性與定量分析,HPLC-ELSD法減少中藥制劑中紫外吸收強的成分的干擾,特別適用于測定皂苷類成分含量[12-14]。本研究使用的兩種檢測方法,UPLC-MS/MS法專屬性強,分析時間短,而HPLC-ELSD法簡便,儀器檢測成本比較低,均適用于石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的檢測。

        4.2 擬人參皂苷F11的裂解途徑

        擬人參皂苷F11為皂苷類化合物,質(zhì)譜裂解中主要丟失母核上連接的糖苷碎片,負(fù)離子模式下質(zhì)譜響應(yīng)較好,顯示較強的[M+HCOO]-m/z845.5的準(zhǔn)分子離子峰,母離子峰為m/z799.6 [MH]-,先脫去一分子鼠李糖(rha)得到碎片離子(m/z653.4),再脫去一分子葡萄糖(glc),得到m/z490.9的碎片離子,裂解途徑見圖3。

        圖3 擬人參皂苷F11質(zhì)譜裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of pseudoginsenoside F11

        4.3 評價石斛夜光丸中人參摻偽投料情況

        本研究結(jié)果顯示,35批石斛夜光丸檢出含有西洋參,不合格率為38.5%,18家生產(chǎn)企業(yè)中8家企業(yè)樣品檢出擬人參皂苷F11超出限度,可見人參摻偽問題嚴(yán)重。中成藥中人參多以粉末入藥,西洋參與人參以粉末入藥時極為相似難以通過外觀進行有效區(qū)分,多數(shù)中成藥現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)以人參皂苷Rb1、Re和Rg1作為檢驗指標(biāo),西洋參各部位(莖葉、主根、須根、蘆頭、根皮、根心等)均含人參皂苷Rb1、Re和Rg1,僅含量存在差異,以總量計含量大于人參[15-18]。調(diào)研發(fā)現(xiàn),西洋參價格與人參相當(dāng)甚至更高,而西洋參須和西洋參邊角料價格僅為西洋參價格的20%左右。因此,不法商家以西洋參須或西洋參邊角料代替人參投料。

        4.4 總結(jié)

        近年來發(fā)現(xiàn)的中成藥人參中西洋參摻偽問題較為嚴(yán)重,亟需得到重視。本研究首次建立了HPLCELSD法測定石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的含量,同時建立了UPLC-MS/MS法,兩種方法都能夠準(zhǔn)確有效地判斷石斛夜光丸中是否有西洋參摻偽投料,為評價石斛夜光丸等含人參中成藥中人參投料情況提供了技術(shù)支持。

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