趙婧雯，歐陽藝蘭，錢玉蘭，劉志，易琳*，張真慶*（.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 蘇州 5006；.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 59；.蘇州二葉制藥有限公司，江蘇 蘇州 500）

肝素治療中常伴有血小板減少癥（heparin induced thrombocytopenia，HIT），HIT分為兩種：一種是無免疫機(jī)制參與的HIT-Ⅰ型，癥狀輕微，病程呈自限性[1]；另一種是HIT-Ⅱ型，是一種免疫反應(yīng)，常伴有血栓發(fā)生[2]。臨床上，HIT通常是指HIT-Ⅱ型。HIT是肝素治療過程中的嚴(yán)重并發(fā)癥，據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，肝素引發(fā)HIT的發(fā)生率約為3%[3-5]，低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWHs）引發(fā)HIT的發(fā)生率約為0.2%。雖然肝素類藥物引起的HIT發(fā)生率并不高，但由HIT引發(fā)的血栓概率卻達(dá)30%～70%，HIT導(dǎo)致的截肢和死亡概率更是分別達(dá)10%和20%～30%[6-8]，這些嚴(yán)重威脅患者的健康與生存。

大量研究表明由肝素（heparin，Hp）、血小板因子4（PF4）、它們的復(fù)合物（PF4/Hp）以及復(fù)合物的反應(yīng)性抗體組成的超大復(fù)合物（ultra large complex，ULC）是誘發(fā)HIT的關(guān)鍵[9-12]。血小板α顆粒釋放的PF4與Hp有較強(qiáng)的結(jié)合能力，它們的復(fù)合物能夠刺激免疫細(xì)胞釋放IgG抗體，IgG通過Fab片段與PF4/Hp復(fù)合物特異性結(jié)合，形成PF4/Hp/IgG三元復(fù)合物，即HIT抗體。HIT抗體通過IgG上的Fc片段，與血小板上的FcγRIIa受體結(jié)合，進(jìn)一步激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)：一方面，激活的Fc片段介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，使HIT抗體連同血小板被巨噬細(xì)胞清除，引起血液中血小板減少；另一方面，激活血小板，使活化的血小板釋放更多的凝血因子，并促使血小板聚集而形成動(dòng)靜脈血栓，這種伴有凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的免疫原性反應(yīng)，稱為肝素引起的血小板因子減少綜合征，即HIT綜合征[13-18]。

LMWHs是由未分級(jí)肝素經(jīng)酶解、化學(xué)降解等方式制備的產(chǎn)品，不同的生產(chǎn)工藝產(chǎn)生不同種類的LMWHs，如目前臨床應(yīng)用最廣泛的依諾肝素鈉（enoxaparin sodium，Eno）是肝素芐酯化后再堿解制備而來[19]。與Hp相比，LMWHs具有出血不良反應(yīng)小、生物利用度高、半衰期長、患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)[8，20-21]，在臨床上LMWHs正在逐漸替代Hp，成為治療深度血栓等疾病的主要產(chǎn)品。LMWHs具有更低的分子量，其引起的HIT綜合征發(fā)生率明顯低于肝素，但鑒于HIT引發(fā)血栓、壞死等嚴(yán)重不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，LMWHs的免疫原性評(píng)估依然是業(yè)界關(guān)注的重點(diǎn)[22]。

2016年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）將LMWHs免疫原性研究列入仿制藥生產(chǎn)指導(dǎo)原則，即ImmunogenicityRelatedConsiderationsforLowMolecularWeightHeparin[23]；同年歐洲醫(yī)藥管理局（European Medicines Agency，EMC）同樣強(qiáng)調(diào)了LMWHs類免疫原性評(píng)估的必要性，并發(fā)表了相應(yīng)的指導(dǎo)原則，即Guidelineonnon-clinicaland clinicaldevelopmentofsimilarbiologicalmedicinal productscontaininglowmolecular-weight-heparins[24]；2020年國家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心進(jìn)一步規(guī)范了國內(nèi)LMWHs類仿制藥一致性評(píng)價(jià)過程中的免疫原性評(píng)估要求[25]。以上指導(dǎo)原則均將評(píng)估PF4-LMWHs復(fù)合物的表面電荷作為重要工作內(nèi)容之一。帶有強(qiáng)正電荷的蛋白PF4與帶有強(qiáng)負(fù)電荷的LMWHs通過靜電相互作用形成PF4-LMWHs復(fù)合物，復(fù)合物表面強(qiáng)正電荷或強(qiáng)負(fù)電荷使復(fù)合物在溶液中穩(wěn)定分散，而當(dāng)復(fù)合物表面電荷表現(xiàn)出減少或是呈中性狀態(tài)時(shí)，復(fù)合物傾向于聚集[26]，因此評(píng)估LMWHs對(duì)PF4的電中和能力，即不同摩爾比下PF4與LMWHs形成復(fù)合物的表面電荷高低，對(duì)反映LMWHs潛在的免疫原性至關(guān)重要。溶液中顆粒表面的電荷會(huì)引起附近粒子不同程度的聚集，這種聚集會(huì)在粒子表面產(chǎn)生一定的電勢(shì)，該電勢(shì)可以通過測量顆粒-液體界面處的電位差來反映，實(shí)際工作中以測定體系的Zeta電位值來反映[27-28]，即PF4與LMWHs混合體系中，PF4-LMWHs復(fù)合物總表面電荷可以通過測定體系的Zeta電位反映。

本文以LMWHs中應(yīng)用最廣泛的Eno為研究對(duì)象，建立并驗(yàn)證Zeta電位法表征PF4/Eno復(fù)合物形成的情況，為Eno仿制藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)以及提升提供一定的參考。

1 材料

Eno對(duì)照品（歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)：6.0）；Hp對(duì)照品（歐洲藥典對(duì)照品，批號(hào)：2.0）；Eno原研藥（商品名：克賽，北京賽諾菲制藥有限公司，規(guī)格：0.6 mL/6000 AxaIU，批號(hào)：8S313、9S14PA、AS184A）；Eno仿制藥（規(guī)格：0.6 mL/6000 AxaIU，批號(hào)：Y9200701、Y9200702、Y9200703，蘇州二葉制藥有限公司）；重組人源PF 4（批號(hào)：101543，純度：98%，Sigma-Aldrich公司）；PBS緩沖液（包含10 mmol·L-1Na2HPO4，1.75 mmol·L-1KH-2PO4，137 mmol·L-1NaCl，2.65 mmol·L-1KCl；pH 7.4；批號(hào)：B540626，上海生工生物工程股份有限公司）；ELGA超純水機(jī)（型號(hào)：PURELAB Option-S7/15，電阻率≥18.2 MΩ·cm，英國埃爾格公司）；Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀（英國Malvern Panalytical公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備

取Eno對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成10.00 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，用超純水稀釋摩爾濃度分別為0.13、0.25、0.50、1.00和2.00 μmol·L-1的溶液。PF4用PBS緩沖液配制成128 μmol·L-1的儲(chǔ)備液；儲(chǔ)備液用超純水稀釋至4.00 μmol·L-1，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 方法的建立與驗(yàn)證

2.2.1 Zeta電位測定 使用Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀，模型為Smoluchowski模型，設(shè)定溫度為25℃，平衡時(shí)間為120 s，樣品池類型為DTS1070。取1 mL待測液，并以緩慢均勻的速度注入樣品池，檢查是否除去所有氣泡，并用擦鏡紙擦干濺在外部電極的液體，將樣品池插入樣品槽中檢測。

2.2.2 孵育時(shí)間的考察 取4.00 μmol·L-1PF4溶液與0.25 μmol·L-1的Eno等體積混合均勻，室溫條件下分別孵育0、10、20、30、40、50、60 min后按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，每個(gè)孵育時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 PF4/Eno摩爾比的考察 取4.00 μmol·L-1PF4溶液分別與不同濃度的Eno溶液等體積混合均勻，使混合體系中PF4/Eno的摩爾比分別32∶1、16∶1、8∶1、4∶1、2∶1，室溫條件下孵育10 min后按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，每個(gè)比例下設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 方法專屬性考察 取Hp對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成10.00 mg·mL-1儲(chǔ)備液，用超純水將該儲(chǔ)備液分別稀釋成0.04、0.06、0.08、0.13和0.25 μmol·L-1的溶液。取現(xiàn)配的4.00μmol·L-1PF4溶液分別與上述不同濃度的Hp樣品溶液等體積混合均勻，使PF4/Hp摩爾比分別為96∶1、64∶1、48∶1、32∶1和16∶1，并于室溫條件下孵育10 min后按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，每個(gè)比例設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2.2.5 方法精密度考察 取PF4/Eno的摩爾比為16∶1，室溫條件下孵育10 min后按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測，儲(chǔ)備液配制當(dāng)日、次日以及第5日分別稀釋9次后進(jìn)行測定。

2.3 利用Zeta電位法比較不同批次Eno樣品對(duì)PF4電荷中和能力

取Eno樣品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成10.00 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，用超純水分別稀釋成0.13、0.25、0.40、0.50和1.00μmol·L-1的溶液。取現(xiàn)配的4.00 μmol·L-1PF4溶液分別與上述不同濃度的Eno樣品溶液等體積混合均勻，使PF4/Eno摩爾比分別為32∶1、16∶1、10∶1、8∶1和4∶1，并于室溫條件下孵育10 min，按“2.2.1”項(xiàng)下進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)分析

采用的數(shù)據(jù)分析軟件為Zetasizer software version 7.11（Malvern，Worcestershire，United Kingdom），統(tǒng)計(jì)評(píng)估軟件為Origin。將PF4/Hp（PF4/Eno）樣品復(fù)合物的Zeta數(shù)據(jù)與其摩爾比例（PHR）的對(duì)數(shù)進(jìn)行S型（Logistic）方程擬合得到Sigmoidal回歸曲線，根據(jù)S型方程計(jì)算復(fù)合物表面電荷為零時(shí)的摩爾比例（PHRζ＝0）。

3 結(jié)果

3.1 方法的建立與驗(yàn)證

3.1.1 孵育時(shí)間的考察 圖1顯示，混合體系的Zeta電位隨孵育時(shí)間延長有先增大后變小的趨勢(shì)?；旌象w系的Zeta電位在10～30 min內(nèi)呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)且整體大于15 mV，其顆粒靜電排斥力較大，復(fù)合物粒子穩(wěn)定性較好，而過長的孵育時(shí)間導(dǎo)致復(fù)合物Zeta電位下降，呈現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象。不穩(wěn)定的原因可能是由于隨著孵育時(shí)間的延長，PF4/Eno復(fù)合物粒子之間的靜電排斥力降低，以致混合體系的顆粒傾向于聚集，從而影響復(fù)合物懸浮顆粒在溶液中的電泳行為。

3.1.2 PF4/Eno摩爾比的考察 當(dāng)PF4與Eno以不同的摩爾比混合時(shí)，將Zeta電位（ζ）數(shù)據(jù)與PHR的對(duì)數(shù)進(jìn)行S型方程擬合得到Sigmoidal回歸曲線，見圖2，在一定的摩爾比范圍內(nèi)該曲線反映Eno對(duì)PF4的電荷中和情況。

圖2 PF4分別與肝素鈉和依諾肝素鈉樣品混合體系的Zeta電位隨log PHR變化圖（n＝3）Fig 2 Change of Zeta potential of PF4 mixed with heparin and enoxaparin samples with log PHR（n＝3）

該曲線顯示隨PHR增大混合體系的Zeta電位由負(fù)向正轉(zhuǎn)變，Zeta平均電位從-（51.67±0.65）mV逐漸升高至（14.77±0.64）mV，經(jīng)計(jì)算，PHRζ＝0為12.14，即PHR大約在12∶1時(shí)，PF4/Eno復(fù)合物顆粒表面凈電荷趨近零，復(fù)合物呈中性狀態(tài)。如果忽略體內(nèi)外環(huán)境差異，在此摩爾比下Eno發(fā)生免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)較高。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明PF4/Eno的摩爾比對(duì)于復(fù)合物的形成至關(guān)重要。

3.1.3 方法專屬性考察 基于上述Zeta電位法方法學(xué)的考察，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法測定未分級(jí)肝素對(duì)PF4的電荷中和能力，以便闡明該方法對(duì)不同肝素產(chǎn)品的專屬性。結(jié)果見圖2，PF4與Hp按不同比例混合，其混合體系的Zeta電位隨PF4/Hp摩爾比變化趨勢(shì)與PF4/Eno混合體系變化趨勢(shì)基本一致，即隨log PHR的增大Zeta電位由負(fù)電位向正電位轉(zhuǎn)變。PF4/Hp的混合體系電位隨著PHR的變化從-（39.37±0.96）mV逐漸升高至（10.31±0.44）mV。然而，Hp的Sigmoidal回歸曲線相對(duì)于Eno的曲線顯著向右偏移，這表明僅需要較低濃度的Hp即可中和PF4，使復(fù)合物呈中性狀態(tài)，即在相同濃度下Hp較Eno具有更高的潛在免疫原性。PF4/Eno復(fù)合物PHRζ＝0值為（12.14±0.12），PF4/Hp復(fù)合物的PHRζ＝0值為（48.25±0.60），通過t檢驗(yàn)分析，兩組數(shù)據(jù)總體均數(shù)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（差值為36.11，95%CI34.80～37.43，P＜0.001）。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Zeta電位方法能有效地應(yīng)用于不同肝素類藥物對(duì)PF4的電荷中和能力的研究，以區(qū)分不同肝素類藥物的潛在免疫原性。

3.1.4 方法精密度考察 精密度結(jié)果顯示，PF4/Eno的Zeta電位分布較穩(wěn)定，具有較窄的分布范圍，且重現(xiàn)性良好，當(dāng)日和次日分別混勻測樣，Zeta電位平均值均在19 mV左右，日內(nèi)精密度RSD值均小于8.0%，日間精密度RSD為8.2%，說明該方法穩(wěn)定性良好。

3.2 不同批次Eno樣品對(duì)PF4的電荷中和能力的比較

在PF4/Eno的比例探索過程中，發(fā)現(xiàn)Zeta電位在復(fù)合物PHR為4∶1～16∶1內(nèi)變化較大，因此按“2.3”項(xiàng)下方法調(diào)整了PF4/Eno比例。如圖3所示，原研、仿制藥Eno各3批樣品分別與PF4按不同比例混合，其混合體系的Zeta電位隨log PHR變化趨勢(shì)基本一致，Sigmoidal回歸曲線基本在同一位置，且與Hp的Sigmoidal回歸曲線有顯著性差異。經(jīng)計(jì)算，PF4和3批原研Eno復(fù)合物的PHRζ＝0范圍為8.68～10.59，平均值為9.61±0.84；3批仿制藥的PHRζ＝0值范圍為8.96～9.30，通過單因素方差分析，原研藥與仿制藥差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表1。由此數(shù)據(jù)可以推斷該3批仿制藥與3批原研藥對(duì)PF4的電荷中和能力相當(dāng)。

表1 依諾肝素鈉樣品的PHRζ＝0比較Tab 1 PHRζ＝0 of enoxaparin sodium samples

圖3 6批依諾肝素鈉樣品復(fù)合物Zeta電位隨log PHR變化的回歸曲線（n＝3）Fig 3 Sigmoidal curve of 6 batches of enoxaparin sodium samples complex Zeta potential changes with log PHR

4 討論

PF4和Eno的相互作用受動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)，其中PF4和Eno的孵育時(shí)間以及摩爾比是影響復(fù)合物形成的重要因素。本文首先建立了Zeta電位測定PF4/Eno復(fù)合物表面電荷的方法，考察了孵育時(shí)間以及摩爾比對(duì)復(fù)合物表面電荷的影響。結(jié)果表明，PF4和Eno孵育時(shí)間不宜過長，否則影響復(fù)合物在溶液中的穩(wěn)定分布。當(dāng)Eno不足時(shí)，PF4/Eno復(fù)合物表面呈正電荷模式，復(fù)合物穩(wěn)定分散，隨著Eno濃度的增加，PF4/Eno復(fù)合物的表面正電荷不斷被中和，當(dāng)PF4/Eno的摩爾比在8～12內(nèi)，復(fù)合物表面凈電荷接近零，當(dāng)Eno的濃度繼續(xù)增加時(shí)，所形成的復(fù)合物表面凈電荷變?yōu)樨?fù)，相互排斥作用又占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致較小粒子又穩(wěn)定分散。所以該方法可以用復(fù)合物電位與log PHR的Sigmoidal回歸曲線和PHRζ＝0值來評(píng)價(jià)和表征PF4/Eno復(fù)合物的特性。

PF4與Hp的相互作用規(guī)律與Eno類似，但是Hp對(duì)PF4的中和能力遠(yuǎn)大于Eno，這反映了該方法能顯著區(qū)分Eno與Hp的差異，有較強(qiáng)的專屬性。在方法學(xué)建立和驗(yàn)證的過程中所有實(shí)驗(yàn)都是3個(gè)平行樣，雖然精密度的RSD值比常規(guī)的5%要略大，但相對(duì)于大分子復(fù)合物，其RSD值是可被接受的。

總體而言，表征PF4/Eno復(fù)合物的表面電荷情況是比較樣品之間免疫原性異同的重要指標(biāo)之一。本文基于Zeta電位檢測建立了評(píng)價(jià)PF4/Eno復(fù)合物表面電荷情況的方法，確認(rèn)了兩者的孵育時(shí)間，優(yōu)化了兩者摩爾比例范圍，對(duì)比Hp明確了方法對(duì)Eno的專屬性，從跨時(shí)間和多次重復(fù)檢測的角度驗(yàn)證了方法的穩(wěn)定性和精密度。最后在實(shí)際應(yīng)用中可以確認(rèn)該方法是一個(gè)有效和可靠的從分子水平分析、對(duì)比和評(píng)價(jià)LMWHS免疫原性的方法。