魯正熹，姚靜遠，印敏，李林蔚，何曉東，劉群，李劍，陳雨*（.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院，南京 009；.江蘇省中國科學院植物研究所/江蘇省中藥材生態(tài)種植與高值化利用工程研究中心，南京 00；.南京金陵藥業(yè)股份有限公司，南京 0009；.河南金陵金銀花藥業(yè)有限公司，河南 新鄉(xiāng) 500）

脈絡寧注射液，為黃棕色至紅棕色的澄清液體，由金銀花、山銀花、牛膝、玄參、石斛等組成，有清熱養(yǎng)陰、活血化瘀的功效，臨床上用于治療血栓閉塞性脈管炎[1]、急性缺血性腦血管病[2]、急性腦梗死[3]、靜脈血栓形成[4]、動脈硬化性閉塞癥[5]、腦血栓形成及后遺癥[6]。有研究表明，脈絡寧注射液在一定程度上對治療急性缺血性卒中[7]、腰椎間盤突出癥[8]、非酒精性脂肪肝[9]、急性肺損傷[10]，喉頭水腫[11]等也有效。

脈絡寧注射液采用水煎煮提取藥效物質(zhì)，經(jīng)乙醇沉淀、乙酸乙酯萃取、濃縮等精制而得[12]，導致在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了大量廢渣。中藥廢渣的處理一直是我國醫(yī)藥行業(yè)和環(huán)境行業(yè)所關注的問題，通常采用填埋、焚燒、固定區(qū)域堆放等措施處理，但會對周圍的水質(zhì)、土壤和空氣造成嚴重的污染，影響環(huán)境質(zhì)量，且耗費大量資金[13]，因此對中藥廢渣的資源再利用極其重要。到目前為止，有關脈絡寧注射液廢渣的資源再利用，主要是對水提和醇沉物的研究[12，14-16]。乙酸乙酯萃取后的母液廢渣，為生產(chǎn)脈絡寧注射液過程中的廢棄物之一，如不進行資源化再次利用，不僅造成浪費，而且作為廢渣排放還會造成二次污染。本研究運用超高效液相-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術（ultraperformance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）對脈絡寧注射液酯提廢渣化學成分進行鑒定，并對其中的酚酸類成分（綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C）和三萜皂苷類成分（灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬皂苷乙）進行定量分析，以期為脈絡寧注射液酯提廢渣資源再利用提供科學參考，從而為后續(xù)中藥渣的回收利用和環(huán)境保護奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 UPLC-DAD-6530 ESI-Q-TOF-MS液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；KQ-400KDE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JY/YP型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；SPING-S5i超純水儀（南京妙之儀電子科技有限公司）；OSB-2200型旋轉蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；Q-TOF Quantitative Analysis定量軟件；Molecular Structure Correlator結構鑒定軟件。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（色譜純，美國ROE SCIENTIFIC INC公司）；蒸餾水（屈臣氏）；ASD-7大孔吸附樹脂（鄭州和成新材料科技有限公司）；硅膠（青島海洋化工廠）；綠原酸（批號：0753-9607）、異綠原酸A（批號：111782-201807）、異綠原酸C（批號：111894-202104）（中國食品藥品檢定研究院）；灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙來自本課題組分離，所有對照品純度均大于95%。

本研究所用脈絡寧注射液酯提廢渣來自金陵藥業(yè)股份有限公司，共8個批次，分別為20210228、20210301、20210302、20210303、20210312、201210313、20210314、20210315。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取一定質(zhì)量的脈絡寧注射液酯提廢渣，廢渣-水為1∶10稀釋，稀釋液經(jīng)ASD-7大孔樹脂柱梯度洗脫，洗脫劑為0%、10%、90%、100%乙醇水溶液，取90%乙醇水溶液洗脫部位500 μL，氮吹至干，1 mL甲醇溶解，甲醇稀釋10倍，過0.45 μm微孔濾膜，即得。其中90%乙醇水溶液部位大孔樹脂得率為43.31%～60.77%，8批脈絡寧注射液酯提浸膏過大孔樹脂后90%乙醇水溶液部分干燥質(zhì)量分別為11.5、12.0、12.1、12.4、18.5、17.9、22.4、28.5 mg。

2.1.2 對照品儲備溶液的制備 精密稱定綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬皂苷乙，制成33.33、16.67、33.33、16.67、66.67 μg·mL-1的對照品儲備溶液，冷藏備用。

2.2 色譜條件

色譜柱Agilent Poroshell 120 SB-AQ C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫0～20 min，20℃；20～75 min，40℃；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～20 min，20%～25%B；20～25 min，25%～35%B；25～40 min，35%～50%B；40～75 min，50%～70%B）；流速為0.3 mL·min-1；進樣量為5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源，離子化模式為負離子模式，毛細管電壓為3.5 kV，干燥氣溫度350℃，裂解電壓為：酚酸、黃酮和環(huán)烯醚萜90 V，三萜皂苷210 V，碰撞能量為195 V，霧化氣體為N2，離子掃描范圍為m/z100～1700，霧化氣壓力50 psi，干燥氣流速10.0 L·min-1，Skimmer電壓65 V。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS定量方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液適量，進樣分析，各成分出峰位置無干擾組分，表明本法專屬性良好，符合液質(zhì)定量分析要求，典型色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）和脈絡寧注射液酯提廢渣（B）UPLC-Q-TOF-MS圖Fig 1 UPLC-Q-TOF-MS of mixed control（A）and Mailuoning injection ester extraction residue（B）

2.4.2 線性關系、檢測限和定量限 分別精密吸取對照品儲備液適量于5 mL具塞棕色量瓶中，以甲醇逐步稀釋配成系列混合對照品溶液，進樣測定峰面積，以峰面積（Y）對對照品質(zhì)量濃度（X）進行線性回歸，計算5種分析物的回歸方程，結果見表1。

表1 5種分析物的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢測限和定量限Tab 1 Linear ranges，calibration curves，coefficients，limit of quantitation and detection of 5 analytes

2.4.3 精密度試驗 取供試品溶液，連續(xù)進樣6次，分別計算5種分析物峰面積的RSD，結果峰面積的日內(nèi)精密度RSD在2.3%～4.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進樣分析，分別計算5種分析物峰面積的RSD，結果峰面積的RSD分別在0.60%～4.6%，表明測定成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取平行制備的6份供試品溶液（批號：20210303），進樣測定峰面積，計算得綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬皂苷乙的質(zhì)量分數(shù)分別為10.98、3.92、8.06、36.90、3.87 mg·g-1，峰面積的RSD分別為0.80%、1.7%、1.6%、0.60%、1.0%，表明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收試驗 取已知含量的脈絡寧注射液酯提廢渣處理液9份（批號：20210314），分別加入低、中、高3個濃度的混合對照品溶液，進行含量測定，計算得5個成分的加樣回收率為95.38%～103.06%，RSD為0.76%～1.8%，表明本方法準確性良好。

2.5 UPLC-Q-TOF-MS定性分析脈絡寧注射液酯提廢渣

經(jīng)過色譜條件優(yōu)化，供試品溶液在負離子模式下的色譜圖得到了良好的分離效果及離子化效率，其TIC圖見圖2。

圖2 負離子模式下的脈絡寧注射液酯提廢渣TIC圖Fig 2 Total ion chromatogram of Mailuoning injection ester extract ion residues at the negative ion mode

樣品經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS進行一級及二級質(zhì)譜采集，獲得提取液中各色譜峰的保留時間、準分子離子峰及MS/MS碎片離子的精確相對分子質(zhì)量信息。若目標成分與其對照品（無對照品的與參考文獻數(shù)據(jù)比對[17-18]）的保留時間、準分子離子峰和二級特征離子吻合，以及Agilent定性軟件推斷碎片離子破碎規(guī)律，據(jù)此鑒定色譜峰。推斷出脈絡寧注射液酯提廢渣中42個化合物的結構，包括9個酚酸類化合物、9個黃酮類化合物、10個環(huán)烯醚萜類化合物、8個三萜皂苷類成分化合物、5個苯丙素類化合物和1個聯(lián)芐類化合物，結果見表2。

續(xù)表2

2.6 各類化合物結構解析規(guī)律

2.6.1 酚酸類化合物的結構鑒定 本文從脈絡寧注射液酯提廢渣中鑒定了9個綠原酸類化合物。通過MS1圖譜確定化合物5的準分子離子峰為m/z353.0866 [M-H]-，預測分子式為C16H18O9。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z191.0551、179.0321、173.0448、161.0225、127.0384、93.0327，分別計算其元素組成為C7H11O6-、C9H7O4-、C7H9O5-、、C6H7O3-和C6H5O-。綠原酸準分子離子峰m/z353.0866脫去一分子咖啡?；纬蒻/z191.0511或者脫去一分子奎寧?；纬蒻/z179.0321，m/z179.0321再脫去一分子H2O形成m/z161.0225，m/z191.0511再脫去一分子H2O形成m/z173.0448，再脫去一分子HCOOH形成m/z127.0384或者脫去兩分子H2O和一分子CO2形成m/z93.0327，與對照品比對后推斷為綠原酸。其 MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見圖3。

圖3 綠原酸的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 3 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of chlorogenic acid

雙取代酚酸類化合物，通過MS1圖譜確定化合物13的準分子離子峰為m/z515.1165 [MH]-，預測分子式為C25H24O12。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z353.0827、335.0734、191.0540、179.0323、173.0427、135.0426，分別計算其元素組成為C16H17O9-、C16H15O8-、C7H11O6-、、C7H9O5-、C8H7O2-。其中碎片離子m/z353.0827是由準分子離子峰m/z515.1165脫去一分子咖啡?；–9H6O3）形成，m/z335.0734是由碎片離子m/z353.0827脫去一分子H2O形成，m/z191.0540是由碎片離子m/z353.0827脫去一分子咖啡?；–9H6O3）形成的奎寧酸負離子，m/z179.0323是碎片離子m/z353.0827脫去一分子奎寧?；–7H10O5）形成的咖啡酸負離子，m/z173.0448是m/z191.0540脫去一分子H2O形成，m/z135.0426是由碎片離子m/z179.0323脫去一分子CO2形成，與對照品比對后推斷為異綠原酸A。其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見圖4。

圖4 異綠原酸A的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 4 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of isochlorogenic acid A

2.6.2 黃酮類化合物的結構鑒定 本文從脈絡寧注射液酯提廢渣中鑒定了9個黃酮類化合物。通過MS1圖譜確定化合物19的準分子離子峰為m/z447.0908 [M-H]-，預測分子式為C21H20O11。MS2圖譜中，主要的碎片離子為m/z285.0381，是由木犀草苷的準分子離子峰447.0908脫去一分子葡萄糖（C6H10O5）形成。與對照品比對后推斷為木犀草苷。其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見圖5。

圖5 木犀草苷的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 5 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of cynaroside

2.6.3 環(huán)烯醚萜苷類化合物的結構鑒定 本文從脈絡寧注射液酯提廢渣中鑒定了10個環(huán)烯醚萜苷類化合物。通過MS1圖譜確定化合物8的準分子離子峰為m/z403.1249 [M-H]-，預測分子式為C17H24O11。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z371.0926、223.0582、179.0660、165.0534、121.0270，分別計算其元素組成為C16H19O10-、C11H11O5-、C6H11O6-、C9H12O3-、C7H10O2-，其中碎片離子m/z371.0926是由準分子離子峰m/z403.1249脫去一分子CH3OH形成，碎片離子m/z223.0582是由準分子離子峰m/z403.1249脫去一分子葡萄糖（C6H12O6）形成，碎片離子m/z179.0660是脫去一分子葡萄糖形成的碎片離子，碎片離子m/z165.0534是由碎片離子m/z223.0582脫去COOCH2形成，碎片離子m/z165.0534脫去一分子CO2形成碎片離子m/z121.0270。與對照品比對后推斷為斷氧化馬錢子苷。其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見圖6。

圖6 斷氧化馬錢子苷的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 6 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of secoxyloganin

2.6.4 三萜皂苷類化合物的結構鑒定 本文從脈絡寧注射液酯提廢渣中鑒定了8個三萜皂苷類化合物。通過MS1圖譜確定化合物35的準分子離子峰為m/z1397.6427 [M-H]-，預測分子式為C65H106O32。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z1073.5338、911.4834，分別計算其元素組成為C53H85O22-、C47H75O17-，其中相對豐度最高的碎片離子m/z1073.5338是由準分子離子峰m/z1397.6427脫去兩分子葡萄糖（C12H20O10）形成，m/z1073.5338脫去一分子鼠李糖形成碎片離子m/z911.4834。與對照品比對后推斷為灰氈毛忍冬皂苷乙。其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見圖7。

圖7 灰氈毛忍冬皂苷乙的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 7 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of macranthoidin B

2.6.5 苯丙素類化合物的結構鑒定 本文從脈絡寧注射液酯提廢渣中鑒定了5個苯丙素類化合物。通過MS1圖譜確定化合物23的準分子離子峰為m/z783.2668 [M-H]-。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z607.2151、461.1614、329.1203、175.0393，分別計算其元素組成為C26H39O16-、C20H29O12-、C15H21O8-、C10H7O3-。其中碎片離子m/z607.2151是分子離子峰脫去阿魏酰基（C10H8O3）所形成，m/z607.2151 脫去一分子鼠李糖基（C6H10O4）形成碎片離子m/z461.1614，碎片離子m/z329.1203是碎片離子m/z461.1614脫去C5H8O4形成，碎片離子m/z175.0393是碎片離子m/z329.1203脫去C5H14O5形成，其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見圖8。

圖8 安格洛苷C的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 8 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of angoroside C

2.6.6 聯(lián)芐類化合物的結構鑒定 本文從脈絡寧注射液酯提廢渣中鑒定了1個聯(lián)芐類化合物。通過MS1圖譜確定化合物34的準分子離子峰為m/z303.1239 [M-H]-。MS2圖譜中主要的碎片離子為m/z221.1564，分別計算其元素組成為C13H17O3-。其中碎片離子m/z221.1564是碎片離子m/z303.1239脫去C4H3O2形成，其MS2質(zhì)譜和具體的質(zhì)譜裂解行為見圖9。

圖9 杓唇石斛素的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑推斷Fig 9 MS/MS spectra and MS fragmentation pathway deduction of moscatilin

2.7 樣品含量測定

取8批脈絡寧注射液酯提廢渣制備供試品溶液，對8 批脈絡寧注射液酯提廢渣大孔樹脂富集液的5種有效成分進行含量測定，結果見表3。

3 討論

本試驗對大孔樹脂富集（0%→10%→100%乙醇水溶液洗脫）脈絡寧注射液酯提廢渣化學成分的程度進行了考察，洗脫劑分別為0%→10%→50%→100%乙醇水溶液；0%→ 20%→50%→100%乙醇水溶液和0%→ 10%→ 60%/70%/80%/90%乙醇水溶液；經(jīng)液相色譜結果分析，結果發(fā)現(xiàn)洗脫劑為0%→10%→90%乙醇水溶液梯度洗脫時，90%乙醇部位主要化學成分富集程度最大。

由脈絡寧注射液酯提廢渣鑒定結果表明，其中環(huán)烯醚萜苷類成分最多，推測脈絡寧酯提廢渣中可能含有較多的金銀花和山銀花原藥材成分；含量測定結果顯示，脈絡寧注射液酯提廢渣大孔樹脂富集液中三萜皂苷類成分（灰氈毛忍冬皂苷甲和灰氈毛忍冬皂苷乙）的含量最高，其次為酚酸類成分（綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C），表明廢渣中含有豐富的原藥材活性成分，尤其是酚酸類和三萜皂苷類成分含量較高。

以往的中藥廢棄物的主要用途是作為有機肥料[19]、微生物發(fā)酵產(chǎn)物[20]、燃料和飼料添加劑，以及開發(fā)高附加值的資源產(chǎn)品[21]。該研究采用ASD-7大孔樹脂柱富集方法和UHPLC-Q-TOFMS技術建立了脈絡寧注射液酯提廢渣大孔樹脂富集液中化學成分的鑒定以及5種有效成分的含量測定方法，通過液相色譜的分離和質(zhì)譜的檢測，推斷了脈絡寧注射液酯提廢渣的主要化學成分組成，并對其中酚酸類和三萜皂苷類成分進行含量測定，結果明確了多種中藥材活性成分在廢渣中的含量，首次實現(xiàn)了脈絡寧注射液酯提廢渣化學成分的鑒定和有效成分的含量測定，為脈絡寧注射液酯提廢渣后續(xù)再利用提供了科學依據(jù)。