陳尹心,常子豪,胡倩,劉宇琦,高曄,黃雅,雒曉衛(wèi),王樹楷,周立鵬,王保錦,王朝慧,崔藝彤,劉越,張?zhí)m珍(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 102488)
腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細胞。一般來說,在不同生理病理因素刺激下,巨噬細胞可分化成兩種極化狀態(tài),即經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。其中,M1型參與促炎反應(yīng)的同時也發(fā)揮抗腫瘤活性,而M2型則參與抗炎反應(yīng),并能通過腫瘤免疫抑制等作用促進腫瘤發(fā)展。調(diào)控M2型巨噬細胞向M1型極化能夠增強腫瘤免疫反應(yīng)、抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成[1]。因此,調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化已經(jīng)成為一種多機制、多功能的高效免疫治療策略。
余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥成熟果實,具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效[2]。現(xiàn)代研究表明,余甘子主要含有酚酸類、鞣質(zhì)類成分。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)余甘子鞣質(zhì)在體外能誘導(dǎo)人肝癌細胞BEL-7402早期凋亡和G2/M期阻滯[3],通過調(diào)節(jié)MAPK通路,降低MPPs的表達,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[4]。臨床研究表明余甘子鞣質(zhì)具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。但其是否具有重塑免疫抑制微環(huán)境抑制腫瘤生長的作用以及其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不清楚。因此,本研究以M2型巨噬細胞為對象篩選抑制M2型巨噬細胞極化調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的余甘子活性部位,并結(jié)合UPLC-Q-Exactive-MS/MS技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。
超高效液相色譜儀和Q-Exactive 高分辨質(zhì)譜儀、CO2細胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(Thermo Scientific 公司);十萬分之一分析天平(Sartorius公司);KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠);DT5-6A 型臺式離心機(北京時代北利離心機有限公司);PCR 擴增儀(德國 Eppendorf 公司);QuantStudio 6 Flex 實時熒光定量 PCR 儀(CFX 96,Biorad 公司)。
乙腈、甲酸(質(zhì)譜純,Thermo Fisher 公司);蒸餾水[屈臣氏集團(香港)有限公司];MCI小孔吸附樹脂(日本三菱化學(xué)公司);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Biological Industries公司);RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及 SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);重組小鼠白細胞介素-4(IL-4)、重組小鼠白細胞介素-13(IL-13)(PeproTech公司);余甘子鞣質(zhì)部位(江西青峰藥業(yè)有限公司)。
小鼠 RAW264.7 單核巨噬細胞(北京協(xié)和細胞庫)凍存于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院細胞平臺。細胞復(fù)蘇后在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.1.1 樣品的制備 取余甘子鞣質(zhì)部位(鞣質(zhì)含量58%),加去離子水使溶解,經(jīng)MCI小孔樹脂柱色譜吸附,依次用不同濃度的甲醇(20%、30%、40%、50%、100%)梯度洗脫,每步洗脫至洗脫液近無色時更換為下一洗脫梯度。合并相同洗脫液,低溫濃縮,干燥成粉。
2.1.2 CCK-8法檢測細胞增殖 將RAW264.7細胞鋪于96孔板中,用不同濃度的不同余甘子鞣質(zhì)洗脫部位(5、10、20、40、80、160、320 μg·mL-1)100 μL培養(yǎng)24 h后,加入CCK-8試劑,檢測各孔吸光度值(OD值),計算細胞存活率:細胞存活率(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。結(jié)果見圖1,當藥物質(zhì)量濃度≤40 μg·mL-1,對RAW264.7細胞存活率均在85%以上,無明顯抑制作用,說明質(zhì)量濃度≤40 μg·mL-1時對巨噬細胞無明顯細胞毒作用。因此,本研究選取40 μg·mL-1的濃度用于后續(xù)對不同洗脫部位篩選的研究。
圖1 不同質(zhì)量濃度的余甘子鞣質(zhì)對巨噬細胞活性的影響(n=3)Fig 1 Effect of different concentration of tannins in Phyllanthus emblica L.on the proliferation of RAW264.7 cells(n=3)
2.1.3 qPCR實驗檢測M2巨噬細胞中Arg-1、CD206、TNF-αmRNA表達 將RAW264.7細胞接種于12孔板中,不進行M2型誘導(dǎo)的為空白組(ctrl組)、用IL-4和IL-13誘導(dǎo)而不給藥干預(yù)的為M2組,用IL-4和IL-13誘導(dǎo)后余甘子鞣質(zhì)不同洗脫部位干預(yù)24 h為給藥組,收集細胞,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,進行qPCR檢測。設(shè)計合成Arg1、CD206、TNF-α基因引物,以Hprt1為內(nèi)參,設(shè)置反應(yīng)程序,目標基因的表達水平用2-ΔΔCt比較法進行評估,結(jié)果見圖2。模型組RAW264.7細胞表達更高水平的Arg-1和CD206(P<0.05,P<0.0001),表明IL-4和IL-13作用后成功誘導(dǎo)巨噬細胞向M2型極化。各個洗脫部位對M2型標志基因的mRNA表達均有一定的抑制作用。除100%甲醇洗脫部位外,不同的洗脫部位對Arg-1的表達均有抑制作用,其中20%甲醇洗脫部位具有極顯著的抑制作用(P<0.001)。同樣的,20%甲醇洗脫部位顯著降低CD206mRNA的表達,升高TNF-αmRNA的表達(P<0.001),其調(diào)控巨噬細胞極化的活性明顯強于其他洗脫部位,是余甘子鞣質(zhì)調(diào)控巨噬細胞極化的主要活性部位(EFP)。因此,接下來對20%甲醇洗脫部位所含化學(xué)成分進行進一步研究。
圖2 余甘子鞣質(zhì)不同洗脫部位對M2巨噬細胞極化的影響(n=3)Fig 2 Effect of different elution parts of tannins in Phyllanthus emblica L.on the polarization of M2 macrophages(n=3)
2.1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 結(jié)果采用Graphpad prism 8.4.3軟件進行統(tǒng)計分析,各組間的比較采用單因素方差分析,所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±s)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.2.1 色譜條件 色譜柱:ACE Excel 3 C18-PFP(150 mm×4.6 mm,3 μm);流動相:0.1%甲酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~3 min,6%~12%B;3~18 min,12%~20% B;18~28 min,20%~30%B;28~30 min,30%B;30~34 min,30%~95%B);流速:0.5 mL·min-1;進樣量:5 μL;柱溫:30℃。
2.2.2 質(zhì)譜條件 配有熱噴霧離子源(HESI),負離子模式檢測,離子源參數(shù)設(shè)置如下:毛細管和輔助氣體加熱器溫度分別為300和350℃;噴霧電壓為3.2 kV;鞘氣(N2)流量為35 arb,輔助氣體(N2)流量為15 arb。歸一化碰撞能量(NCE)為±35 V。在Full-MS/dd-MS2條件下,掃描范圍為m/z100~1500。采用 Xcalibur 3.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。
2.2.3 20%甲醇洗脫部位化學(xué)成分分析 采用上述分析條件,對20%甲醇洗脫部位的化學(xué)成分進行定性分析。在負離子模式下20%甲醇洗脫部位總離子流圖如圖3所示。通過參考相關(guān)文獻[6-14]、對比保留時間、精確質(zhì)譜信息等,對EFP的化學(xué)成分進行確認,鑒定出 29個可能的化學(xué)成分,包括7個酚酸類、12個簡單沒食子酰類、9個鞣花鞣質(zhì)類、1個其他類。UPLC-Q-Exactive-MS/MS 數(shù)據(jù)見表1。
表1 EFP化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定Tab 1 Structure identification of chemical components in EFP
圖3 負離子模式下20% 洗脫部位的總離子流圖Fig 3 Total ion flow chromatogram of 20% methanol eluted part in negative ion mode
2.2.4 化合物分析
① 酚酸類:共鑒定出7個酚酸類化合物成分。酚酸類化合物是一類含酚環(huán)的有機酸,含有較多的酚羥基和羧基,其質(zhì)譜裂解特點是容易失去H2O、CO2和CO等基團?;衔?的保留時間是7.30 min,準分子離子峰為m/z169.0142 [M-H]-,分子式為C7H6O5。經(jīng)碰撞解離,失去一個CO2產(chǎn)生碎片m/z125.0254 [M-H-CO2]-,結(jié)合文獻[7]推測為沒食子酸;化合物29的保留時間為24.49 min,準分子離子峰為m/z300.9993 [M-H]-,分子式為C14H6O8。經(jīng)碰撞產(chǎn)生二級碎片m/z283.9963 [M-HOH]-;或失去一個CO2產(chǎn)生碎片m/z257.0081[M-H-CO2]-,再失去一個CO產(chǎn)生229.0145 [M-HCO2-CO]-,再失去CO產(chǎn)生201.0200 [M-H-CO2-2CO]-,結(jié)合文獻[7]推測該化合物為鞣花酸。
② 簡單沒食子酰類:共鑒定出12個簡單沒食子酸酰類化合物成分。簡單沒食子酸酰類化合物主要為沒食子酸衍生物,較易脫去沒食子?;?galloyl)?;衔?4、20的保留時間分別為9.42 min、11.95 min,準分子離子峰分別為m/z483.0782 [M-H]-、m/z483.0780 [M-H]-,擬合分子式均為C20H20O14,兩者為同分異構(gòu)體,裂解方式相同。以化合物20為例,該化合物經(jīng)碰撞失去一個沒食子?;?,得到m/z331.0677 [M-HGal]-,再失去一個H2O得到m/z313.0566 [M-HGal-H2O]-,失去一個中性碎片C4H8O4得到m/z211.0252[M-H-Gal-C4H8O4]-,或失去一分子葡萄糖得到m/z169.0149 [M-H-Gal-Glu]-,再失去一個CO2得到m/z125.0251 [M-H-Gal-Glu-CO2]-,結(jié)合文獻[8]推測該化合物為二沒食子酰葡萄糖苷digalloylglucose。
③ 鞣花鞣質(zhì)類:共鑒定出9個鞣花鞣質(zhì)類成分。鞣花鞣質(zhì)是一類含六羥基聯(lián)苯二酸或與其有生源關(guān)系的酚羧酸與多元醇縮合形成的酯,較易失去六羥基二苯甲?;℉HDP)基團、沒食子酰基,水解后可生成鞣花酸。余甘子中主要含有的與HHDP有生源關(guān)系的酚羧酸?;饕窃X子?;–he)。化合物 27 的保留時間為16.61 min,準分子離子峰為m/z633.0743 [M-H]-,擬合分子式為 C27H22O18,脫去一個沒食子酸,得到m/z463.0520,該碎片再丟失一分子葡萄糖(glu),得到m/z300.9993 [M-HGal-Glu]-,繼續(xù)失去CO2得到m/z257.0089 [M-HGal-H2O-Glu-CO2]-,再脫去CO得到m/z229.0154[M-H-Gal-H2O-Glu-CO2-CO]-,沒食子酸自母離子脫去產(chǎn)生特征碎片離子m/z169.0150 [gallic acid]-,結(jié)合文獻[14]推測其為柯里拉京。
2.3.1 活性成分的篩選及靶點的預(yù)測 將液質(zhì)鑒定出的化合物輸入SwissADME平臺(http://www.swissadme.ch/),以胃腸道吸收得分為“high”,類藥性至少通過2個“Yes”進行篩選,并結(jié)合課題組前期研究[6]余甘子鞣質(zhì)入血成分獲得潛在化合物。共篩選出11種活性成分,分別為鞣花酸、沒食子酸乙酯、沒食子酸甲酯、沒食子酸、柯里拉京、1,4,6-tri-O-galloyl-glucose、3,4,6-tri-O-galloyl-glucose、mucic acid 2-O-gallate、訶子次酸、特里馬蘇I、訶子寧。在SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫中預(yù)測不同成分的靶點基因,篩選probability>0的靶點,得到成分的預(yù)測靶點。從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中查找并篩選差異表達基因,將巨噬細胞差異靶點基因與20%甲醇洗脫部位相關(guān)成分預(yù)測靶點進行比對,取交集作為潛在靶點基因。結(jié)果預(yù)測得94個靶點基因。從GEO數(shù)據(jù)庫中下載編號為GSE5099的人類基因芯片,通過GEO2R功能以P<0.05且|log2FC|>0.5為標準,篩選去重后得到巨噬細胞相關(guān)的靶點共5391個。對活性成分信息和巨噬細胞相關(guān)靶點進行分析,得到交集靶點37個,將其視為20%甲醇洗脫部位調(diào)控巨噬細胞的潛在靶點。
2.3.2 “藥物成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2軟件的“Merge”工具構(gòu)建“藥物成分-潛在靶點-巨噬細胞”網(wǎng)絡(luò)(見圖4),共包括49個節(jié)點,126條邊。根據(jù)度值排序得到主要的活性成分為鞣花酸、沒食子酸甲酯、1,4,6-tri-O-galloyl-glucose、沒食子酸、沒食子酸乙酯等;這些成分作用的靶點有高角鯊烯環(huán)氧化酶(SQLE)、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1(PTPN1)、β分泌酶1(BACE1)、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶2(PTPN2)、重組人醛糖還原酶(AKR1B1)等,揭示其或許與余甘子鞣質(zhì)調(diào)控巨噬細胞的過程密切相關(guān)。
圖4 20%甲醇洗脫部位調(diào)控巨噬細胞細胞的“藥物成分-潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Network of “component-potential target” of 20% methanol eluted part
2.3.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 在 STRING 平臺(https://STRING-db.org/)輸入交集靶點,限定物種為“智人”,獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用 Cytoscape 3.7.2 軟件,對 PPI 網(wǎng)絡(luò)進行可視化操作。結(jié)果見圖5,通過 Network Analyzer 插件分析其拓撲學(xué)特征,篩選關(guān)鍵靶點主要為絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、和酪氨酸專一性蛋白激酶(Src)、前列腺素過氧化物合成酶 2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)、糖原合成酶激酶(GSK3B)等。
圖5 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 5 PPI network of potential targets
2.3.4 靶點功能富集分析與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Sangerbox平臺(http://sangerbox.com/)對交集靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析,并對排名前 20 的通路進行結(jié)果可視化。
對37個交集靶點進行 GO 功能富集分析(P<0.05),共獲得 2438個 GO 條目,包括生物過程(BP)條目 2096個、細胞組成(CC)條目 146個、分子功能(MF)條目 196個,對排名前 10 的各類GO條目進行可視化處理,結(jié)果見圖6A。BP主要涉及對有機物的反應(yīng)、對含氧化合物的反應(yīng)、對化學(xué)刺激的細胞反應(yīng)等;CC主要涉及囊泡、膜筏、膜微區(qū)等;MF主要涉及一氧化氮合酶活性、酶結(jié)合、激酶結(jié)合等。
圖6 GO富集分析條形圖(A)和KEGG富集分析氣泡圖(B)Fig 6 GO enrichment analysis(A)and KEGG pathways enrichment analysis(B)of potential targets
KEGG富集相關(guān)通路76條(P<0.05),對排名前20的通路進行可視化展示(見圖6B),包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1信號通路、癌癥信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-kappaB信號通路等。
精氨酸酶-1(Arg-1)和甘露糖受體(CD206)是M2巨噬細胞的識別標志物。Arg-1與iNOS競爭L-精氨酸作為底物,生成膠原蛋白前體L-鳥氨酸,形成促進腫瘤生長的纖維化微環(huán)境[15]。此外,Arg-1通過代謝L-精氨酸直接影響CD8+T細胞[16],CD206可通過抑制CD45磷酸酶活性損害CD8+T細胞的細胞毒性[17],導(dǎo)致腫瘤細胞免疫逃逸。因此,本研究利用M2型RAW264.7細胞模型篩選出余甘子鞣質(zhì)20%甲醇洗脫部位,發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制M2型巨噬細胞識別標志物Arg-1、CD206的表達,同時促進M1型標志物TNF-α,提升其抗腫瘤免疫活性。
利用UPLC-MS分析20%甲醇洗脫部位定性鑒別出29個化學(xué)成分,主要為酚酸類化合物和鞣質(zhì)類化合物。進一步根據(jù)課題組前期研究[6]和SwissADME平臺獲得11個活性成分進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析?!八幬锍煞?潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中度值靠前的成分分別有沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯等。毛赫新等[18]發(fā)現(xiàn)沒食子酸能夠降低M1型巨噬細胞陽性表達率,抑制iNOS和IL-1βmRNA表達水平,抑制IFN-γ/LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞向M1型的極化。柯里拉京可以通過抑制IL-13Ralpha1信號通路抑制M2巨噬細胞極化[19]。此外,鞣花酸通過ERK1/2/RSK信號通路抑制腫瘤細胞功能[20],沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯能夠通過抑制腫瘤細胞中Akt和ERK1/2活性、ERK1/2/RSK信號通路來發(fā)揮抗腫瘤作用[21-22],但對于這些成分的研究主要集中在對腫瘤細胞的直接作用,對其抗腫瘤免疫的作用卻鮮有報道。
通過KEGG富集分析可推斷,20%甲醇洗脫部位調(diào)控巨噬細胞的信號通路主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān),例如PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB信號通路等。
PI3K/Akt信號通路上匯集多種胞內(nèi)和胞外信號,可以調(diào)節(jié)巨噬細胞的遷移、增殖、自噬、極化、代謝功能和炎癥反應(yīng)[23]。PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成,能夠誘發(fā)其底物磷酸化為3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。Akt是PI3K/Akt通路中調(diào)節(jié)巨噬細胞功能的最重要的效應(yīng)分子,Akt2 能促使巨噬細胞向 M1 型極化[24];敲除Akt2使miR-155水平降低,C/EBPβ(M2極化的調(diào)節(jié)因子)表達增加[25]。此外,Akt2缺陷的巨噬細胞能夠上調(diào)miR-164a導(dǎo)致TLR4信號通路的負調(diào)控,促進M2型極化[23]。研究表明,可以通過調(diào)節(jié)PI3K-p110蛋白表達,Akt磷酸化水平,調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的作用,從而干預(yù)腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。mTOR是PI3K/Akt的下游信號,在協(xié)調(diào)代謝和炎癥信號來調(diào)節(jié)巨噬細胞表型方面也發(fā)揮作用[27]。
HIF-1信號通路是生物處于低氧狀態(tài)下的應(yīng)激信號通路,它由氧調(diào)節(jié)的α亞基和組成型表達的β亞基組成的異源二聚體。根據(jù)α亞基的不同,又分為 3種亞型,分別是 HIF-1α、HIF-2α和 HIF-3α,其中HIF-1α是介導(dǎo)缺氧信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞[28-29]。當PI3K/Akt信號通路的激活后,Akt磷酸化,能夠增強HIF-1α的活性,抑制其蛋白酶體降解[30]。HIF-α亞基可在巨噬細胞中被差異激活,Th1細胞因子能夠通過誘導(dǎo)HIF-1α調(diào)控巨噬細胞向M1型極化,相反,Th2細胞因子通過誘導(dǎo)HIF-2α調(diào)控M2型極化[31],也有研究表明,通過作用于HIF-1α和HIF-1β的共有靶點IL-1β能夠影響巨噬細胞M1型極化和炎癥反應(yīng)[32]。此外,HIF-1通路與細胞的代謝,尤其是糖酵解水平有關(guān)。LDHA、GLUT1、PDK1等均為HIF-1α的作用靶點。HIF-1α激活會增加巨噬細胞的遷移活性并影響巨噬細胞的代謝功能,巨噬細胞的代謝改變與其表型和功能密切相關(guān)[28,33]。研究表明,經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑促進HIF-1α蛋白降解,抑制糖酵解通路,能夠影響M1型巨噬細胞極化,抑制結(jié)腸炎發(fā)生[34];抑制M2巨噬細胞線粒體氧化磷酸化,能夠抑制M2巨噬細胞極化,增強抗腫瘤效能[35]。
NF-κB信號通路是PI3K/Akt信號通路的下游通路之一,是調(diào)節(jié)炎癥因子產(chǎn)生的重要通路。IκB激酶被激活后,誘導(dǎo)NF-κB抑制蛋白磷酸化并降解,激活NF-κB,暴露出核定位序列,與細胞核內(nèi)特定位點結(jié)合,啟動多種靶基因的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生并釋放細胞因子[36]。脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細胞M1極化依賴于NF-kBp65的激活[37]。姚靜靜[38]提出通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)M2巨噬細胞清道夫受體MSR1、CD36和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78的表達,能夠影響巨噬細胞的極化。
本實驗基于M2巨噬細胞模型篩選的有效部位可能通過調(diào)控TAMs的免疫抑制活性在抗腫瘤治療中發(fā)揮作用?;?LC-MS 結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了20%甲醇洗脫部位調(diào)控巨噬細胞極化的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制,其分子機制可能是與PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、NF-κB信號通路有關(guān)。本研究為后續(xù)深入驗證余甘子鞣質(zhì)調(diào)控巨噬細胞的作用機制奠定基礎(chǔ)。