陳尹心，常子豪，胡倩，劉宇琦，高曄，黃雅，雒曉衛(wèi)，王樹(shù)楷，周立鵬，王保錦，王朝慧，崔藝彤，劉越，張?zhí)m珍（北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488）

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)，在不同生理病理因素刺激下，巨噬細(xì)胞可分化成兩種極化狀態(tài)，即經(jīng)典活化的M1型和替代活化的M2型。其中，M1型參與促炎反應(yīng)的同時(shí)也發(fā)揮抗腫瘤活性，而M2型則參與抗炎反應(yīng)，并能通過(guò)腫瘤免疫抑制等作用促進(jìn)腫瘤發(fā)展。調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞向M1型極化能夠增強(qiáng)腫瘤免疫反應(yīng)、抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成[1]。因此，調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化已經(jīng)成為一種多機(jī)制、多功能的高效免疫治療策略。

余甘子為大戟科葉下珠屬植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥成熟果實(shí)，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳之功效[2]?，F(xiàn)代研究表明，余甘子主要含有酚酸類、鞣質(zhì)類成分。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)余甘子鞣質(zhì)在體外能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞BEL-7402早期凋亡和G2/M期阻滯[3]，通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK通路，降低MPPs的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。臨床研究表明余甘子鞣質(zhì)具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。但其是否具有重塑免疫抑制微環(huán)境抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用以及其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究以M2型巨噬細(xì)胞為對(duì)象篩選抑制M2型巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的余甘子活性部位，并結(jié)合UPLC-Q-Exactive-MS/MS技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀和Q-Exactive 高分辨質(zhì)譜儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（Thermo Scientific 公司）；十萬(wàn)分之一分析天平（Sartorius公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）；DT5-6A 型臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；PCR 擴(kuò)增儀（德國(guó) Eppendorf 公司）；QuantStudio 6 Flex 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（CFX 96，Biorad 公司）。

1.2 試藥

乙腈、甲酸（質(zhì)譜純，Thermo Fisher 公司）；蒸餾水[屈臣氏集團(tuán)（香港）有限公司]；MCI小孔吸附樹(shù)脂（日本三菱化學(xué)公司）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（Biological Industries公司）；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及 SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；重組小鼠白細(xì)胞介素-4（IL-4）、重組小鼠白細(xì)胞介素-13（IL-13）（PeproTech公司）；余甘子鞣質(zhì)部位（江西青峰藥業(yè)有限公司）。

1.3 細(xì)胞

小鼠 RAW264.7 單核巨噬細(xì)胞（北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)）凍存于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院細(xì)胞平臺(tái)。細(xì)胞復(fù)蘇后在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 余甘子鞣質(zhì)不同洗脫部位對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

2.1.1 樣品的制備 取余甘子鞣質(zhì)部位（鞣質(zhì)含量58%），加去離子水使溶解，經(jīng)MCI小孔樹(shù)脂柱色譜吸附，依次用不同濃度的甲醇（20%、30%、40%、50%、100%）梯度洗脫，每步洗脫至洗脫液近無(wú)色時(shí)更換為下一洗脫梯度。合并相同洗脫液，低溫濃縮，干燥成粉。

2.1.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將RAW264.7細(xì)胞鋪于96孔板中，用不同濃度的不同余甘子鞣質(zhì)洗脫部位（5、10、20、40、80、160、320 μg·mL-1）100 μL培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑，檢測(cè)各孔吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。結(jié)果見(jiàn)圖1，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度≤40 μg·mL-1，對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率均在85%以上，無(wú)明顯抑制作用，說(shuō)明質(zhì)量濃度≤40 μg·mL-1時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒作用。因此，本研究選取40 μg·mL-1的濃度用于后續(xù)對(duì)不同洗脫部位篩選的研究。

圖1 不同質(zhì)量濃度的余甘子鞣質(zhì)對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響（n＝3）Fig 1 Effect of different concentration of tannins in Phyllanthus emblica L.on the proliferation of RAW264.7 cells（n＝3）

2.1.3 qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)M2巨噬細(xì)胞中Arg-1、CD206、TNF-αmRNA表達(dá) 將RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板中，不進(jìn)行M2型誘導(dǎo)的為空白組（ctrl組）、用IL-4和IL-13誘導(dǎo)而不給藥干預(yù)的為M2組，用IL-4和IL-13誘導(dǎo)后余甘子鞣質(zhì)不同洗脫部位干預(yù)24 h為給藥組，收集細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。設(shè)計(jì)合成Arg1、CD206、TNF-α基因引物，以Hprt1為內(nèi)參，設(shè)置反應(yīng)程序，目標(biāo)基因的表達(dá)水平用2-ΔΔCt比較法進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果見(jiàn)圖2。模型組RAW264.7細(xì)胞表達(dá)更高水平的Arg-1和CD206（P＜0.05，P＜0.0001），表明IL-4和IL-13作用后成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。各個(gè)洗脫部位對(duì)M2型標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)均有一定的抑制作用。除100%甲醇洗脫部位外，不同的洗脫部位對(duì)Arg-1的表達(dá)均有抑制作用，其中20%甲醇洗脫部位具有極顯著的抑制作用（P＜0.001）。同樣的，20%甲醇洗脫部位顯著降低CD206mRNA的表達(dá)，升高TNF-αmRNA的表達(dá)（P＜0.001），其調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的活性明顯強(qiáng)于其他洗脫部位，是余甘子鞣質(zhì)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的主要活性部位（EFP）。因此，接下來(lái)對(duì)20%甲醇洗脫部位所含化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 余甘子鞣質(zhì)不同洗脫部位對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化的影響（n＝3）Fig 2 Effect of different elution parts of tannins in Phyllanthus emblica L.on the polarization of M2 macrophages（n＝3）

2.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果采用Graphpad prism 8.4.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間的比較采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 UPLC-Q-Exactive-MS/MS分析條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACE Excel 3 C18-PFP（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，6%～12%B；3～18 min，12%～20% B；18～28 min，20%～30%B；28～30 min，30%B；30～34 min，30%～95%B）；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 配有熱噴霧離子源（HESI），負(fù)離子模式檢測(cè)，離子源參數(shù)設(shè)置如下：毛細(xì)管和輔助氣體加熱器溫度分別為300和350℃；噴霧電壓為3.2 kV；鞘氣（N2）流量為35 arb，輔助氣體（N2）流量為15 arb。歸一化碰撞能量（NCE）為±35 V。在Full-MS/dd-MS2條件下，掃描范圍為m/z100～1500。采用 Xcalibur 3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.2.3 20%甲醇洗脫部位化學(xué)成分分析 采用上述分析條件，對(duì)20%甲醇洗脫部位的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。在負(fù)離子模式下20%甲醇洗脫部位總離子流圖如圖3所示。通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-14]、對(duì)比保留時(shí)間、精確質(zhì)譜信息等，對(duì)EFP的化學(xué)成分進(jìn)行確認(rèn)，鑒定出 29個(gè)可能的化學(xué)成分，包括7個(gè)酚酸類、12個(gè)簡(jiǎn)單沒(méi)食子酰類、9個(gè)鞣花鞣質(zhì)類、1個(gè)其他類。UPLC-Q-Exactive-MS/MS 數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 EFP化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定Tab 1 Structure identification of chemical components in EFP

圖3 負(fù)離子模式下20% 洗脫部位的總離子流圖Fig 3 Total ion flow chromatogram of 20% methanol eluted part in negative ion mode

2.2.4 化合物分析

① 酚酸類：共鑒定出7個(gè)酚酸類化合物成分。酚酸類化合物是一類含酚環(huán)的有機(jī)酸，含有較多的酚羥基和羧基，其質(zhì)譜裂解特點(diǎn)是容易失去H2O、CO2和CO等基團(tuán)。化合物9的保留時(shí)間是7.30 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z169.0142 [M-H]-，分子式為C7H6O5。經(jīng)碰撞解離，失去一個(gè)CO2產(chǎn)生碎片m/z125.0254 [M-H-CO2]-，結(jié)合文獻(xiàn)[7]推測(cè)為沒(méi)食子酸；化合物29的保留時(shí)間為24.49 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z300.9993 [M-H]-，分子式為C14H6O8。經(jīng)碰撞產(chǎn)生二級(jí)碎片m/z283.9963 [M-HOH]-；或失去一個(gè)CO2產(chǎn)生碎片m/z257.0081[M-H-CO2]-，再失去一個(gè)CO產(chǎn)生229.0145 [M-HCO2-CO]-，再失去CO產(chǎn)生201.0200 [M-H-CO2-2CO]-，結(jié)合文獻(xiàn)[7]推測(cè)該化合物為鞣花酸。

② 簡(jiǎn)單沒(méi)食子酰類：共鑒定出12個(gè)簡(jiǎn)單沒(méi)食子酸酰類化合物成分。簡(jiǎn)單沒(méi)食子酸酰類化合物主要為沒(méi)食子酸衍生物，較易脫去沒(méi)食子酰基（-galloyl）?；衔?4、20的保留時(shí)間分別為9.42 min、11.95 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z483.0782 [M-H]-、m/z483.0780 [M-H]-，擬合分子式均為C20H20O14，兩者為同分異構(gòu)體，裂解方式相同。以化合物20為例，該化合物經(jīng)碰撞失去一個(gè)沒(méi)食子?；?，得到m/z331.0677 [M-HGal]-，再失去一個(gè)H2O得到m/z313.0566 [M-HGal-H2O]-，失去一個(gè)中性碎片C4H8O4得到m/z211.0252[M-H-Gal-C4H8O4]-，或失去一分子葡萄糖得到m/z169.0149 [M-H-Gal-Glu]-，再失去一個(gè)CO2得到m/z125.0251 [M-H-Gal-Glu-CO2]-，結(jié)合文獻(xiàn)[8]推測(cè)該化合物為二沒(méi)食子酰葡萄糖苷digalloylglucose。

③ 鞣花鞣質(zhì)類：共鑒定出9個(gè)鞣花鞣質(zhì)類成分。鞣花鞣質(zhì)是一類含六羥基聯(lián)苯二酸或與其有生源關(guān)系的酚羧酸與多元醇縮合形成的酯，較易失去六羥基二苯甲酰基（HHDP）基團(tuán)、沒(méi)食子酰基，水解后可生成鞣花酸。余甘子中主要含有的與HHDP有生源關(guān)系的酚羧酸?；饕窃X子?；–he）?；衔?27 的保留時(shí)間為16.61 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z633.0743 [M-H]-，擬合分子式為 C27H22O18，脫去一個(gè)沒(méi)食子酸，得到m/z463.0520，該碎片再丟失一分子葡萄糖（glu），得到m/z300.9993 [M-HGal-Glu]-，繼續(xù)失去CO2得到m/z257.0089 [M-HGal-H2O-Glu-CO2]-，再脫去CO得到m/z229.0154[M-H-Gal-H2O-Glu-CO2-CO]-，沒(méi)食子酸自母離子脫去產(chǎn)生特征碎片離子m/z169.0150 [gallic acid]-，結(jié)合文獻(xiàn)[14]推測(cè)其為柯里拉京。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.3.1 活性成分的篩選及靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 將液質(zhì)鑒定出的化合物輸入SwissADME平臺(tái)（http：//www.swissadme.ch/），以胃腸道吸收得分為“high”，類藥性至少通過(guò)2個(gè)“Yes”進(jìn)行篩選，并結(jié)合課題組前期研究[6]余甘子鞣質(zhì)入血成分獲得潛在化合物。共篩選出11種活性成分，分別為鞣花酸、沒(méi)食子酸乙酯、沒(méi)食子酸甲酯、沒(méi)食子酸、柯里拉京、1，4，6-tri-O-galloyl-glucose、3，4，6-tri-O-galloyl-glucose、mucic acid 2-O-gallate、訶子次酸、特里馬蘇I、訶子寧。在SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)不同成分的靶點(diǎn)基因，篩選probability＞0的靶點(diǎn)，得到成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中查找并篩選差異表達(dá)基因，將巨噬細(xì)胞差異靶點(diǎn)基因與20%甲醇洗脫部位相關(guān)成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，取交集作為潛在靶點(diǎn)基因。結(jié)果預(yù)測(cè)得94個(gè)靶點(diǎn)基因。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載編號(hào)為GSE5099的人類基因芯片，通過(guò)GEO2R功能以P＜0.05且|log2FC|＞0.5為標(biāo)準(zhǔn)，篩選去重后得到巨噬細(xì)胞相關(guān)的靶點(diǎn)共5391個(gè)。對(duì)活性成分信息和巨噬細(xì)胞相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到交集靶點(diǎn)37個(gè)，將其視為20%甲醇洗脫部位調(diào)控巨噬細(xì)胞的潛在靶點(diǎn)。

2.3.2 “藥物成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2軟件的“Merge”工具構(gòu)建“藥物成分-潛在靶點(diǎn)-巨噬細(xì)胞”網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖4），共包括49個(gè)節(jié)點(diǎn)，126條邊。根據(jù)度值排序得到主要的活性成分為鞣花酸、沒(méi)食子酸甲酯、1，4，6-tri-O-galloyl-glucose、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸乙酯等；這些成分作用的靶點(diǎn)有高角鯊烯環(huán)氧化酶（SQLE）、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1（PTPN1）、β分泌酶1（BACE1）、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶2（PTPN2）、重組人醛糖還原酶（AKR1B1）等，揭示其或許與余甘子鞣質(zhì)調(diào)控巨噬細(xì)胞的過(guò)程密切相關(guān)。

圖4 20%甲醇洗脫部位調(diào)控巨噬細(xì)胞細(xì)胞的“藥物成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Network of “component-potential target” of 20% methanol eluted part

2.3.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 在 STRING 平臺(tái)（https：//STRING-db.org/）輸入交集靶點(diǎn)，限定物種為“智人”，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用 Cytoscape 3.7.2 軟件，對(duì) PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化操作。結(jié)果見(jiàn)圖5，通過(guò) Network Analyzer 插件分析其拓?fù)鋵W(xué)特征，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)主要為絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、和酪氨酸專一性蛋白激酶（Src）、前列腺素過(guò)氧化物合成酶 2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、糖原合成酶激酶（GSK3B）等。

圖5 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 5 PPI network of potential targets

2.3.4 靶點(diǎn)功能富集分析與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)Sangerbox平臺(tái)（http：//sangerbox.com/）對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并對(duì)排名前 20 的通路進(jìn)行結(jié)果可視化。

對(duì)37個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 功能富集分析（P＜0.05），共獲得 2438個(gè) GO 條目，包括生物過(guò)程（BP）條目 2096個(gè)、細(xì)胞組成（CC）條目 146個(gè)、分子功能（MF）條目 196個(gè)，對(duì)排名前 10 的各類GO條目進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖6A。BP主要涉及對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)、對(duì)化學(xué)刺激的細(xì)胞反應(yīng)等；CC主要涉及囊泡、膜筏、膜微區(qū)等；MF主要涉及一氧化氮合酶活性、酶結(jié)合、激酶結(jié)合等。

圖6 GO富集分析條形圖（A）和KEGG富集分析氣泡圖（B）Fig 6 GO enrichment analysis（A）and KEGG pathways enrichment analysis（B）of potential targets

KEGG富集相關(guān)通路76條（P＜0.05），對(duì)排名前20的通路進(jìn)行可視化展示（見(jiàn)圖6B），包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-kappaB信號(hào)通路等。

3 討論

精氨酸酶-1（Arg-1）和甘露糖受體（CD206）是M2巨噬細(xì)胞的識(shí)別標(biāo)志物。Arg-1與iNOS競(jìng)爭(zhēng)L-精氨酸作為底物，生成膠原蛋白前體L-鳥(niǎo)氨酸，形成促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的纖維化微環(huán)境[15]。此外，Arg-1通過(guò)代謝L-精氨酸直接影響CD8+T細(xì)胞[16]，CD206可通過(guò)抑制CD45磷酸酶活性損害CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性[17]，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。因此，本研究利用M2型RAW264.7細(xì)胞模型篩選出余甘子鞣質(zhì)20%甲醇洗脫部位，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制M2型巨噬細(xì)胞識(shí)別標(biāo)志物Arg-1、CD206的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)M1型標(biāo)志物TNF-α，提升其抗腫瘤免疫活性。

利用UPLC-MS分析20%甲醇洗脫部位定性鑒別出29個(gè)化學(xué)成分，主要為酚酸類化合物和鞣質(zhì)類化合物。進(jìn)一步根據(jù)課題組前期研究[6]和SwissADME平臺(tái)獲得11個(gè)活性成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析?！八幬锍煞?潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中度值靠前的成分分別有沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸、沒(méi)食子酸甲酯、沒(méi)食子酸乙酯等。毛赫新等[18]發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸能夠降低M1型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率，抑制iNOS和IL-1βmRNA表達(dá)水平，抑制IFN-γ/LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1型的極化?？吕锢┛梢酝ㄟ^(guò)抑制IL-13Ralpha1信號(hào)通路抑制M2巨噬細(xì)胞極化[19]。此外，鞣花酸通過(guò)ERK1/2/RSK信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞功能[20]，沒(méi)食子酸甲酯、沒(méi)食子酸乙酯能夠通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞中Akt和ERK1/2活性、ERK1/2/RSK信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[21-22]，但對(duì)于這些成分的研究主要集中在對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用，對(duì)其抗腫瘤免疫的作用卻鮮有報(bào)道。

通過(guò)KEGG富集分析可推斷，20%甲醇洗脫部位調(diào)控巨噬細(xì)胞的信號(hào)通路主要與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān)，例如PI3K/Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。

PI3K/Akt信號(hào)通路上匯集多種胞內(nèi)和胞外信號(hào)，可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的遷移、增殖、自噬、極化、代謝功能和炎癥反應(yīng)[23]。PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成，能夠誘發(fā)其底物磷酸化為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）。Akt是PI3K/Akt通路中調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能的最重要的效應(yīng)分子，Akt2 能促使巨噬細(xì)胞向 M1 型極化[24]；敲除Akt2使miR-155水平降低，C/EBPβ（M2極化的調(diào)節(jié)因子）表達(dá)增加[25]。此外，Akt2缺陷的巨噬細(xì)胞能夠上調(diào)miR-164a導(dǎo)致TLR4信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控，促進(jìn)M2型極化[23]。研究表明，可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-p110蛋白表達(dá)，Akt磷酸化水平，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的作用，從而干預(yù)腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。mTOR是PI3K/Akt的下游信號(hào)，在協(xié)調(diào)代謝和炎癥信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型方面也發(fā)揮作用[27]。

HIF-1信號(hào)通路是生物處于低氧狀態(tài)下的應(yīng)激信號(hào)通路，它由氧調(diào)節(jié)的α亞基和組成型表達(dá)的β亞基組成的異源二聚體。根據(jù)α亞基的不同，又分為 3種亞型，分別是 HIF-1α、HIF-2α和 HIF-3α，其中HIF-1α是介導(dǎo)缺氧信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞[28-29]。當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活后，Akt磷酸化，能夠增強(qiáng)HIF-1α的活性，抑制其蛋白酶體降解[30]。HIF-α亞基可在巨噬細(xì)胞中被差異激活，Th1細(xì)胞因子能夠通過(guò)誘導(dǎo)HIF-1α調(diào)控巨噬細(xì)胞向M1型極化，相反，Th2細(xì)胞因子通過(guò)誘導(dǎo)HIF-2α調(diào)控M2型極化[31]，也有研究表明，通過(guò)作用于HIF-1α和HIF-1β的共有靶點(diǎn)IL-1β能夠影響巨噬細(xì)胞M1型極化和炎癥反應(yīng)[32]。此外，HIF-1通路與細(xì)胞的代謝，尤其是糖酵解水平有關(guān)。LDHA、GLUT1、PDK1等均為HIF-1α的作用靶點(diǎn)。HIF-1α激活會(huì)增加巨噬細(xì)胞的遷移活性并影響巨噬細(xì)胞的代謝功能，巨噬細(xì)胞的代謝改變與其表型和功能密切相關(guān)[28，33]。研究表明，經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)HIF-1α蛋白降解，抑制糖酵解通路，能夠影響M1型巨噬細(xì)胞極化，抑制結(jié)腸炎發(fā)生[34]；抑制M2巨噬細(xì)胞線粒體氧化磷酸化，能夠抑制M2巨噬細(xì)胞極化，增強(qiáng)抗腫瘤效能[35]。

NF-κB信號(hào)通路是PI3K/Akt信號(hào)通路的下游通路之一，是調(diào)節(jié)炎癥因子產(chǎn)生的重要通路。IκB激酶被激活后，誘導(dǎo)NF-κB抑制蛋白磷酸化并降解，激活NF-κB，暴露出核定位序列，與細(xì)胞核內(nèi)特定位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生并釋放細(xì)胞因子[36]。脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化依賴于NF-kBp65的激活[37]。姚靜靜[38]提出通過(guò)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞清道夫受體MSR1、CD36和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78的表達(dá)，能夠影響巨噬細(xì)胞的極化。

本實(shí)驗(yàn)基于M2巨噬細(xì)胞模型篩選的有效部位可能通過(guò)調(diào)控TAMs的免疫抑制活性在抗腫瘤治療中發(fā)揮作用?；?LC-MS 結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了20%甲醇洗脫部位調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制，其分子機(jī)制可能是與PI3K/Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究為后續(xù)深入驗(yàn)證余甘子鞣質(zhì)調(diào)控巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。