陳冰，楊紅，楊惠，陳永鑫，甘詩泉，文波，蔣朝暉，沈祥春*，李悅（1.貴陽市婦幼保健院藥學部，貴陽 55000；.貴州醫(yī)科大學天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴陽 55005；.貴陽市第一人民醫(yī)院檢驗科，貴陽 55000；.濟寧醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，山東 濟寧 7067）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常見且嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是導致糖尿病患者視力障礙和失明的最主要原因[1-3]。

研究表明，DR早期，視網(wǎng)膜Müller細胞（RMCs）功能異常是誘發(fā)DR患者失明的關鍵因素[4]。在DR發(fā)病早期，RMCs 已先于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞、周細胞出現(xiàn)病理改變[5]。

自噬在細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要作用，在病理條件下，自噬功能紊亂可誘導細胞功能障礙，最終誘導包括心肌病、DR等多種疾病的發(fā)生[6]。DR應激下RMCs損傷與自噬障礙密切相關[7]。視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的正常存活依賴于RMCs，深入探討RMCs在DR中的發(fā)病機制，對早期診斷、治療DR具有重大意義。

研究表明，鈣依賴蛋白調(diào)節(jié)激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinases Ⅱ，CaMKⅡ）是治療糖尿病引起的神經(jīng)病變所致視力喪失的潛在靶點，是介導DR的主要因子[8-9]。前期課題組研究證實在糖尿病大鼠或是高糖應激下的RMCs中，CaMKⅡ的磷酸化明顯增加，參與了神經(jīng)元的生理和病理事件[10]。抑制CaMKⅡ的磷酸化可改善血管性癡呆誘導大鼠海馬神經(jīng)元自噬功能障礙[11]。但CaMKⅡ的磷酸化是否介導高糖誘導的RMCs自噬功能障礙尚不明確。

貴州地產(chǎn)民族藥艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜Alpiniazerumbet（Pers.）Burttet Smith的干燥成熟果實，具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧之功效[12-13]。前期課題組研究證實，艷山姜的主要有效成分為揮發(fā)油（essential oil fromFructus Alpiniaezerumbet，EOFAZ）。前期體內(nèi)外研究顯示EOFAZ對DR具有顯著的改善作用[10，13]，但EOFAZ對高糖誘導的RMCs自噬功能障礙的作用以及作用機制尚不明確。本研究以RMCs為研究對象，研究EOFAZ對高糖誘導RMCs自噬功能障礙的保護作用，為臨床防治DR提供實驗基礎。

1 材料

1.1 細胞

大鼠RMCs（上海胤曦生物技術有限公司）。

1.2 試藥

艷山姜采自貴州省貞豐縣，經(jīng)貴州醫(yī)科大學藥學院生藥學與藥用植物學教研室龍慶德副教授鑒定為姜科植物AlpiniazerumbetPers.Burttet Smith的干燥成熟果實（憑證標本號：No.20151018），采用水蒸氣蒸餾法提取EOFAZ，收率為 1.3%。準確稱取EOFAZ，將其溶于適量二甲基亞砜溶液中，配制母液濃度為 1×107μg·L-1，過濾除菌，分裝凍存于-20℃。D-無水葡萄糖（批號為405A0 918）、D-甘露醇（批號為1126F038）（北京索萊寶科技有限公司），LC3抗體（批號為14600-1-AP）、P62抗體（批號為18420-1-AP）、p-CaMKⅡ抗體（批號為#12716）、CaMKⅡ抗體（批號為#3362）（武漢三鷹生物技術有限公司）。Beclin1抗體（Abcam公司，批號為ab207612）。

1.3 儀器

3020-426多功能全波長酶標儀（美國Thermo公司），WAC-60滅菌鍋（韓國DAIHAN Scientific公司），5810R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司），Universal Hood Ⅱ型實時熒光定量PCR系統(tǒng)儀、CFX型凝膠成像系統(tǒng)儀（美國 Bio-Rad 公司），免疫熒光顯微鏡（德國徠卡公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組

RMCs培養(yǎng)于含10% 胎牛血清及1%青鏈雙抗的低糖 DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶中的細胞融合至85%時，按常規(guī)胰酶消化后進行細胞傳代，待細胞融合至70%～80%，即可進行給藥干預。

2.1.1 細胞藥效實驗分組 分為正常對照組（含糖量5.5 mmol·L-1）、甘露醇組（24.5 mmol·L-1）、高糖組（HG，含糖量30 mmol·L-1）、EOFAZ低劑量（0.25 μg·L-1）+HG組、EOFAZ中劑量（0.5 μg·L-1）+HG組、EOFAZ高劑量（1.0 μg·L-1）+HG組、陽性對照羅格列酮（RGZ，20 μmol·L-1）+HG組；RMCs先用不同劑量的EOFAZ或RGZ預處理1 h，再用HG孵育48 h。其中甘露醇組用作HG組的滲透壓對照。

2.1.2 機制作用實驗分組 分為正常對照組（含糖量5.5 mmol·L-1）、高糖組（HG，含糖量30 mmol·L-1）、EOFAZ高劑量（1 μg·L-1）+HG組、BAPT-AM（5 μmol·L-1）或KN93（5 μmol·L-1）或氯喹（CQ）（10 μmol·L-1）+HG組、EOFAZ高劑量（1 μg·L-1）+HG+BAPT-AM或KN93或CQ組。RMCs先用EOFAZ、BAPT-AM、KN93或CQ預處理1 h，再用HG孵育48 h。

2.2 免疫熒光實驗

在六孔板中放入蓋玻片后將細胞接種于板中，在細胞融合至60%時給藥。藥物作用結束后將蓋玻片取出置于PBS中靜置10 min，4%多聚甲醛于室溫固定15 min，0.2% Triton-100 透化10 min，山羊血清封閉30 min，一抗4℃過夜。次日將熒光二抗和DAPI按比例混合在一起后滴加到蓋玻片上避光孵育1 h后，用PBS避光洗3次后，封片。于倒置熒光顯微鏡下采集照片。

2.3 免疫印跡分析

給藥時間末，加入預冷PBS潤洗 3 次，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。用10% SDS-PAGE將蛋白樣品（25 μg）進行電泳分離并將蛋白轉移至PVDF膜。膜用含5% 的BSA的TBST溶液封閉1 h后與所需的一抗在4℃下過夜孵育。第2日，膜用1×TBST洗3次后與二抗室溫孵育1 h。膜洗3次后用ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯色，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行曝光，用Image-Lab軟件對數(shù)字圖像進行量化。實驗獨立重復3次。

2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用RNA提取試劑盒從RMCs中提取總RNA。mRNA被逆轉錄成cDNA，cDNA使用SYBR Green PCR試劑擴增。使用循環(huán)閾值法（2-ΔΔCt）進行分析。

2.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)均是從3個及以上獨立的實驗中獲得，所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7.0（La Jolla，CA，USA）軟件進行分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 EOFAZ對高糖誘導RMCs自噬功能障礙的影響

免疫印跡分析、qRT-PCR分別分析P62、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白及 P62、Beclin1 mRNA表達，結果見圖1。與正常對照組比較，高糖孵育RMCs 48 h后，細胞中自噬信號中Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白及 P62、Beclin1 mRNA水平降低。EOFAZ預處理后可上調(diào)以上蛋白及 mRNA的表達水平。

圖1 EOFAZ對高糖誘導RMCs自噬功能障礙的影響Fig 1 Effect of EOFAZ on high glucose-induced autophagy dysfunction in RMCs

3.2 EOFAZ對高糖誘導RMCs中LC3、P62蛋白表達的影響

為了進一步研究EOFAZ對高糖誘導RMCs自噬功能障礙的影響，采用免疫熒光實驗分析LC3、P62蛋白表達，結果見圖2，與免疫印跡分析結果一致。EOFAZ可明顯上調(diào)LC3水平，上調(diào)P62蛋白的表達水平，提示EOFAZ可明顯改善高糖誘導的RMCs自噬功能障礙。

圖2 EOFAZ對高糖誘導RMCs中LC3、P62蛋白表達的影響（×400）Fig 2 Effect of EOFAZ on the expression of LC3 and P62 protein in RMCs induced by high glucose（×400）

3.3 EOFAZ調(diào)控CaMKⅡ信號改善高糖誘導RMCs自噬功能障礙

前期課題組研究顯示，在高糖應激下，RMCs中CaMKⅡ的磷酸化水平明顯增加，抑制CaMKⅡ的磷酸化可改善血管性癡呆誘導大鼠海馬神經(jīng)元自噬功能障礙[11]。但CaMKⅡ的磷酸化是否介導HG誘導的RMCs自噬功能障礙尚不明確。為了研究CaMKⅡ的磷酸化是否介導HG誘導的RMCs自噬功能障礙，使用鈣螯合劑（BAPTA-AM）及CaMKⅡ特異性抑制劑（KN93）進行實驗。結果如圖3所示，與EOFAZ的作用類似，使用BAPTA-AM及KN93作用細胞可明顯上調(diào)Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62的表達水平。同時觀察到EOFAZ與BAPTA-AM或KN93聯(lián)合應用后，與EOFAZ單獨孵育組無明顯差異。

圖3 EOFAZ對高糖誘導的RMCs自噬功能障礙的影響Fig 3 Effect of EOFAZ on ameliorated autophagy dysfunction induced by HG in RMCs

使用自噬抑制劑CQ孵育細胞，檢測細胞中CaMKⅡ磷酸化水平及自噬信號Beclin1、LC3、P62蛋白的表達。結果如圖3C所示，使用CQ可進一步抑制自噬，但對CaMKⅡ的磷酸化水平無明顯影響。提示EOFAZ對高糖誘導的RMCs自噬功能障礙具有明顯的改善作用，其作用可能與抑制CaMKⅡ信號相關。

4 討論

DR是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，是成人視力喪失的主要原因。糖尿病中的RMCs損傷被認為是導致DR致病的主要因素，靶向RMCs損傷是預防早期DR的治療策略[14]。

自噬是一種細胞內(nèi)自我降解過程，負責去除、降解和回收細胞質蛋白和細胞器，涉及一系列連續(xù)的事件，Beclin1介導自噬的起始，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化參與自噬溶酶體膜的延伸直至自噬溶酶體的形成，P62與LC3Ⅱ蛋白結合形成復合物，并最終在溶酶體內(nèi)降解。自噬在維持視網(wǎng)膜功能方面起著重要作用[15]。自噬功能障礙加速了RMCs損傷，自噬抑制DR的形成[6，14]。RMCs自噬異常在 DR 的發(fā)病機制及病程進展中起著關鍵作用。改善RMCs自噬功能障礙成為防治DR的研究焦點。本研究以自噬為切入點，以民族藥活性成分EOFAZ為研究對象。在體外建立高糖誘導RMCs自噬功能障礙模型，探索EOFAZ的保護作用及其對自噬的調(diào)控作用。結果顯示高糖作用后，細胞中Beclin1、P62表達水平顯著降低，LC3Ⅱ/Ⅰ水平降低，提示RMCs自噬功能障礙，EOFAZ預處理可明顯改善以上蛋白的異常表達。

前期課題組研究顯示，在糖尿病應激作用下，RMCs中CaMKⅡ的磷酸化水平明顯增加[10]，抑制CaMKⅡ的磷酸化可改善血管性癡呆誘導大鼠海馬神經(jīng)元自噬功能障礙[11]。但CaMKⅡ的磷酸化在高糖誘導的RMCs自噬功能障礙中的作用尚不明確。為了研究CaMKⅡ的磷酸化與自噬之間的關系，采用鈣螯合劑（BAPTA-AM）及CaMKⅡ特異性抑制劑（KN93）進行實驗。結果表明，BAPTA-AM及KN93作用細胞后，可明顯改善高糖誘導的RMCs自噬障礙。同時觀察到兩者分別與EOFAZ聯(lián)合應用后，與單獨的EOFAZ孵育組無明顯差異。提示EOFAZ可能是通過調(diào)控CaMKⅡ信號改善高糖誘導的RMCs自噬功能障礙。為了進一步證實該結論，使用自噬抑制劑CQ孵育細胞，分析CaMKⅡ磷酸化水平及自噬信號蛋白的表達。結果如圖3所示，CQ可進一步抑制自噬，但對CaMKⅡ的磷酸化水平無明顯影響。

綜上所述，EOFAZ對高糖誘導的RMCs自噬功能障礙具有明顯改善作用，其作用與調(diào)控CaMKⅡ信號相關，本研究為后期進一步研究EOFAZ改善糖尿病相關并發(fā)癥提供實驗依據(jù)，為民族藥艷山姜防治糖尿病開拓新的理論指導與實驗基礎。