陳冰，楊紅，楊惠，陳永鑫，甘詩泉，文波，蔣朝暉，沈祥春*，李悅（1.貴陽市婦幼保健院藥學(xué)部，貴陽 55000；.貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴陽 55005；.貴陽市第一人民醫(yī)院檢驗科，貴陽 55000；.濟寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟寧 7067）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常見且嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者視力障礙和失明的最主要原因[1-3]。

研究表明，DR早期，視網(wǎng)膜Müller細胞（RMCs）功能異常是誘發(fā)DR患者失明的關(guān)鍵因素[4]。在DR發(fā)病早期，RMCs 已先于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞、周細胞出現(xiàn)病理改變[5]。

自噬在細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要作用，在病理條件下，自噬功能紊亂可誘導(dǎo)細胞功能障礙，最終誘導(dǎo)包括心肌病、DR等多種疾病的發(fā)生[6]。DR應(yīng)激下RMCs損傷與自噬障礙密切相關(guān)[7]。視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的正常存活依賴于RMCs，深入探討RMCs在DR中的發(fā)病機制，對早期診斷、治療DR具有重大意義。

研究表明，鈣依賴蛋白調(diào)節(jié)激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinases Ⅱ，CaMKⅡ）是治療糖尿病引起的神經(jīng)病變所致視力喪失的潛在靶點，是介導(dǎo)DR的主要因子[8-9]。前期課題組研究證實在糖尿病大鼠或是高糖應(yīng)激下的RMCs中，CaMKⅡ的磷酸化明顯增加，參與了神經(jīng)元的生理和病理事件[10]。抑制CaMKⅡ的磷酸化可改善血管性癡呆誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元自噬功能障礙[11]。但CaMKⅡ的磷酸化是否介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙尚不明確。

貴州地產(chǎn)民族藥艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜Alpiniazerumbet（Pers.）Burttet Smith的干燥成熟果實，具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧之功效[12-13]。前期課題組研究證實，艷山姜的主要有效成分為揮發(fā)油（essential oil fromFructus Alpiniaezerumbet，EOFAZ）。前期體內(nèi)外研究顯示EOFAZ對DR具有顯著的改善作用[10，13]，但EOFAZ對高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙的作用以及作用機制尚不明確。本研究以RMCs為研究對象，研究EOFAZ對高糖誘導(dǎo)RMCs自噬功能障礙的保護作用，為臨床防治DR提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細胞

大鼠RMCs（上海胤曦生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

艷山姜采自貴州省貞豐縣，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為姜科植物AlpiniazerumbetPers.Burttet Smith的干燥成熟果實（憑證標本號：No.20151018），采用水蒸氣蒸餾法提取EOFAZ，收率為 1.3%。準確稱取EOFAZ，將其溶于適量二甲基亞砜溶液中，配制母液濃度為 1×107μg·L-1，過濾除菌，分裝凍存于-20℃。D-無水葡萄糖（批號為405A0 918）、D-甘露醇（批號為1126F038）（北京索萊寶科技有限公司），LC3抗體（批號為14600-1-AP）、P62抗體（批號為18420-1-AP）、p-CaMKⅡ抗體（批號為#12716）、CaMKⅡ抗體（批號為#3362）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。Beclin1抗體（Abcam公司，批號為ab207612）。

1.3 儀器

3020-426多功能全波長酶標儀（美國Thermo公司），WAC-60滅菌鍋（韓國DAIHAN Scientific公司），5810R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司），Universal Hood Ⅱ型實時熒光定量PCR系統(tǒng)儀、CFX型凝膠成像系統(tǒng)儀（美國 Bio-Rad 公司），免疫熒光顯微鏡（德國徠卡公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組

RMCs培養(yǎng)于含10% 胎牛血清及1%青鏈雙抗的低糖 DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶中的細胞融合至85%時，按常規(guī)胰酶消化后進行細胞傳代，待細胞融合至70%～80%，即可進行給藥干預(yù)。

2.1.1 細胞藥效實驗分組 分為正常對照組（含糖量5.5 mmol·L-1）、甘露醇組（24.5 mmol·L-1）、高糖組（HG，含糖量30 mmol·L-1）、EOFAZ低劑量（0.25 μg·L-1）+HG組、EOFAZ中劑量（0.5 μg·L-1）+HG組、EOFAZ高劑量（1.0 μg·L-1）+HG組、陽性對照羅格列酮（RGZ，20 μmol·L-1）+HG組；RMCs先用不同劑量的EOFAZ或RGZ預(yù)處理1 h，再用HG孵育48 h。其中甘露醇組用作HG組的滲透壓對照。

2.1.2 機制作用實驗分組 分為正常對照組（含糖量5.5 mmol·L-1）、高糖組（HG，含糖量30 mmol·L-1）、EOFAZ高劑量（1 μg·L-1）+HG組、BAPT-AM（5 μmol·L-1）或KN93（5 μmol·L-1）或氯喹（CQ）（10 μmol·L-1）+HG組、EOFAZ高劑量（1 μg·L-1）+HG+BAPT-AM或KN93或CQ組。RMCs先用EOFAZ、BAPT-AM、KN93或CQ預(yù)處理1 h，再用HG孵育48 h。

2.2 免疫熒光實驗

在六孔板中放入蓋玻片后將細胞接種于板中，在細胞融合至60%時給藥。藥物作用結(jié)束后將蓋玻片取出置于PBS中靜置10 min，4%多聚甲醛于室溫固定15 min，0.2% Triton-100 透化10 min，山羊血清封閉30 min，一抗4℃過夜。次日將熒光二抗和DAPI按比例混合在一起后滴加到蓋玻片上避光孵育1 h后，用PBS避光洗3次后，封片。于倒置熒光顯微鏡下采集照片。

2.3 免疫印跡分析

給藥時間末，加入預(yù)冷PBS潤洗 3 次，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。用10% SDS-PAGE將蛋白樣品（25 μg）進行電泳分離并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜用含5% 的BSA的TBST溶液封閉1 h后與所需的一抗在4℃下過夜孵育。第2日，膜用1×TBST洗3次后與二抗室溫孵育1 h。膜洗3次后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進行顯色，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行曝光，用Image-Lab軟件對數(shù)字圖像進行量化。實驗獨立重復(fù)3次。

2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用RNA提取試劑盒從RMCs中提取總RNA。mRNA被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA使用SYBR Green PCR試劑擴增。使用循環(huán)閾值法（2-ΔΔCt）進行分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均是從3個及以上獨立的實驗中獲得，所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 7.0（La Jolla，CA，USA）軟件進行分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 EOFAZ對高糖誘導(dǎo)RMCs自噬功能障礙的影響

免疫印跡分析、qRT-PCR分別分析P62、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白及 P62、Beclin1 mRNA表達，結(jié)果見圖1。與正常對照組比較，高糖孵育RMCs 48 h后，細胞中自噬信號中Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白及 P62、Beclin1 mRNA水平降低。EOFAZ預(yù)處理后可上調(diào)以上蛋白及 mRNA的表達水平。

圖1 EOFAZ對高糖誘導(dǎo)RMCs自噬功能障礙的影響Fig 1 Effect of EOFAZ on high glucose-induced autophagy dysfunction in RMCs

3.2 EOFAZ對高糖誘導(dǎo)RMCs中LC3、P62蛋白表達的影響

為了進一步研究EOFAZ對高糖誘導(dǎo)RMCs自噬功能障礙的影響，采用免疫熒光實驗分析LC3、P62蛋白表達，結(jié)果見圖2，與免疫印跡分析結(jié)果一致。EOFAZ可明顯上調(diào)LC3水平，上調(diào)P62蛋白的表達水平，提示EOFAZ可明顯改善高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙。

圖2 EOFAZ對高糖誘導(dǎo)RMCs中LC3、P62蛋白表達的影響（×400）Fig 2 Effect of EOFAZ on the expression of LC3 and P62 protein in RMCs induced by high glucose（×400）

3.3 EOFAZ調(diào)控CaMKⅡ信號改善高糖誘導(dǎo)RMCs自噬功能障礙

前期課題組研究顯示，在高糖應(yīng)激下，RMCs中CaMKⅡ的磷酸化水平明顯增加，抑制CaMKⅡ的磷酸化可改善血管性癡呆誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元自噬功能障礙[11]。但CaMKⅡ的磷酸化是否介導(dǎo)HG誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙尚不明確。為了研究CaMKⅡ的磷酸化是否介導(dǎo)HG誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙，使用鈣螯合劑（BAPTA-AM）及CaMKⅡ特異性抑制劑（KN93）進行實驗。結(jié)果如圖3所示，與EOFAZ的作用類似，使用BAPTA-AM及KN93作用細胞可明顯上調(diào)Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62的表達水平。同時觀察到EOFAZ與BAPTA-AM或KN93聯(lián)合應(yīng)用后，與EOFAZ單獨孵育組無明顯差異。

圖3 EOFAZ對高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙的影響Fig 3 Effect of EOFAZ on ameliorated autophagy dysfunction induced by HG in RMCs

使用自噬抑制劑CQ孵育細胞，檢測細胞中CaMKⅡ磷酸化水平及自噬信號Beclin1、LC3、P62蛋白的表達。結(jié)果如圖3C所示，使用CQ可進一步抑制自噬，但對CaMKⅡ的磷酸化水平無明顯影響。提示EOFAZ對高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙具有明顯的改善作用，其作用可能與抑制CaMKⅡ信號相關(guān)。

4 討論

DR是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，是成人視力喪失的主要原因。糖尿病中的RMCs損傷被認為是導(dǎo)致DR致病的主要因素，靶向RMCs損傷是預(yù)防早期DR的治療策略[14]。

自噬是一種細胞內(nèi)自我降解過程，負責去除、降解和回收細胞質(zhì)蛋白和細胞器，涉及一系列連續(xù)的事件，Beclin1介導(dǎo)自噬的起始，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化參與自噬溶酶體膜的延伸直至自噬溶酶體的形成，P62與LC3Ⅱ蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并最終在溶酶體內(nèi)降解。自噬在維持視網(wǎng)膜功能方面起著重要作用[15]。自噬功能障礙加速了RMCs損傷，自噬抑制DR的形成[6，14]。RMCs自噬異常在 DR 的發(fā)病機制及病程進展中起著關(guān)鍵作用。改善RMCs自噬功能障礙成為防治DR的研究焦點。本研究以自噬為切入點，以民族藥活性成分EOFAZ為研究對象。在體外建立高糖誘導(dǎo)RMCs自噬功能障礙模型，探索EOFAZ的保護作用及其對自噬的調(diào)控作用。結(jié)果顯示高糖作用后，細胞中Beclin1、P62表達水平顯著降低，LC3Ⅱ/Ⅰ水平降低，提示RMCs自噬功能障礙，EOFAZ預(yù)處理可明顯改善以上蛋白的異常表達。

前期課題組研究顯示，在糖尿病應(yīng)激作用下，RMCs中CaMKⅡ的磷酸化水平明顯增加[10]，抑制CaMKⅡ的磷酸化可改善血管性癡呆誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元自噬功能障礙[11]。但CaMKⅡ的磷酸化在高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙中的作用尚不明確。為了研究CaMKⅡ的磷酸化與自噬之間的關(guān)系，采用鈣螯合劑（BAPTA-AM）及CaMKⅡ特異性抑制劑（KN93）進行實驗。結(jié)果表明，BAPTA-AM及KN93作用細胞后，可明顯改善高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬障礙。同時觀察到兩者分別與EOFAZ聯(lián)合應(yīng)用后，與單獨的EOFAZ孵育組無明顯差異。提示EOFAZ可能是通過調(diào)控CaMKⅡ信號改善高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙。為了進一步證實該結(jié)論，使用自噬抑制劑CQ孵育細胞，分析CaMKⅡ磷酸化水平及自噬信號蛋白的表達。結(jié)果如圖3所示，CQ可進一步抑制自噬，但對CaMKⅡ的磷酸化水平無明顯影響。

綜上所述，EOFAZ對高糖誘導(dǎo)的RMCs自噬功能障礙具有明顯改善作用，其作用與調(diào)控CaMKⅡ信號相關(guān)，本研究為后期進一步研究EOFAZ改善糖尿病相關(guān)并發(fā)癥提供實驗依據(jù)，為民族藥艷山姜防治糖尿病開拓新的理論指導(dǎo)與實驗基礎(chǔ)。