郭凈芳, 劉麗莉, 程偉偉, 徐寶成, 張瀟丹, 于 影

河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 食品加工與安全國家級教學(xué)示范中心, 食品加工與質(zhì)量安全控制

河南省國際聯(lián)合實驗室, 功能食品資源研究與利用河南省教育廳科技創(chuàng)新團隊, 河南 洛陽 471023

引 言

豬血是畜產(chǎn)品屠宰加工處理過程中的主要副產(chǎn)物之一, 營養(yǎng)物質(zhì)豐富。 豬血紅蛋白(porcine hemoglobin, PHb)作為血液中的一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)組分, 具有優(yōu)良的特性, 常被應(yīng)用于食品工業(yè)、 生物化學(xué)以及醫(yī)藥等領(lǐng)域, 可以改善或賦予食品在制備、 處理及保藏環(huán)節(jié)過程中的品質(zhì)[1]。 據(jù)報道, 血紅蛋白可以用作乳化劑使用, 當添加到火腿、 灌腸等肉糜食品中時, 能夠起到改善食品的質(zhì)構(gòu)、 外觀及保質(zhì)期等作用[2]。 但PHb因具有較重的血腥味, 較大的黏度, 且蛋白質(zhì)的性質(zhì)易受外界條件的影響而變得不穩(wěn)定, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性, 從而影響蛋白質(zhì)的功能特性, 致使其在食品中的加工和應(yīng)用方面受到一定限制。

在食品工業(yè)中, 蛋白質(zhì)的糖基化修飾由于其溫和、 安全的特點成為一種有前景的蛋白質(zhì)修飾方法[3]。 糖基化處理能夠使蛋白質(zhì)的一些物理或化學(xué)性質(zhì)得到改善, 如對于外界條件變化的穩(wěn)定性, 防止蛋白質(zhì)變性或相互聚集。 劉騫等[4]的研究表明豬血漿蛋白肽經(jīng)糖基化處理后, 其乳化活性、 溶解特性以及起泡性能等都有了較為顯著的改善。 Zhan等[5]研究表明豬血紅蛋白經(jīng)殼聚糖糖基化處理后, 可以使豬血紅蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 抗氧化和補鐵作用增強。 由此可見, 糖基化處理是提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及功能特性的一種手段。

氧化作用是蛋白質(zhì)發(fā)生變性的一個重要因素, 不僅能使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞, 甚至還會影響和改變其功能特性, 從而致使產(chǎn)品的風(fēng)味、 色澤以及質(zhì)地等品質(zhì)發(fā)生改變, 威脅人體健康。 多酚類物質(zhì)能夠有效清除自由基, 降低蛋白質(zhì)氧化程度, 且因其為天然物質(zhì), 具有安全、 高效的特點而受到大量食品研究相關(guān)人員的關(guān)注[6]。 有研究表明, 蛋白質(zhì)與多酚的復(fù)合是修飾蛋白質(zhì)功能的有效途徑, 蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用可以改善蛋白質(zhì)的功能特性[7]。 黃子林等[8]研究發(fā)現(xiàn)在堿性條件下核桃衣多酚與核桃蛋白、 小麥面筋蛋白和芝麻蛋白等相互作用, 能夠有效提升蛋白質(zhì)的溶解性和抗氧化性。 張春雪等[9]研究了白藜蘆醇、 沒食子酸以及兒茶素等多酚類物質(zhì)與核桃蛋白之間的相互作用, 結(jié)果表明多酚類物質(zhì)可顯著改善核桃蛋白的起泡性能以及熱穩(wěn)定性等。

目前多以單一的糖基化改性或兒茶素與蛋白質(zhì)復(fù)合的研究居多, 然而關(guān)于糖基化處理與兒茶素結(jié)合改性蛋白質(zhì)的研究卻少有報道。 本文選用葡萄糖對PHb進行糖基化修飾, 再與兒茶素復(fù)合制備復(fù)合物(catechin complex glycosylated porcine hemoglobin, CG-PHb), 探究CG-PHb特性及結(jié)構(gòu)的變化, 以期為蛋白質(zhì)改性的研究提供新思路, 為復(fù)合物在食品加工過程中的性質(zhì)變化提供理論基礎(chǔ)及參考。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

PHb(BR), 含量(以N計): ≥15.0%, 購買自南京都萊生物技術(shù)有限公司; 葡萄糖(分析純, AR), 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn); 兒茶素(純度: ≥98.0%), 由合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器

UV-2600型紫外可見分光光度計, 日本日立公司; Cary eclpise熒光分光光度計, 美國Aglient Cary elipse公司; VERTEX70型傅里葉紅外光譜儀, 德國Bruker公司; EM-30Plus型電子掃描顯微鏡, 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 糖基化豬血紅蛋白(G-PHb)的制備

將PHb溶于適量蒸餾水中配制成3 mg·mL-1的蛋白質(zhì)溶液, 按質(zhì)量比1∶3的比例加入葡萄糖均勻混合, 調(diào)pH至8.0左右, 在70℃條件下水浴加熱2 h, 取出后立即冰浴, 于4 ℃透析24 h, 冷凍干燥即為糖基化豬血紅蛋白(glycosylated porcine hemoglobin, G-PHb)。

1.3.2 CG-PHb的制備

將0.05 g的兒茶素與G-PHb溶于去離子水中, 按比例1∶1混合, 并將混合物溶液在室溫條件下放置于磁力攪拌器上以500 r·min-1的轉(zhuǎn)速攪拌3 h, 然后于4℃透析24 h。 冷凍干燥48 h, 制得復(fù)合物微粒。

1.3.3 CG-PHb的功能特性測定

1.3.3.1 溶解度的測定

參照Nishimura等[10]的方法, 采用雙縮脲法并稍作修改。 將PHb、 G-PHb和CG-PHb溶于去離子水中, 配制成1.5 mg·mL-1的溶液。 計算上清液中的蛋白質(zhì)含量以及總蛋白質(zhì)的含量, 其比值表示溶解度的大小。

1.3.3.2 濁度的測定

參照Sabow等[11]的方法并稍作修改, 對溶液濁度進行測定。 將PHb、 G-PHb和CG-PHb用pH 8.2的Tris-HCl緩沖液稀釋到2.5 mg·mL-1, 用漩渦振蕩器混合均勻2 min, 使其充分溶解, 30 min后于340 nm處比色, 測吸光度。

1.3.3.3 乳化性能的測定

根據(jù)Wang等[12]的方法略作修改。 分別取2.5 mg·mL-1的PHb、 G-PHb和CG-PHb溶液與大豆油(V/V為3∶1)均勻混合, 在10 000 r·min-1條件下均質(zhì)2 min, 制得新鮮乳化液, 于500 nm處比色, 測定其乳化活性。

1.3.3.4 表面疏水性的測定

采用溴酚藍法測定PHb、 G-PHb和CG-PHb的表面疏水性, 于595 nm波長處比色, 表面疏水性以溴酚藍結(jié)合量來表示。

1.3.3.5 DPPH自由基清除能力的測定

分別移取200 μL濃度為0.1、 0.2、 0.8、 1.2、 1.6 mg·mL-1的PHb、 G-PHb和CG-PHb與等體積的DPPH-乙醇(濃度為0.1 mmol·L-1)至酶標板(96孔)中, 黑暗條件下靜置30 min, 于517 nm處比色。

式中:A0為200 μL DPPH-乙醇+200 μL水, 將A0中的200 μL水替換為200 μL樣品測得A1; 將A1中的200 μL DPPH-乙醇替換為200 μL無水乙醇測得A2。

1.3.4 CG-PHb的結(jié)構(gòu)測定

1.3.4.1 紫外-可見光譜

在250～600 nm范圍內(nèi)對0.5 mg·mL-1的PHb、 G-PHb以及制備的CG-PHb溶液進行紫外可見光譜掃描, 掃描間隔為5 nm。

1.3.4.2 熒光光譜

分別測定PHb、 G-PHb和CG-PHb在激發(fā)波長(280 nm), 激發(fā)和發(fā)射狹縫(10 nm), 掃描范圍(300～400 nm)條件下的熒光光譜。

1.3.4.3 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)

將PHb、 G-PHb和CG-PHb分別與干燥后的溴化鉀粉末按照1∶100(W/W)混勻研細后進行壓片, 然后進行紅外掃描分析。 用Peak Fit v4.12軟件分析PHb、 G-PHb和CG-PHb酰胺I帶處的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量變化。

1.3.4.4 掃描電子顯微鏡(SEM)

分別取微量PHb、 G-PHb和CG-PHb置于樣品臺的導(dǎo)電膠上, 噴10 nm厚度的金。 通過掃描電子顯微鏡進行樣品微觀結(jié)構(gòu)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0軟件對測得的數(shù)據(jù)進行處理及作圖。 通過SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析,p<0.05為差異顯著。 每次試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶解度、 濁度、 乳化性及乳化穩(wěn)定性分析

表1為PHb、 G-PHb和CG-PHb的功能特性測定結(jié)果。 由表1可以看出, CG-PHb相較于PHb溶解度升高了2.86%(p<0.05), 但相較于G-PHb溶解度降低了3.75%(p<0.05), 分析認為可能是G-PHb與兒茶素分子之間形成氫鍵, 疏水作用增大造成的。 粒子粒徑的大小、 溶液顏色的深淺都能影響濁度的大小, 溶液中顆粒越大、 數(shù)量越多、 顏色越深, 濁度越大, 樣品溶液濁度的大小為: CG-PHb

表1 不同處理方式PHb功能特性的變化

2.2 表面疏水性分析

表面疏水性可以反映出蛋白質(zhì)分子的變性程度和暴露在極性溶液中的疏水性氨基酸數(shù)量, PHb、 G-PHb和CG-PHb的表面疏水性變化情況如圖1所示。

圖1 不同處理方式對PHb的表面疏水性影響

由圖1可知, 經(jīng)過糖基化處理和糖基化后與兒茶素復(fù)合的PHb表面疏水性顯著提高(p<0.05), 其中CG-PHb的表面疏水性最高, 為156.69%, 相較于PHb和G-PHb的表面疏水性分別增大了77.83%和50.03%(p<0.05)。 這表明CG-PHb經(jīng)糖基化反應(yīng)后, 蛋白質(zhì)內(nèi)部折疊的結(jié)構(gòu)舒展開來, 致使隱藏的疏水基團暴露增多[15]。 當添加兒茶素時, 蛋白質(zhì)氨基酸的側(cè)鏈通過氫鍵等各種弱作用力與兒茶素的芳香環(huán)之間形成了相互作用, 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變, 一定程度上促進了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開, 分子表面的疏水性殘基暴露量升高, 從而使CG-PHb的表面疏水性增大[16]。

2.3 DPPH自由基清除能力分析

DPPH清除率可以衡量一種物質(zhì)在體外抗氧化能力的大小。 PHb、 G-PHb以及制備的CG-PHb的DPPH自由基清除能力變化如圖2所示。

圖2 不同處理方式對PHb的DPPH自由基清除能力的影響

DPPH自由基由于其具有較高的穩(wěn)定性, 而廣泛地用其清除能力作為衡量物質(zhì)對不穩(wěn)定H原子轉(zhuǎn)移為自由基的抗氧化能力大小的指標。 517 nm處的吸光度變化可以用于評價物質(zhì)的自由基清除率, DPPH自由基可以與環(huán)境中的抗氧化劑所提供的氫供體反應(yīng), 使其在517 nm處的吸光度變小[17]。 由圖2可知, 經(jīng)過糖基化處理和糖基化后與兒茶素復(fù)合的PHb的DPPH自由基清除能力明顯提高(p<0.05), 其抗氧化活性順序為CG-PHb>PHb>G-PHb, 存在顯著性差異(p<0.05)。 隨著濃度的增加, 三者的DPPH自由基清除能力都在不斷增加, PHb、 G-PHb和CG-PHb的DPPH自由基清除率在溶液濃度為1.60 mg·mL-1時達到最高, 分別為69.41%、 46.55%和93.60%(p<0.05)。 與PHb、 G-PHb相比, CG-PHb具有更高的DPPH清除率, 分析認為兒茶素中的多個酚羥基被氧化, 形成相應(yīng)的O-醌類, 可以提供氫原子與DPPH自由基結(jié)合, 形成穩(wěn)定DPPH-H分子以清除DPPH自由基[18]。

2.4 紫外-可見光譜分析

紫外-可見光譜可通過峰強度及峰位的變化來反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。

由圖3可知, 蛋白質(zhì)在280nm處紫外吸收高低順序依次為: CG-PHb>PHb>G-PHb。 糖基化改性后, G-PHb在280 nm處的吸收峰明顯降低, 且發(fā)生藍移, 400 nm波長附近的吸收峰降低, 這表明蛋白質(zhì)大分子中的疏水氨基酸殘基所處的微環(huán)境被改變, 色氨酸、 酪氨酸等生色基團殘基暴露出來, 造成G-PHb的紫外吸收減弱, 蛋白質(zhì)內(nèi)部展開的多肽鏈與葡萄糖之間形成共軛鍵, 致使其電子軌道能級升高, 所帶的雜環(huán)π→π*發(fā)生電子躍遷所需能量變大, 導(dǎo)致吸收帶藍移。 這與張玥等人的研究結(jié)果一致[19]。 與兒茶素復(fù)合后, CG-PHb的紫外吸收光譜峰值增大、 峰形變寬, 最大吸收峰波長從288.5 nm紅移至292 nm, 說明CG-PHb的構(gòu)象發(fā)生了改變。 分析認為由于G-PHb與兒茶素形成了復(fù)合物, 兩者之間相互作用, 致使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加舒展, 有助于蛋白質(zhì)釋放出分子內(nèi)部的發(fā)色基團殘基中的芳香雜環(huán), 進而使其紫外吸收強度增加。 結(jié)合位點附近發(fā)色基團所處微環(huán)境發(fā)生變化, 由極性向非極性轉(zhuǎn)變, 表面疏水性增大, 王啟明等研究結(jié)果也證實了這一點[20]。

圖3 不同處理方式的蛋白樣品的紫外-可見光譜分析

2.5 熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中色氨酸等發(fā)色團結(jié)構(gòu)與自身所處微環(huán)境的極性變化聯(lián)系緊密, PHb、 G-PHb和CG-PHb的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化可通過考察其熒光強度的變化來研究。

由圖4可知, PHb、 G-PHb以及CG-PHb的熒光峰對應(yīng)的λmax分別為310.21、 316.65和343.14 nm, 發(fā)生紅移現(xiàn)象, 且熒光強度大小為CG-PHb>PHb>G-PHb。 發(fā)射峰發(fā)生位移的原因可能是由于糖基化處理后與兒茶素復(fù)合, 從而使血紅蛋白分子的空間構(gòu)象產(chǎn)生改變。 相較于未經(jīng)改性的PHb, G-PHb的熒光強度明顯減弱, 這可能是由于葡萄糖吸附在PHb的表面, 糖鏈在色氨酸殘基附近形成結(jié)合位點, 導(dǎo)致PHb中的色氨酸熒光被屏蔽而展現(xiàn)受阻。 Spotti等[21]的研究結(jié)果表明乳清蛋白與葡聚糖共價復(fù)合后, 其復(fù)合物中的發(fā)色基團殘基也容易被周圍區(qū)域的糖鏈所屏蔽, 這與本文研究結(jié)果相一致。 與兒茶素復(fù)合后, CG-PHb的熒光強度增大, 分析認為兒茶素的加入使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)遭到破壞, 結(jié)構(gòu)變得更加松散, 大量色氨酸暴露在溶劑中導(dǎo)致的。

圖4 不同處理方式的蛋白樣品的熒光光譜分析

兒茶素在與G-PHb的結(jié)合過程中降低了蛋白質(zhì)分子中發(fā)射熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率, 使得其熒光強度降低, 產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象。 圖5顯示了不同質(zhì)量濃度的兒茶素與G-PHb結(jié)合的熒光光譜圖。 由圖5可知, 隨著兒茶素濃度的增加, G-PHb在318 nm波長處的熒光強度逐漸降低, 發(fā)生熒光猝滅, 且熒光猝滅效果呈現(xiàn)增強趨勢, 并發(fā)生紅移現(xiàn)象。 這表明兒茶素與G-PHb之間產(chǎn)生了相互作用, 可能是由于G-PHb與兒茶素之間發(fā)生熒光猝滅, 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)舒展, 同時兒茶素的芳香環(huán)可與G-PHb的酪氨酸殘基結(jié)合, 芳香族氨基酸殘基微環(huán)境的疏水性降低, 致使G-PHb的內(nèi)源熒光猝滅, 在這種相互作用的促進下形成了熒光強度較低的復(fù)合物, 具體的結(jié)合特點及結(jié)合形式等作用機理將在后續(xù)試驗中進一步研究。

圖5 兒茶素對G-PHb熒光光譜的影響G-PHb的質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1; 1—5兒茶素的濃度分別為0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5 mg·mL-1

2.6 FTIR分析

FTIR光譜通常用于表征化學(xué)鍵和官能團, 因此可以根據(jù)紅外光譜圖分析PHb、 G-PHb和CG-PHb的結(jié)構(gòu)變化。

圖6 不同處理方式下PHb的FTIR光譜圖

一般而言, α-螺旋和β-折疊都是依靠氫鍵維持, 通過不同的處理方法可能會改變蛋白質(zhì)分子鏈中氫鍵的生成或斷裂,從而會改變α-螺旋和β-折疊的相對含量。 基于PHb的FTIR光譜, 在酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)區(qū)域分析改性對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響, 樣品紅外光譜擬合的二級結(jié)構(gòu)含量如表2所示。

表2 不同處理方式下PHb酰胺Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)相對含量

由表2可知, CG-PHb的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化, 其中β-折疊含量顯著增加, β-折疊的形成多與分子間氫鍵的作用相關(guān)。 相比于PHb和G-PHb, 分別增加了37.97%和35.48%(p<0.05), 分析認為兒茶素酚羥基與蛋白質(zhì)肽羰基之間形成了氫鍵, 說明兒茶素與G-PHb的結(jié)合方式主要是分子間的氫鍵作用力。 無規(guī)卷曲等其他結(jié)構(gòu)含量顯著減少(p<0.05), 說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的隨機性減弱, 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。 Li等[22]研究結(jié)果表明, 花青素與水稻蛋白相互作用改變了其二級結(jié)構(gòu), 致使其β-折疊的含量增加, 這與本研究結(jié)果一致。

2.7 SEM分析

蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)在一定程度上反映了其所持有的功能性質(zhì), 對PHb、 G-PHb和制備的CG-PHb進行掃描電鏡分析, 結(jié)果見圖7(a, b, c)。

圖7 不同處理方式下PHb的SEM圖(×500倍)

由圖7可知, 冷凍干燥后的PHb表面呈光滑均勻的片狀結(jié)構(gòu), 添加葡萄糖進行糖基化反應(yīng)后, 明顯改變了其表面的微觀結(jié)構(gòu), 接枝物的分子間發(fā)生大量的結(jié)合聚集現(xiàn)象, G-PHb呈枝狀, 結(jié)構(gòu)疏松、 有序, 分布均勻, 無明顯的剛性結(jié)構(gòu), 與宋永令等[23]的研究結(jié)果一致。 糖基化后的PHb與兒茶素結(jié)合后, 蛋白質(zhì)表面孔洞結(jié)構(gòu)增加, 蛋白質(zhì)空隙增大, 進而有利于糖鏈嵌入其中, 有利于其功能特性的發(fā)揮, 與前文的研究結(jié)果一致。

2.8 相關(guān)性分析

PHb、 G-PHb和CG-PHb的功能特性與其自身內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化緊密相關(guān)。 由圖8可知, PHb、 G-PHb和CG-PHb的乳化性及表面疏水性與α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對含量呈負相關(guān),與β-折疊結(jié)構(gòu)的相關(guān)含量呈正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)分別為-0.87、 -0.91和0.92、 0.95, 說明樣品中β-折疊結(jié)構(gòu)含量越多, 樣品溶液的乳化性及表面疏水性越強。 且乳化性與表面疏水性之間也存在較為明顯的、 相關(guān)系數(shù)為1的正相關(guān)關(guān)系, 說明樣品溶液的乳化性隨表面疏水性的增強而增大。

3 結(jié) 論

對PHb、 G-PHb以及CG-PHb的功能特性及結(jié)構(gòu)進行了測定。 研究發(fā)現(xiàn), 糖基化處理及與兒茶素復(fù)合后制備的CG-PHb在溶解度、 濁度和乳化性能等方面均呈現(xiàn)顯著的優(yōu)勢(p<0.05), 表面疏水性相較于PHb和G-PHb分別增大了77.83%和50.03%(p<0.05), 抗氧化性隨著溶液濃度的升高不斷增大, 溶液濃度為1.60 g·mL-1時, 抗氧化性最高達93.60%; 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化, 其中β-折疊相對含量顯著增加, 而α-螺旋、 無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角相對含量減少(p<0.05), 蛋白質(zhì)表面孔洞結(jié)構(gòu)增加, 有利于糖鏈的嵌入而使其功能特性更好地發(fā)揮。 因此, 糖基化及與兒茶素復(fù)合處理可以有效改善PHb的功能特性, 使其更好地應(yīng)用于食品工業(yè)中。