徐 榮, 敖冬梅, 李曼鈿, , 劉 賽, 郭 昆, 胡 穎, 楊春梅, 徐常青

1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所, 北京 100193

2. 北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部, 北京 100094

引 言

忍冬屬中藥材主要包括金銀花和山銀花, 均為我國常用大宗中藥材。 金銀花, 別名忍冬、 二花等, 為忍冬科忍冬屬植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花, 主要分布在河南、 山東等省份, 在我國有悠久的藥用歷史。 山銀花為忍冬屬灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、 紅腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、 華南忍冬LoniceraconfusaDC. 、 黃褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或初開的花, 主要分布在湖南、 四川、 貴州、 云南等南方省份。 金銀花和山銀花均具有清熱解毒、 疏散風(fēng)熱的功效[1], 主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)包括有機酸、 黃酮、 三萜及皂苷、 環(huán)烯醚萜、 揮發(fā)油等多種化合物, 但藥材基原不同其具體成分和含量具有一定差異[2]。 目前, 在藥材流通領(lǐng)域, 忍冬科忍冬屬中藥因種類多、 產(chǎn)量大、 分布范圍廣、 性狀特征相似、 功效相近, 存在摻偽混淆等現(xiàn)象, 尤其因山銀花價格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于金銀花而摻偽混淆嚴(yán)重, 對臨床用藥的安全性、 有效性造成影響。 因此, 開展不同基原忍冬屬中藥材的鑒別研究十分必要。

當(dāng)前, 對忍冬屬中藥的鑒別方法多集中于《中國藥典》規(guī)定的性狀鑒別、 顯微鑒別以及結(jié)合現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的薄層色譜法、 高效液相色譜法、 超高效液相色譜法、 核磁共振氫譜法、 DNA條形碼技術(shù)等方法的鑒別[3-7]。 性狀鑒別和顯微鑒別方法條件簡單、 操作方便, 但需要具備專業(yè)性強、 實戰(zhàn)經(jīng)驗豐富的評價人員, 而利用儀器檢測技術(shù)雖然能夠準(zhǔn)確、 有依據(jù)地判斷忍冬屬中藥的基原, 但檢測程序較為繁瑣, 樣品前處理繁雜、 耗時長、 樣品損耗多, 不適宜對大批量樣品進行鑒別, 因此亟需建立一種快速、 無損、 低成本的鑒別方法。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)具有無損、 快速、 特征性強、 儀器操作簡便、 環(huán)保等優(yōu)點, 并且能夠顯現(xiàn)有機物的分子振動信息, 同時紅外吸收峰窄、 譜峰重疊可分離、 樣品信息豐富, 能夠體現(xiàn)樣品的宏觀性、 整體性, 已在中藥的鑒別和質(zhì)量評價方面得到廣泛應(yīng)用[8-11]。 另外, 采用儀器分析技術(shù)同化學(xué)計量法相結(jié)合對中藥進行模式識別, 也日益成為一種快速鑒別中藥材基原植物、 產(chǎn)地來源和真?zhèn)蝺?yōu)劣的有效途徑。 本工作采用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)結(jié)合Soft independent modding of class analogy(SMICA)聚類分析法對來源于忍冬、 灰氈毛忍冬、 紅腺忍冬和黃褐毛忍冬的4種不同基原忍冬屬中藥材的鑒別方法進行了研究, 為忍冬屬中藥的鑒別提供了新的技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Spectrum GX型傅里葉變換紅外光譜儀(Perkin-Elmer公司); Assure ID軟件(PerkinElmer公司); Atlas 15T手動壓片機(德國Specac公司); AB265-S(1/10萬)電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); 瑪瑙研缽; KBr光譜純(北京化學(xué)試劑公司)。

1.2 樣品來源

紅腺忍冬藥材樣品50份, 來自廣東、 廣西、 湖北、 浙江; 灰氈毛忍冬藥材樣品90份, 來自湖北、 湖南、 四川、 重慶、 云南; 黃褐毛忍冬藥材樣品20份, 來自貴州; 忍冬藥材樣品40份, 來自北朝鮮、 湖北、 陜西。 經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定, 分別為忍冬科忍冬屬植物紅腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、 灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、 黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng及忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

樣品充分干燥并粉碎過100目篩, 取2.5 mg樣品粉末放入研缽, 再放入150 mg KBr粉末混勻, 研磨至無明顯顆粒, 轉(zhuǎn)移到模具中, 約10 MPa下經(jīng)15 sec壓成近透明薄片。

1.3.2 光譜測定

室內(nèi)溫度保持在20～25 ℃, 相對濕度保持在18%～30%, 光譜范圍4 000～400 cm-1, 分辨率為4 cm-1, 累計掃描16次, 掃描時實時扣除H2O和CO2的干擾, 以溴化鉀為背景, 每個樣品重復(fù)3組。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品獲得的3張紅外光譜圖, 進行加和運算取其平均圖譜作為該樣品的紅外光譜圖。 得到圖譜后采用SpectrumV10.3.6軟件進行基線自動校正, 13點平滑、 吸光度歸一化為1.3。 二階導(dǎo)數(shù)譜范圍為1 800～400 cm-1, 用SpectrumV10.3.6軟件中的compare軟件, 以S1為設(shè)置參比, 計算紅外光譜圖譜帶較密集的指紋區(qū)(1 800～400 cm-1)的相似系數(shù)并選取13點平滑計算二階導(dǎo)數(shù)譜。 提取上述忍冬屬藥材紅外光譜差異特征, 采用Assure ID軟件進行SIMCA聚類分析, 進行聚類建模, 帶入其他已知基原植物的樣品對結(jié)果模型進行驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗

同一樣品片, 連續(xù)測定5次紅外光譜, 計算所得到的紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。 其相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8, 0.999 6, 0.999 2, 0.999 0, 0.999 0, RSD=3.63×10-4。 結(jié)果表明, 本方法具有良好的精密度。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗

同一樣品, 取其供試粉末壓片1片, 放入真空干燥器內(nèi)保存, 每隔1 h進行1次紅外光譜測定, 計算5 h內(nèi)所得到的紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。 其相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9、 0.999 9、 0.999 9、 0.999 8、 0.999 6, RSD=1.30×10-4。 結(jié)果表明, 儀器和樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.3 重復(fù)性試驗

同一樣品, 取其供試粉末壓片5片, 分別進行紅外光譜測定, 計算所得到的紅外光譜圖之間的相關(guān)系數(shù)。 其相關(guān)系數(shù)分別為0.999 2、 0.998 3、 0.997 7、 0.997 1、 0.996 8, RSD=9.64×10-4。 結(jié)果表明, 本方法具有良好的重現(xiàn)性, 符合樣品分析要求。

2.2 紅外光譜分析

如圖1所示, 紅外光譜圖中, 4種不同基原忍冬屬藥材的一維紅外圖譜非常相似, 譜峰的位置和峰高都比較接近, 其共同吸收峰位于1 629～1 635、 1 376～1 384、 1 265～1 282、 1 152～1 158、 1 050～1 051、 814～816、 611～614和534～537 cm-1。 說明4種不同基原的忍冬屬藥材主要成分具有一定的相似性, 然而不同基原藥材的某些吸收峰強度、 位置和形狀存在差異。 不同之處在于, 僅忍冬顯示了1 731 cm-1吸收峰, 紅腺忍冬、 灰氈毛忍冬及黃褐毛忍冬此處吸收峰不明顯, 按峰高排序未被標(biāo)注; 在相同條件下, 紅腺忍冬顯示的吸收峰較灰氈毛忍冬、 黃褐毛忍冬及忍冬少, 在1 525、 1 446、 859、 815和780 cm-1處吸收峰不明顯, 而其他3種基原的藥材在這些位置附近均具有吸收峰; 黃褐毛忍冬與忍冬具有428(425) cm-1附近吸收峰; 黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬在1 075 cm-1附近顯示吸收峰; 灰氈毛忍冬與忍冬顯示1 103 cm-1附近吸收峰; 在425～859 cm-1波段, 紅腺忍冬有4個明顯吸收峰, 黃褐毛忍冬與忍冬有6個明顯吸收峰, 灰氈毛忍冬有5個明顯吸收峰, 且4種藥材所顯示的吸收峰峰高、 峰形寬窄均略有差異。 一維紅外光譜結(jié)果表明, 4種藥材在化學(xué)組成上既含有共同種類的化學(xué)成分, 如揮發(fā)油、 環(huán)烯醚萜、 黃酮、 有機酸類等, 又含有各自的特征性成分, 且共同種類的化學(xué)成分在結(jié)構(gòu)類型及含量上也存在一定的差異。 因此, 根據(jù)特征峰的位置和顯示程度從一維紅外光譜圖中能夠?qū)?種不同基原的忍冬屬藥材一一區(qū)分開來。

圖1 四種不同基原忍冬屬藥材的紅外光譜分析圖a: 紅腺忍冬; b: 黃褐毛忍冬; c: 灰氈毛忍冬; d: 忍冬

表1 四種不同基原忍冬屬藥材的主要紅外吸收峰及其指認(rèn)

采用Spectrum v10.3.6軟件的compare功能計算四者的相似系數(shù), 以紅腺忍冬為參照, 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬相似系數(shù)為0.97, 與忍冬的相似系數(shù)為0.96, 與黃褐毛忍冬的相似系數(shù)為0.94; 以黃褐毛忍冬為參照, 黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬的相似系數(shù)為0.95, 與忍冬的相似系數(shù)為0.96; 以灰氈毛忍冬為參照, 灰氈毛忍冬與忍冬的相似系數(shù)為0.98。 結(jié)果表明, 4種不同基原的忍冬屬藥材間存在一定的差異, 其中, 紅腺忍冬與黃褐毛忍冬的差異最大, 忍冬與灰氈毛忍冬的相似度較高。

2.3 二階導(dǎo)數(shù)圖譜分析

圖2為4種不同基原忍冬屬藥材的二階導(dǎo)數(shù)圖譜, 與一維紅外圖譜相比, 其中重疊的吸收峰被分開, 使一些特征譜帶間的差異更明顯。 如紅腺忍冬在1 516～1 700及781～980 cm-1波段吸收峰頻率及形狀與其他3種基原藥材有較大差異。 在1 516～1 700 cm-1波段紅腺忍冬的吸收峰表現(xiàn)為峰形窄、 峰高低、 吸收峰密集, 表明紅腺忍冬中含有的黃酮類、 環(huán)烯醚萜類等成分與其他3種藥材相比含量略偏低、 結(jié)構(gòu)類型比較多。 在781～980 cm-1波段吸收峰表現(xiàn)為峰形寬、 峰高低、 吸收峰稀疏, 表明紅腺忍冬中含有的黃酮類、 有機酸類等成分與其他3種藥材相比含量略偏低、 結(jié)構(gòu)類型相對較少。 另外, 紅腺忍冬與其他3種基原藥材的二階導(dǎo)數(shù)譜相比, 缺少1 598 cm-1附近吸收峰。 由此, 可以將紅腺忍冬與其他3種藥材區(qū)分開來。 黃褐毛忍冬與灰氈毛忍冬的二階導(dǎo)數(shù)譜相比, 除在1 631、 1 376和945 cm-1附近有差異外, 峰形具有較大的相似性。 同時, 除黃褐毛忍冬在1 384 cm-1附近—CH3的吸收峰不明顯, 其他3種基原藥材均有。 由此, 可以將黃褐毛忍冬與其他3種藥材區(qū)分開來。 紅腺忍冬、 灰氈毛忍冬和黃褐毛忍冬都顯示了1 317 cm-1附近吸收峰, 只忍冬沒有顯示。 這一結(jié)果與文獻報道[17]的紅腺忍冬、 灰氈毛忍冬和黃褐毛忍冬中含有的醇類物質(zhì)比忍冬中種類更多、 含量更高相吻合。 由此, 可以將忍冬與其他3種藥材區(qū)分開來。 由此可見, 從分辨率更高的二階導(dǎo)數(shù)圖譜上, 可以清晰地看到紅腺忍冬、 黃褐毛忍冬、 灰氈毛忍冬及忍冬的顯著差異, 4種基原的忍冬屬中藥均得到了很好的鑒別與區(qū)分。

圖2 四種不同基原忍冬屬藥材的二階導(dǎo)數(shù)圖a: 紅腺忍冬; b: 黃褐毛忍冬; c: 灰氈毛忍冬; d: 忍冬

2.4 聚類分析

2.4.1 聚類模型構(gòu)建

建立不同基原忍冬屬藥材的聚類模型, 需對紅外光譜預(yù)處理條件進行選擇, 反復(fù)修改比較, 使聚類模型成為最優(yōu)模型。 在模型建立過程中應(yīng)選擇譜峰信息豐富的區(qū)域, 因此本研究選擇了400～1 800 cm-1波段; 同時對譜圖進行基線校正和矢量歸一化(standard normal variate, SNV)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換處理以保證譜圖的規(guī)范化。

2.4.1.1 聚類模型類間距分析

類間距是指聚類中心之間的距離, 間距數(shù)值越大, 類與類之間的差異越明顯, 因此類間距能夠判別聚類效果。 表2為4種不同基原忍冬屬藥材的類間距, 顯示紅腺忍冬與灰氈毛忍冬的類間距值最低, 為2.73, 說明其相似度高; 黃褐毛忍冬與紅腺忍冬及灰氈毛忍冬差異較大, 類間距值分別為6.86、 5.26。 類間距數(shù)值越大表示差異越大。 因此, 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬、 忍冬差異較小, 而黃褐毛忍冬與其他3種基原的藥材差異較大。

表2 四種不同基原忍冬屬藥材的類間距

本研究中4種不同基原忍冬屬藥材的類間距與紅外光譜相似系數(shù)的大小順序基本一致, 但相似系數(shù)結(jié)果表明, 忍冬和灰氈毛忍冬的相似性最近, 為0.98; 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬相似系數(shù)為0.97, 僅次于忍冬; 而類間距結(jié)果表明, 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬的類間距值最低, 為2.73; 忍冬與灰氈毛忍冬的類間距值為2.79。 結(jié)合文獻[18]綜合分析, 導(dǎo)致這些結(jié)果的原因可能與聚類模型紅外光譜譜段的選擇有關(guān)。

2.4.1.2 聚類模型識別率和拒絕率分析

識別率是指樣品落入該模型區(qū)域的幾率, 而拒絕率則是指樣品模型對不屬于該類的未知樣品的拒絕程度, 即是否都落在該類模型的區(qū)域外。 當(dāng)識別率與拒絕率達(dá)到100%時, 表明物質(zhì)之間沒有重疊, 區(qū)分效果較好。 由表3可見, 4種不同基原忍冬屬藥材各自的識別率和拒絕率均能達(dá)到99%以上, 說明這幾種樣品區(qū)分聚類效果良好。

表3 四種不同基原忍冬屬藥材的識別率和拒絕率

2.4.1.3 類模型圖分析

圖3為4種不同基原忍冬屬藥材的類模型圖。 由圖3可見, 同一基原物種的樣品很好地聚集在每個橢圓區(qū)及方形區(qū)內(nèi), 兩個不同集合之間并無重疊, 可以明顯地鑒別出不同基原物種的忍冬屬藥材樣品。

圖3 四種不同基原忍冬屬藥材的聚類模型圖

2.4.2 聚類模型校驗

隨機選取4種已知基原的忍冬屬樣品各2份共8個樣品, 將其紅外光譜圖導(dǎo)入所建聚類模型進行檢驗, 結(jié)果校驗樣品均被正確識別, 說明此聚類模型準(zhǔn)確可用。

3 結(jié) 論

在進行紅外光譜比較和相似系數(shù)比較時, 采用紅外光譜平均圖譜進行比較研究是建立在樣品個體光譜之間差異分析的基礎(chǔ)上的。 4種基原忍冬屬藥材樣品個體光譜研究表明, 來自同一基原的個體樣品紅外光譜具有很強的相似度, 譜峰的位置和峰高都比較接近, 可以消除一些由樣品來源差異而對基原鑒別結(jié)果產(chǎn)生影響的因素。

采用傅里葉紅外光譜結(jié)合SIMCA聚類分析法, 建立了一種快速、 無損地對4種不同基原忍冬屬中藥進行鑒別的聚類分析模型。 不同基原藥材的一維圖譜及二階導(dǎo)數(shù)圖譜都顯示了差異, 二階導(dǎo)數(shù)圖譜比一維圖譜更詳細(xì)直觀地在峰位置、 峰強度方面顯示了差異性, 驗證了一維圖譜的差異度。 進一步采用聚類分析法對其進行鑒別分級, 根據(jù)類間距的差異, 紅腺忍冬與灰氈毛忍冬、 忍冬的相似度稍高, 而黃褐毛忍冬與其他3種藥材的差異最大, 結(jié)合文獻[3], 可以將紅腺忍冬、 灰氈毛忍冬和忍冬劃分為一類、 黃褐毛忍冬來源樣品為一類。 聚類分析顯示, 樣品的識別率和拒絕率均達(dá)到99%以上, 類模型圖中不同基原物種兩兩分開, 實現(xiàn)了不同基原藥材的鑒別及分級, 表明采用紅外光譜結(jié)合SIMCA聚類分析法對4種不同基原忍冬屬藥材進行鑒別及構(gòu)建分級模型是具有較強的識別能力, 是科學(xué)合理的。 另外, 本研究中紅外光譜相關(guān)系數(shù)分析、 聚類分析結(jié)果相互補充和印證, 可為今后深入研究忍冬屬中藥的質(zhì)量評價體系提供實驗參考。