郭賀媛熙, 李利軍*, 馮 軍, 2*, 林 鑫, 李 睿

1. 廣西糖資源綠色加工重點實驗室, 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院, 廣西 柳州 545006

2. 廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部, 廣西 柳州 545005

引 言

氯霉素(chloramphenicol, CAP)屬于抑菌性抗生素, 長期微量攝入CAP, 會使腸道正常菌群失調(diào), 還會引起多種疾病, 對人體健康造成危害[1]。 因此, 許多國家禁止或嚴格監(jiān)管使用CAP[2], 歐盟規(guī)定動物源食品中CAP不得檢出[3]。 因此, 對CAP殘留的檢測至關(guān)重要。 目前, 有關(guān)CAP的檢測方法主要有紅外吸收光譜法、 色譜法、 質(zhì)譜法等[4-7], 這些方法雖然具有較好的準確性, 但仍然存在一些不足。 因此, 發(fā)展快速、 靈敏、 準確的CAP檢測方法具有重要的實際意義。

近年來, SERS檢測技術(shù)因具有高靈敏度[8-9]、 抗水干擾、 無損、 響應(yīng)快、 指紋識別和樣品消耗量少等優(yōu)勢[10-13], 在藥物分析、 生物醫(yī)學(xué)檢驗等領(lǐng)域的應(yīng)用受到關(guān)注[14-17]。 核酸適配體作為DNA或RNA單鏈片段, 具有靶分子范圍廣、 特異性高、 可化學(xué)合成、 易于修飾等特點, 在分析化學(xué)、 生物傳感器、 醫(yī)學(xué)診斷等方面得到廣泛應(yīng)用。

DNA雜交指示劑亞甲基藍(MB)屬于吩噻嗪類染料[18-20], 通常以嵌插鍵合或溝槽鍵合方式與雙鏈DNA定量結(jié)合[21-23], 據(jù)此可構(gòu)建電化學(xué)或熒光生物傳感器[24-26]。 MB具有拉曼活性, 可作為拉曼信號分子[27], 因此, 以MB作為拉曼信號分子, 結(jié)合SERS檢測技術(shù), 可發(fā)展SERS-生物傳感器, 但到目前為止, 尚未見有相關(guān)的報道。

本工作嘗試利用以SH-Apt修飾芯片作SERS基底、 以MB為DNA雜交指示劑和拉曼信號分子, 基于CAP、 cDNA與Apt的競爭關(guān)系, 構(gòu)建一種新型的CAP-SERS適配體生物傳感器, 以SEM、 EDS、 XRD和SERS等對芯片、 SERS基底及適配體傳感器分別進行表征, 并考察傳感器的相關(guān)性能, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)該新型的CAP-SERS適配體傳感器具有制備簡單、 檢測快速、 靈敏、 特異性強等優(yōu)點, 可望應(yīng)用于CAP的快速、 靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

共聚焦拉曼光譜儀(XploRAPLUS Raman Microscope, HORIBA, Japan), X射線衍射(XRD, Bruker D8A A25 X, Germany), 冷場發(fā)射掃描電鏡顯微鏡(SEM, S4800, Japan), EDS能譜儀(50max, 英國牛津儀器)。

銀納米棒陣列芯片(尺寸: 50 mm×50 mm, 由廣西三環(huán)高科拉曼芯片技術(shù)有限公司生產(chǎn), 通過銀原子蒸汽在潔凈的玻璃片上沉積形成銀納米棒陣列結(jié)構(gòu))。

巰基化的氯霉素適配體(SH-Apt)(GAT GGT GGC TGA GCG GCT GGC ACC CTG TTG AGT GAC TTCA-SH C6)、 cDNA(CTA CCA CCG ACTCGC)(生工生物工程(中國上海)股份有限公司), 氯霉素(CAP)標準品(源葉生物), 氯霉素(CAP)片劑(成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司), 阿奇霉素(AZM)(上海安譜實驗科技股份有限公司), 土霉素(OTC)、 克林霉素(CLI)、 左氧氟沙星(LEVO)(均購于阿拉丁試劑), MB(≥98.5%, 成都市科隆化學(xué)品有限公司), 人體血清、 豬血清(上海晶杭生物), 除非特別說明, 實驗室所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 CAP傳感器的制備

在芯片上滴加1.5 μL SH-Apt溶液后, 再滴加1.5 μL cDNA 溶液, 室溫下孵育6 h。 此時SH-Apt與cDNA雜交形成雙鏈DNA(dsDNA), 并通過Ag—S鍵修飾在Ag基芯片上; 然后再滴加3 μL 1×10-5mol·L-1的MB, 自然晾干后, 用PBS緩沖液洗滌3次去除游離的MB, 得到CAP的SERS適配體傳感器。

1.2.2 MB溶液的濃度和用量的優(yōu)化

取3 μL系列濃度(5×10-5、 1×10-5、 5×10-6、 1×10-6、 5×10-7mol·L-1)的MB溶液分別滴加到SERS適配體傳感器的芯片上, 自然晾干后用PBS緩沖液洗滌三次, 采集其拉曼光譜。 取一系列體積1×10-5mol·L-1的MB溶液(1、 2、 3、 4和5 μL), 分別滴加到SERS適配體傳感器的芯片上, 自然晾干后用PBS緩沖液洗滌三次去除游離的MB, 再分別滴加3 μL 1 ng·mL-1的CAP標準液, 室溫下孵育3 h, 用PBS緩沖液充分洗滌, 自然晾干后, 采集其拉曼光譜。

1.2.3 檢測方法及步驟

在CAP-SERS適配體傳感器的芯片上滴加3 μL的待測CAP樣液, 室溫下反應(yīng)3 h, 用PBS緩沖液充分洗滌后自然晾干, 采集其拉曼光譜。 儀器參數(shù): Grating 600 gr·mm-1, 波長638 nm, 功率37.5 mW, 積分時間10 s, Filter: 1%。 檢測步驟如圖1所示。

圖1 檢測原理示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 芯片的表征

用SEM、 EDS、 XRD對芯片進行表征, 結(jié)果如圖2所示。 由芯片的SEM圖2(a)可知, 芯片呈納米棒陣列結(jié)構(gòu)。 由芯片的EDS圖2(b)可知, 納米棒的主要組成元素為銀。 元素分布如圖2(c)所示, 紅色表示銀元素, 可看出芯片上分布大量的銀元素, 且分布比較均勻。 由XRD圖2(d)可知, 衍射峰出現(xiàn)在38.2°和64.5°處, 分別對應(yīng)Ag的(111)和(220)晶面[28]。

2.2 芯片的拉曼增強因子

取3 μL 1×10-5mol·L-1MB滴于芯片上, 其拉曼光譜檢測結(jié)果如圖3所示。 由圖3可知, MB特征峰在1 624 cm-1處[29], 峰強為17 820。 將3 μL的1 mol·L-1的MB滴于玻璃片上。 采用式(1)計算增強因子(EF)[30]

圖3 芯片上1×10-5 mol·L-1MB溶液的SERS譜圖

(1)

式(1)中,ISERS為基底材料上MB拉曼強度,Ibare為裸玻片上MB拉曼強度,cSERS為基底材料上MB濃度,cbare為裸玻片上MB濃度。cSERS=1.0×10-7mol·L-1,ISERS=587;cbare=1.0 mol·L-1,Ibare=577。 計算得EF=1.01×107, 檢測限為0.2 pg·mL-1(S/N=3)。

2.3 傳感器的表征

2.3.1 傳感器的EDS表征

為考察SERS傳感器是否制備成功, 進行EDS表征, 圖4(a)為芯片的EDS能譜圖; 圖中Si元素來自于芯片基底-玻璃片, Ag元素來自銀納米棒, 還有少量的C元素, 可能源于芯片基底的部分雜質(zhì)。 圖4(b)為芯片修飾雙鏈后的EDS能譜圖, 與圖4(a)相比, 圖4(b)中出現(xiàn)了N、 P、 O等元素, 并O元素峰高明顯增大, 這些元素源于DNA中的脫氧核糖核、 堿基及磷酸基, 證明雜交后的dsDNA成功的修飾到了芯片上。

2.3.2 傳感器的SERS表征

按1.2.3節(jié)中的檢測方法, 檢測滴加1.0 ng·mL-1的CAP溶液前后的SERS強度變化, 結(jié)果如圖5所示。 由圖5(a)和(b)對比可知, 滴加CAP溶液后拉曼峰的強度明顯下降,可見傳感器對CAP響應(yīng)靈敏, 進一步證明傳感器的制備成功。

2.4 MB溶液濃度和用量的優(yōu)化

對MB的濃度和體積進行優(yōu)化, 結(jié)果如圖6所示。 圖6(a)為MB濃度對拉曼峰的影響, 由圖6(a)可知, 當(dāng)MB濃度為1×10-5mol·L-1時, 1 624 cm-1處的拉曼峰最高; 圖6(b)為MB溶液用量對拉曼峰的影響, 由圖6(b)可知, 當(dāng)加入3 μL MB溶液時, 拉曼峰最高。 這是因為小分子與dsDNA作用主要有嵌插鍵合、 溝槽鍵合和靜電鍵合3種方式, 嵌插鍵合、 溝槽鍵合發(fā)生在DNA雙螺旋的內(nèi)部, 靜電鍵合則發(fā)生在DNA溝槽的外部[31]。 MB濃度較高時易形成多聚體[32], 不利于MB分子以嵌插方式堆積到DNA的溝槽內(nèi)。 因此, MB溶液濃度大于 1×10-5mol·mL-1、 用量超過3 μL時, 拉曼峰開始降低。 綜上, 確定MB溶液濃度為1×10-5mol·mL-1、 用量為3 μL。

圖6 MB濃度和用量對拉曼峰的影響

2.5 CAP傳感器的標準曲線

按1.2.3節(jié)的檢測方法對不同濃度(0.001、 0.01、 0.1、 1和10 ng·mL-1)的CAP標準溶液進行檢測, 結(jié)果如圖7所示。 由圖7可知, 在0.001～10 ng·mL-1范圍內(nèi), CAP濃度的對數(shù)值logc與峰強ISERS呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系, 線性擬合方程為:ISERS=-971logc+1 983(R2=0.991)。 由圖7中插圖可知, 隨著CAP濃度的增大, 1 624 cm-1處的峰強ISERS逐漸減小。

圖7 檢測CAP的標準曲線

2.6 CAP傳感器相關(guān)性能的考察

重復(fù)性試驗。 檢測0.1 ng·mL-1CAP標準液, 采集同一點拉曼信號15次, 匯總后的拉曼光譜圖如圖8(a)所示, 其相對標準偏差RSD為7.9%。 對1.0 ng·mL-1CAP標準液平行測定9次, 結(jié)果如圖8(b)所示, 其相對標準偏差RSD為6.31%。 由圖8倆個實驗結(jié)果可知, 經(jīng)過多次激光照射, 拉曼峰強稍微有所下降, 但仍表現(xiàn)出較好的重復(fù)性。

圖8 CAP傳感器的重復(fù)性測定

均一性試驗。 檢測0.01 ng·mL-1CAP標準溶液, 采集同一個芯片上9個不同點的拉曼信號, 結(jié)果如圖9所示, 其RSD為8.02%, 表明該法具有較好的均一性。

圖9 CAP傳感器的均一性測定

選擇性試驗。 用傳感器分別檢測3 μL 1 ng·mL-1土霉素(OTC)、 阿奇霉素(AZM)、 克林霉素(CLI)、 左氧氟沙星(LVFX)、 CAP及PBS緩沖液(空白KB), 1 624 cm-1處的拉曼峰值如圖10所示。 由圖10可知, 除CAP外, 其他抗生素均表現(xiàn)出與空白樣相似結(jié)果, 只有CAP的拉曼峰值明顯下降, 表明該法具有較好的選擇性。

圖10 CAP傳感器測定不同物質(zhì)的拉曼峰強對比

傳感器的穩(wěn)定性考察。 將制備好的傳感器存放1、 5、 10、 20、 30 d, 分別對1 ng·mL-1CAP標準溶液進行檢測, 結(jié)果如圖11所示。 由圖11可知, 隨著存放天數(shù)的增加, 在20 d之前, 拉曼信號強度未見明顯降低; 存放30 d時, 拉曼信號明顯下降, 表明傳感器至少在20 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖11 CAP傳感器不同儲存時間的拉曼峰強對比

實際樣品的檢測及加標試驗:

樣品1, CAP片劑: 取一片CAP片劑(0.25 g·片-1)超聲30 min使CAP片劑充分溶解于PBS緩沖液中, 取3 μL CAP片劑溶解液, 用傳感器檢測其CAP含量。 對CAP片劑溶解液進行加標回收試驗, 由表1可知, 回收率在99.3%～109.1%之間, 相對標準偏差RSD(n=3)在0.97%～2.1%之間。

表1 CAP在三種實際樣品中的加標實驗結(jié)果(n=3)

根據(jù)CAP片劑溶解液中測得的CAP濃度0.000 76 ng·mL-1, 可知CAP片劑中CAP的含量約為0.25 g·片-1。

樣品2, 人血清樣: 以1.0 mL人血清與1.0 mL PBS均勻混合后, 用傳感器檢測其中CAP含量, 平行檢測了3次, 測得人血清樣中CAP含量為0。 將1.0 mL人血清分別與1.0 mL(0.1、 1和2 ng·mL-1)CAP標準液混合后, 用傳感器檢測其CAP含量并進行加標回收試驗, 由表1可知, 回收率在99.8%～109%之間, 相對標準偏差RSD(n=3)在1.6%～4.6%之間。

樣品3, 豬血清樣: 處理方法同樣品2, 測得豬血清樣中CAP含量為0; 對豬血清樣進行加標回收試驗, 由表1可知, 回收率在91.2%～120%之間, 相對標準偏差RSD(n=3)在2.2%～8.1%之間。

對3種實際樣品中CAP的檢測及加標試驗結(jié)果表明, 傳感器具有較好的可靠性, 有望應(yīng)用于實際樣品中CAP的檢測。

3 結(jié) 論

以SH-Apt修飾芯片作SERS基底、 以MB為拉曼信號分子, 利用CAP、 cDNA與Apt的競爭關(guān)系, 成功的構(gòu)建了一種新型的CAP-SERS適配體傳感器。 該傳感器具有制作簡單、 靈敏度高、 選擇性強、 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好及檢測速度快等優(yōu)點, 應(yīng)用于3種實際樣品中CAP的檢測, 并進行加標試驗, 結(jié)果令人滿意, 可望應(yīng)用于實際樣品中CAP的定量檢測。