陳才偉 陳家亮 李華娟 方芳 文方玲

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是由多種原因引起的慢性肺部炎癥性疾病,它的特征是不可逆的氣流受限,與肺部吸入香煙煙霧等顆粒物質(zhì)有關(guān)[1]。研究發(fā)現(xiàn)肺部及全身性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、氣道重塑是引起COPD的主要誘因[2]。因此抑制炎癥,改善氧化應(yīng)激是治療COPD的關(guān)鍵著力點(diǎn)。蟲(chóng)草素(Cordycepin,Cor)是天然藥材冬蟲(chóng)夏草的主要生物活性成分,具有廣泛的生物活性,如抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等[3]。有研究發(fā)現(xiàn),Cor可以通過(guò)抑制nuclear factor kappa-B(NF-κB p65)炎癥通路來(lái)改善膿毒癥小鼠肺損傷,還可以改善腎臟組織因ROS過(guò)量產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷[4-5]。目前臨床上對(duì)于Cor治療COPD的機(jī)制尚不明確,因此本研究基于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinase,MAPK)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信號(hào)通路,探討Cor對(duì)于COPD可能的治療機(jī)制,為COPD治療尋找新的治療靶點(diǎn)。

資料與方法

一、材料

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只,6～8周齡,體質(zhì)量200-220g,購(gòu)買(mǎi)自廣州銳格生物科技有限公司,許可證號(hào):SCXK(粵)2021-0059。所有大鼠均飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,觀察無(wú)異常后,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 試劑與儀器 Cor標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;N-乙酰半胱氨酸(NAC)片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20080326)購(gòu)自中國(guó)海南海邦藥業(yè)有限公司;LTB4、TNF-α、IL-6的ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;HE染色試劑盒、MDA、SOD、GSH-Px微量法試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;抗體p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38、C-jun、C-fos、GAPDH均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

儀器:多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯。

二、方法

1 造模及分組 利用煙熏聯(lián)合脂多糖滴入氣管的方法造模[6]:將大鼠置于煙熏箱中,使用香煙煙熏5 w,每天早晚各1 h,煙熏時(shí)間間隔12 h。在煙熏的第1天和第15天在大鼠氣管內(nèi)滴入0.2 mL脂多糖,造模結(jié)束后,以肺組織出現(xiàn)明顯病理?yè)p傷及肺功能下降為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。將造模大鼠隨機(jī)分為模型組(COPD)、蟲(chóng)草素低、中、高劑量組(Cor-L、M、H,10、20、50mg/kg,用0.5%的羧甲基纖維素鈉制備成相應(yīng)濃度的混懸液)[7]、陽(yáng)性對(duì)照組(NAC,0.5g/kg,用0.5%的羧甲基纖維素鈉制備成混懸液)[8],另設(shè)置正常培養(yǎng)的大鼠為對(duì)照組(NC)。造模后,Cor-L、M、H組、NAC組分別按照對(duì)應(yīng)劑量灌胃Cor和NAC的0.5%的羧甲基纖維素鈉混懸液,COPD組和NC組給予0.5%的羧甲基纖維素鈉灌胃,一天一次,連續(xù)給藥2周。

2 肺功能檢測(cè) 末次給藥24 h后,麻醉大鼠,固定于手術(shù)臺(tái),利用大鼠肺功能儀,檢測(cè)肺功能指標(biāo),包含呼氣峰流速(peak expiratory flow,PEF)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)。

3 樣本采集 肺泡灌洗液:肺功能檢測(cè)完畢后,麻醉大鼠,手術(shù)暴露氣管,結(jié)扎右側(cè)氣管,使用注射器向左肺中注入PBS緩沖液,反復(fù)灌洗3次,合并灌洗液,離心分別收集上清和細(xì)胞沉淀備用。

肺組織:收集肺泡灌洗液完畢后,處死大鼠,手術(shù)暴露肺部,無(wú)菌完整剝離肺組織,用于肺部病理學(xué)變化檢測(cè)、氧化應(yīng)激、蛋白檢測(cè)。

4 大鼠肺組織病理學(xué)變化檢測(cè) 取方法3中保留的右肺中葉,PBS沖洗干凈后,使用4%多聚甲醛固定后,脫水、浸蠟、包埋、切片后,使用HE染色試劑盒進(jìn)行染色,光學(xué)顯微鏡下觀察拍照,并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9](見(jiàn)表1)。

表1 肺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

5 大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞種類(lèi)觀察 取方法3中保存的肺泡灌洗液中的細(xì)胞沉淀,加入PBS混勻后,取適量細(xì)胞懸液在顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目。再取細(xì)胞懸液制備細(xì)胞涂片,染色后對(duì)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)。

6 大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平 取方法3中保存的肺泡灌洗液上清,根據(jù)ELISA試劑盒檢測(cè)上清中TNF-α、IL-6和LTB4水平。

7 大鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取方法3中保留的右肺上葉,液氮研磨后,勻漿離心,收集上清,根據(jù)微量法試劑盒檢測(cè)肺組織中MDA、SOD、GSH-Px水平。

8 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取方法3中保留的右肺下葉,剪碎,加入蛋白裂解液,超聲破碎后,離心收集上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度后,取適量蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,完成上述步驟后,洗膜,加入一抗p-ERK(1 ∶1 000)、ERK(1 ∶1 000)、p-JNK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶1 000)、p-p38(1 ∶1 000)、p38(1 ∶1 000)、C-jun(1 ∶1 000)、C-fos(1 ∶1 000),內(nèi)參GAPDH(1 ∶1 000),4℃過(guò)夜后,洗膜加入二抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h后,化學(xué)發(fā)光法顯影,目的蛋白與內(nèi)參的條帶灰度值之比表示為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩間比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Cor對(duì)大鼠肺功能的影響

如(表2)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺功能指標(biāo)PEF、FVC值均顯著下降(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺功能指標(biāo)PEF、FVC值均顯著上升(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,上述指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較

二、Cor對(duì)大鼠肺組織病理學(xué)變化的影響

如(圖1)所示,NC組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡輪廓清晰,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔正常,大小正常;與NC組比較,COPD組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔增厚,肺泡腫大,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,病理學(xué)評(píng)分顯著升高[(0.26±0.04)分vs(5.45±0.63)分,P<0.05];Cor各劑量組隨著藥物濃度增大,肺泡腫大、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理現(xiàn)象逐漸減輕;NAC組呈現(xiàn)出與Cor-H組相當(dāng)程度的病理?yè)p傷好轉(zhuǎn)現(xiàn)象;與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低[(5.45±0.63)分vs(4.69±0.55)分、(3.82±0.45)分、(2.71±0.39)分、(2.75±0.42)分,P均<0.05]。

圖1 HE染色觀察大鼠肺組織病理學(xué)變化(HE×200)

三、Cor對(duì)大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞數(shù)目的影響

如(表3)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞比率顯著上升,巨噬細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞比率顯著下降(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞比率顯著下降,巨噬細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞比率顯著上升(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,肺泡灌洗液白細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞數(shù)目比較

四、Cor對(duì)大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平的影響

如(表4)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和LTB4水平均顯著上升(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和LTB4水平均顯著下降(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,肺泡灌洗液炎性因子水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 各組大鼠肺泡灌洗液炎性因子水平比較

五、Cor對(duì)大鼠肺組織氧化應(yīng)激的影響

如(表5)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺組織中MDA含量顯著上升,SOD、GSH-Px活性顯著下降(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺組織中MDA含量顯著下降,SOD、GSH-Px活性顯著上升(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,肺組織MDA、SOD、GSH-Px水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 各組大鼠氧化應(yīng)激水平比較

六、Cor對(duì)大鼠肺組織中蛋白表達(dá)的影響

為了確定Cor對(duì)于是否通過(guò)MAPK信號(hào)來(lái)影響AP-1表達(dá),檢測(cè)了MAPK相關(guān)蛋白ERK、JNK、p38MAPK(p38)及其磷酸化水平,以及AP-1相關(guān)蛋白C-jun、C-fos蛋白表達(dá)。(如圖2、表6)所示,與NC組比較,COPD組大鼠肺組織中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38、C-jun、C-fos蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05);與COPD組比較,Cor各劑量組、NAC組大鼠肺組織p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38、C-jun、C-fos蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);NAC組與Cor-H組比較,肺組織MAPK、AP-1相關(guān)蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖2 大鼠肺組織中MAPK/AP-1信號(hào)通路蛋白條帶

表6 各組大鼠肺組織中蛋白表達(dá)水平比較

討 論

既往研究表明氧化應(yīng)激,炎癥反應(yīng),蛋白酶/抗蛋白酶失衡是COPD發(fā)病過(guò)程中的重要參與者,ROS過(guò)量會(huì)導(dǎo)致肺組織發(fā)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生,促進(jìn)肺組織炎癥反應(yīng),使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)肺部,釋放大量炎癥因子,肺功能也隨之下降[10]。在本研究結(jié)果中,COPD大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡腫大變形和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)變化,并且肺功能下降,提示造模成功。

COPD的特征是氣道慢性炎癥,導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)(肺氣腫)破壞和肺功能下降,而活性氧過(guò)量會(huì)幫助COPD擴(kuò)大炎癥反應(yīng),長(zhǎng)期炎癥刺激又會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞(例如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn),然后釋放多種炎性細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α等加劇肺部炎癥反應(yīng)[11-12]。COPD通常與吸煙有關(guān),香煙煙霧在COPD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,作為外源性的活性氧,使患者氣道免疫失調(diào),產(chǎn)生炎癥[13]。ROS過(guò)量會(huì)導(dǎo)致COPD患者體內(nèi)MDA大量產(chǎn)生,抗氧化物質(zhì)如SOD、GSH耗盡,導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)失衡[14]。在本研究中,COPD組大鼠出現(xiàn)高氧化應(yīng)激狀態(tài),MDA含量上升,SOD、GSH-Px活性下降;并且肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞水平顯著上升,炎性因子TNF-α、IL-6和LTB4水平也顯著上升,表現(xiàn)在HE染色中的結(jié)果是肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,說(shuō)明香煙和LPS聯(lián)合使COPD大鼠產(chǎn)生了氧化應(yīng)激,并且因此導(dǎo)致了炎性反應(yīng)的加劇。Cor具有抗炎和抗氧化活性,研究發(fā)現(xiàn)它可以減輕棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,抑制活性氧ROS的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)[15]。在本研究中,經(jīng)過(guò)不同劑量Cor處理后,大鼠肺功能上升,氧化應(yīng)激狀態(tài)得到改善,炎性細(xì)胞因子水平下降,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少,且高劑量Cor對(duì)COPD大鼠肺功能的保護(hù)作用顯著優(yōu)于低、中劑量Cor,說(shuō)明Cor以劑量依賴(lài)性方式抑制了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),改善了COPD大鼠肺功能。

研究發(fā)現(xiàn)ROS介導(dǎo)細(xì)胞炎癥通路如MAPK/AP-1通路激活參與炎性疾病的發(fā)展,在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中,抑制MAPK/AP-1通路表達(dá)可以改善小鼠的肺部炎癥[16]。MAPK的激活可以誘導(dǎo)炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1易位到細(xì)胞核中并增加TNF-α和IL-6的釋放,MAPK包含多個(gè)成員,如細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、C-Jun N末端激酶(JNK)、p38,AP-1包括C-Fos和C-Jun異二聚體,是介導(dǎo)多種生物過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子[17-18]。紫外線輻射產(chǎn)生的活性氧ROS是導(dǎo)致光損傷的主要因素,通過(guò)藥物活性成分抑制MAPK/AP-1蛋白磷酸化水平,可以抑制炎性細(xì)胞因子的釋放,改善紫外線輻射的皮膚光損傷[19]。NAC是一種在臨床上用于治療COPD的黏液溶解劑,可通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化能力,減輕患者的痰黏液癥狀,改善肺功能,且NAC具有顯著的抗炎活性[20-21]。研究顯示,NAC能夠通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)通路抑制COPD大鼠肺組織炎癥反應(yīng)[22]。白學(xué)敏[23]等人發(fā)現(xiàn),NAC能通過(guò)降低p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-ERK/ERK表達(dá)抑制MAPK信號(hào)通路,抑制氣道黏液高分泌狀態(tài),改善COPD大鼠肺功能。在本研究中,給予NAC干預(yù)后,COPD大鼠肺損傷明顯改善,這與以往的研究[22-23]結(jié)果一致;經(jīng)過(guò)Cor處理后,各組大鼠肺組織MAPK/AP-1蛋白磷酸化水平下降,改善了香煙和LPS聯(lián)合產(chǎn)生氧化應(yīng)激,抑制了炎癥反應(yīng),改善了COPD大鼠的肺損傷;且Cor對(duì)COPD大鼠肺損傷的保護(hù)作用與NAC相似,說(shuō)明Cor具有治療COPD的潛力。

綜上所述,Cor可以抑制MAPK/AP-1信號(hào)通路,減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織病理?yè)p傷。關(guān)于上游激活MAPK/AP-1信號(hào)通路以及該通路對(duì)下游炎性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。