崔看利，張丹，方展明，任雨新，姜瑞璇，孫學(xué)亮

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

在養(yǎng)殖水體中存在著大量的有機(jī)體、魚類的排泄物以及過剩餌料的分解物，這些有機(jī)物分解會(huì)產(chǎn)生氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽等不利于魚類健康生存的物質(zhì)[1]，許多研究表明水體富營養(yǎng)化主要是由氮、磷等營養(yǎng)鹽含量過多所引起的[2]。隨著國家環(huán)保政策日趨嚴(yán)格，如何高效處理養(yǎng)殖尾水成為了水產(chǎn)行業(yè)中的焦點(diǎn)問題。人工濕地作為主要由植物和微生物組成的水生生態(tài)系統(tǒng)，其在養(yǎng)殖尾水處理中具有較大的應(yīng)用潛力，最大的優(yōu)點(diǎn)是成本低、能耗少、管理運(yùn)營簡(jiǎn)單且環(huán)境友好[3]。

生物脫氮被普遍認(rèn)為是去除水體中氮元素最經(jīng)濟(jì)有效的途徑[4]，傳統(tǒng)的生物脫氮是利用自養(yǎng)硝化細(xì)菌和厭氧反硝化細(xì)菌兩類細(xì)菌來對(duì)污水中的氮進(jìn)行處理，它們對(duì)氧和營養(yǎng)物質(zhì)的需求明顯不同，限制了生物脫氮的效率，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)生物脫氮的不足，極大地提高了脫氮效率[5-6]。目前已篩選出許多種異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌具有較好的脫氮能力[7-10]。釋磷-吸磷理論是目前被普遍接受的生物除磷理論之一[11]。REY-MARTíNEZ[12]等提出生物除磷工藝，生物除磷工藝具有耗能少，節(jié)約成本，除磷效率較高的優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)在人工濕地養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)中，分離異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌并對(duì)其溫度、pH、氮源、碳源等生長影響因子及菌株脫氮除磷特性進(jìn)行研究，以期加強(qiáng)對(duì)人工濕地中異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌種類和性能的認(rèn)知，為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

稀釋培養(yǎng)基：100 mL 8.5‰生理鹽水，pH 7.0。

維氏鹽溶液（g/L）[4]：5.0 k2HPO4、2.5 MgSO4·7H2O、0.05 FeSO4·7H2O、0.05 MnSO4·4H2O 依次溶于1 L 鹽度為1.5%的海水中。

BTB 初篩培養(yǎng)基（g/L）：0.65 NaNO2、5.66 檸檬酸鈉、50 mL 維氏鹽溶液、依次溶于1 L 蒸餾水中，加入1%溴百里酚藍(lán)1 mL、瓊脂20.0，調(diào)節(jié)pH 7.0。

復(fù)篩培養(yǎng)基（g/L）：5.628 丁二酸鈉、0.382 2 NH4Cl、0.1 MgSO4·7H2O、6.7 Na2HPO4·12H2O、1.0 KH2PO4、微量元素2mL，依次溶于1L 無氨水中，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.4。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基（g/L）：在復(fù)篩培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將丁二酸鈉改為4.0，Na2HPO4·12H2O 為2.310 6，KH2PO4為0.878，其余條件不變。

好氧反硝化培養(yǎng)基（g/L）：在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將0.382 2 NH4Cl 改為0.722 0 KNO3，其余條件不變。

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化培養(yǎng)基（g/L）：在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將0.382 2 NH4Cl 改為0.492 9 NaNO2，其余條件不變。

所有培養(yǎng)基都經(jīng)121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株的富集、分離及鑒定

取底泥樣品、毛刷、石子（源于天津市通洋農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司所建立的人工濕地）分別置于已滅菌的裝有100 mL 8.5‰生理鹽水的錐形瓶中，恒溫?fù)u床上以30 ℃、150 r/min 進(jìn)行培養(yǎng)24 h 后，各取1 mL 菌液，涂布到固體培養(yǎng)基上，每個(gè)涂布三塊，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出單菌落。從平板中挑取形態(tài)不同的菌落，通過平板劃線法純化，倒置放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長出菌落后觀察菌落形態(tài)特點(diǎn)。經(jīng)過多次分離，直到平板上的單菌落形態(tài)一致后，分別挑取1環(huán)，采用平板劃線法接種于BTB 培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基長有菌落的地方是否變藍(lán)，變藍(lán)為目的菌株，將篩出的目的菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基30 ℃，150 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定TN 和可溶性活性磷的含量，對(duì)總氮與可溶性活性磷去除率最高則為復(fù)篩菌株。

菌株經(jīng)革蘭氏染色結(jié)果為陰性菌，利用TIANGEN 的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，提取DNA 后， PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，29 個(gè)循環(huán)，4 ℃，5 min。引物為27F 和1 492R，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（1%）驗(yàn)證，紫外分析儀檢查電泳結(jié)果，后將目的菌株DNA 交由北京六合華大基因科技有限公司完成測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI進(jìn)行Blast 分析，使用MEGA 7.0 軟件的臨位鏈接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3 不同因素對(duì)菌株生長的影響

以異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，溫度設(shè)置為15℃、20℃、25℃、30℃、37℃，pH 設(shè)置為3、5、7、8、9，碳源設(shè)置為丁二酸鈉、乙酸鈉、甘油、檸檬酸鈉、葡萄糖，C/N 設(shè)置為3、5、7、12、15、18、20、25、30，C/N/P 設(shè)置為70∶10∶1、14∶2∶1、7∶1∶1、7∶1∶4、7∶1∶8，取菌液OD600≈1，分別接種1 mL 到100 mL 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速為150 r/min，其余條件保持相同，培養(yǎng)24 h 后測(cè)定OD600值，取OD600最高值設(shè)置條件為最佳生長條件，并重復(fù)試驗(yàn)3 次，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（表1）。

表1 不同因素下目的菌株OD600 值變化

1.4 不同氮源對(duì)目的菌株脫氮除磷性能影響

以異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，分別以NH4Cl、KNO3、NaNO2作為不同氮源，取菌液OD600≈1 分別接種1 mL 于100 mL 培養(yǎng)基中，其余條件保持相同，分別在不同氮源條件下培養(yǎng)24 h，每3 h 測(cè)定OD600值、TN、NH4-N、NO3-N、NO2-N，可溶性活性P，并重復(fù)試驗(yàn)3 次。

1.5 分析方法

OD600測(cè)定采用分光光度計(jì)法、TN 采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法、NH4-N 采用納氏試劑法、NO3-N 采用麝香草酚法分光光度法、NO2-N采用重氮-偶氮光度法，可溶性活性磷采用鉬-銻-抗法。不同因素對(duì)目的菌株生長影響的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 KL1 菌株鑒定

菌株KL1 在LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，菌落圓形，呈米白色且表面光滑，對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA基因PCR 擴(kuò)增，得到長度為2 000 bp 序列。將所獲得菌株KL1 的16S rDNA 基因序列在NCBI 的GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行Blast 分析，并下載相似性比較高的基因，尋找已經(jīng)獲得分類地位的菌種，以MEGA7.0 軟件的臨位鏈接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)菌株KL1 與假單胞菌同源性最高。利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖1 所示，菌株KL1 與假單胞菌屬在同一發(fā)育地位，確定菌株KL1 為假單胞菌屬。

圖1 菌株KL1 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 不同因素對(duì)菌株KL1 生長的影響

2.2.1 pH 和溫度對(duì)菌株KL1 生長的影響

由圖2 可知，隨著溫度增加，OD600值也隨之增加，37℃時(shí)，OD600值最高，菌株生長最佳，隨著pH 增加，OD600值先呈上升趨勢(shì)，后下降。pH為7 時(shí)，生長最好，OD600值為1.059，pH 為3 和9 時(shí)，OD600值分別為0.006 和0.050，菌株KL1 生長量較低。

圖2 不同pH 和溫度對(duì)菌株KL1 生長的影響

2.2.2 氮源和碳源對(duì)菌株KL1 生長的影響

由圖3 可知，24 h 內(nèi)，菌株KL1 以NH4Cl 為唯一氮源，OD600值整體趨勢(shì)高于以KNO3和NaNO2為唯一氮源的OD600值。6～9 h，NH4Cl 為唯一氮源，菌株KL1 的生長速度最快。不同碳源下菌株KL1 對(duì)丁二酸鈉利用最佳，次之為檸檬酸鈉，對(duì)乙酸鈉與葡萄糖利用一般，對(duì)甘油利用最差。

圖3 不同氮源和碳源對(duì)菌株KL1 生長的影響

2.2.3 C/N 和C/N/P 對(duì)菌株KL1 生長的影響

由圖4 可知，隨C/N 增加，菌株KL1 在C/N為7 和18，OD600值出現(xiàn)兩個(gè)峰值。

圖4 不同C/N 對(duì)菌株KL1 生長的影響

由圖5 可知，24h 時(shí)，隨著C/N/P 增加，目的菌株OD600值也隨之增加，其中C/N/P 為7∶1∶4時(shí)，目的菌株生長最優(yōu)，C/N/P 為7∶1∶8，菌株KL1 生長最差。

圖5 不同C/N/P 對(duì)菌株KL1 生長的影響

2.3 氮源對(duì)菌株KL1 脫氮除磷性能的影響

由圖6 可知，NH4Cl 為唯一氮源，隨著菌株生長量增加，氨氮濃度和TN 濃度逐漸下降，21 h，NO2-N 積累濃度為2%（2.466 2 mg/L），NO3-N無積累。24 h，TN 和NH4-N 去除率分別高達(dá)81%（TN 濃度剩余22.763 1 mg/L）和92%（氨氮剩余濃度9.900 4 mg/L），菌細(xì)胞利用氮為58%（70.700 05 mg），轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮為23%（28.54 mg）。

圖6 NH4Cl 為唯一氮源對(duì)菌株KL1 脫氮性能的影響

由圖7 可知，KNO3為唯一氮源，隨著OD600值增加，NO3-N 和TN 濃度明顯下降，NO2-N 積累濃度較少，NH4-N 無積累。24 h，NO2-N 積累濃度為5%（7.398 7 mg/L），TN 去除率為44%（TN 剩余濃度76.193 79 mg/L），NO3-N 去除率為95%（NO3-N剩余濃度6.595 mg/L），細(xì)胞利用氮為36%（48.215 11 mg），轉(zhuǎn)化成氣態(tài)氮為8%（10.591 1 mg）。

圖7 KNO3 為唯一氮源對(duì)菌株KL1 脫氮性能的影響

由圖8 可知，NaNO2作為唯一氮源，隨著OD600值的增大，NO2-N 和TN 濃度隨之下降，NH4-N開始積累，對(duì)TN 和NO2-N 去除率為41%（53.797 mg/L）和56%（73.867 mg/L），菌細(xì)胞利用氮含量為21%（27.545 mg），轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮含量為21%（28.105 7 mg/L），對(duì)TN 去除率和菌細(xì)胞利用的氮較以NH4Cl 和KNO3作為唯一氮源低。

圖8 NaNO2 為唯一氮源對(duì)菌株KL1 脫氮性能的影響

由圖9 可知，NH4Cl 為唯一氮源，對(duì)無機(jī)磷去除率最高，24 h 對(duì)于無機(jī)磷的去除率高達(dá)31%（磷初始濃度為400 mg/L）。不同氮源下，0～6 h內(nèi)，磷濃度呈急劇下降趨勢(shì)，6～24 h 內(nèi)，磷濃度呈上升趨勢(shì)，后呈下降趨勢(shì)。24 h，KNO3、NaNO2為唯一氮源時(shí)，對(duì)無機(jī)磷的去除率分別為29%和26%，較NH4Cl 為唯一氮源對(duì)無機(jī)磷的去除率低。

圖9 不同氮源對(duì)菌株KL1 除磷性能的影響

3 討論

3.1 不同因素對(duì)菌株KL1 生長的影響

3.1.1 溫度和pH 對(duì)菌株KL1 生長的影響

溫度通過影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，以及影響基因調(diào)控，酶活性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝[13-14]，結(jié)果表明，37 ℃為菌株KL1 的較適合生長溫度。與許有燊等[15]在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中篩選出芽孢桿菌的最適生長溫度一致。pH 過高或過低會(huì)降低微生物的酶活性，改變微生物細(xì)胞膜電位，影響微生物的代謝活動(dòng)和營養(yǎng)吸收，從而影響菌株的生長[16-18]，試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 為7時(shí)菌株KL1 生長最好，與蘇兆鵬等[14]提出的大部分HN-AD 菌在中性或是偏堿性環(huán)境下可以很好的生長的結(jié)論一致。

3.1.2 氮源對(duì)菌株KL1 生長的影響

氮是異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌合成自身細(xì)胞生長繁殖所需要的元素之一[19-20]，菌株KL1 以NH4Cl為唯一氮源生長利用最好，次之為KNO3、NaNO2，原因可能為氨氮可以直接作為細(xì)菌合成生物大分子例如蛋白質(zhì)氮源，有學(xué)者認(rèn)為氨氮作為氮源要優(yōu)于硝態(tài)氮[21]，此結(jié)果與蔡茜等的研究相同[22]。

3.1.3 碳源對(duì)菌株KL1 生長的影響

碳源是微生物生命活動(dòng)所需的重要營養(yǎng)物，其構(gòu)成了微生物細(xì)胞的含碳物質(zhì)和供給微生物生長繁殖所需要的能量[23，19]，本文結(jié)果表明丁二酸鈉作為唯一碳源菌株KL1 生長最好，檸檬酸鈉次之，對(duì)乙酸鈉和葡萄糖利用一般，對(duì)甘油利用最差。馮亮等[24，13]提出假單胞菌屬最適碳源為丁二酸鈉，與本研究結(jié)果一致，說明丁二酸鈉可能對(duì)假單胞菌屬生長繁殖方面有良好的應(yīng)用價(jià)值。

3.1.4 C/N 對(duì)菌株KL1 生長的影響

隨著C/N 增加，目的菌在C/N 為7 和18 時(shí)，OD600值出現(xiàn)兩個(gè)峰值，與黃鄭鄭提出的隨著C/N增加對(duì)菌株生長有抑制作用的結(jié)果不同[25]，可能是因?yàn)楸狙芯恳远《徕c為碳源，氯化銨為氮源，與黃鄭鄭使用碳源以及氮源不同，出現(xiàn)兩個(gè)峰值的原因可能是碳源分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)不同，或不同菌株對(duì)唯一氮源中的SO42-和Cl-利用率不同。有研究表明，對(duì)于大多數(shù)HN-AD 菌而言，其最佳C/N 比在8～20，未發(fā)現(xiàn)C/N 為7 和18 時(shí)，OD600出現(xiàn)兩個(gè)峰值[26]。

3.1.5 C/N/P 對(duì)菌株KL1 生長的影響

碳、氮和磷是目的菌合成自身細(xì)胞生長繁殖所需要的元素[19-20]，C/N/P 過低可能不能滿足目的菌株自身生長繁殖的需要，從而生長受到限制，C/N/P 過高，可能使目的菌株不耐受，且過量的碳素、氮素與磷元素會(huì)對(duì)養(yǎng)殖水體造成一定的污染。FOROUZESH 等[27]在不同C/N/P 條件下，就微生物對(duì)脫氮除磷性能的影響做出相關(guān)的試驗(yàn)與討論，但未提出C/N/P 對(duì)微生物生長的影響。

3.2 氮源對(duì)菌株KL1 脫氮性能的影響

菌株KL1 以NH4Cl 為唯一氮源，對(duì)TN 和NH4-N 去除率分別高達(dá)81%和92%，NO3-N 無積累，具有較好的異養(yǎng)硝化能力。NO3-N 無積累可能是細(xì)胞利用AMO 將NH4-N 氧化成羥胺，羥胺經(jīng)HAO 作用轉(zhuǎn)化成NO2-N，最終生成氣態(tài)物質(zhì)N2O 或氮?dú)鈁28]，推測(cè)異養(yǎng)硝化過程的路徑之一為NH4-N→NO2-N→N2，此路徑與XI 等提出的異養(yǎng)硝化過程一致[29]，有一部分氮素被菌細(xì)胞作為生長利用，儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)。

以KNO3為唯一氮源，對(duì)NO3-N 的去除率高達(dá)95%，對(duì)總氮的去除率為44%，但仍有5%NO2-N的積累存在，與王驍靜等[19]篩選的菌株好氧反硝化能力有一定的差距。推測(cè)其好氧反硝化路徑之一可能為NO3-→NO2-→NO→N2O→N2，此結(jié)果與GUPTA 等一致[30]。本試驗(yàn)中出現(xiàn)了NO2-N 的積累，原因可能為菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜上存在硝酸鹽還原酶，NADH 或NADPH 作為電子供體可將NO3-N還原成NO2-N[28]。

NaNO2作為唯一氮源時(shí)，NH4-N 有積累，NO2-N作為異養(yǎng)硝化和好氧反硝化過程中的中間態(tài)，可能轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮[22，27]，NO3-N 幾乎無積累，說明菌株KL1 異養(yǎng)硝化能力要弱于好氧反硝化能力。TN 去除率以及菌細(xì)胞利用的氮素都低于以NH4Cl和KNO3作為唯一氮源，可能NO2-N 本身對(duì)微生物具有毒害作用導(dǎo)致其生長能力以及脫氮能力受到負(fù)面影響，此結(jié)果與ROUT 等研究一致[7]。

3.3 氮源對(duì)KL1 菌株除磷性能的影響

在脫氮除磷系統(tǒng)中，不同的氮源對(duì)反硝化聚磷菌除磷效果的影響存在一定差異[31]。試驗(yàn)結(jié)果表明，0～3 h 內(nèi)，磷濃度急劇下降，可能是因?yàn)榫晟L需要大量利用無機(jī)磷。在好氧的條件下，菌株以游離氧為電子受體，氧化細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的PHB，并利用該反應(yīng)產(chǎn)生的ATP，將無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為多聚磷酸鹽貯存在體內(nèi)[32-33]。6～21 h，磷濃度呈先上升，后下降趨勢(shì)，可能由于菌密度過大，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)氧氣不充足，厭氧時(shí)釋磷并合成大量B-羥基丁酸聚合物[34]，此結(jié)果與曾凡哲等研究一致[35]。NO3-N、NO2-N 為唯一氮源時(shí)，菌株KL1 對(duì)無機(jī)磷的去除率分別為29%和26%，對(duì)NO3-N、NO2-N 去除率分別為95%和56%，說明菌株KL1 具有較好的反硝化除磷能力。呂泳濤等[36]研究發(fā)現(xiàn)，以硝酸鹽為電子受體時(shí)的除磷效率大于亞硝酸鹽。以NH4-N 為唯一氮源時(shí)，對(duì)無機(jī)磷的去除率為31%，說明菌株KL1 兼具較好的異養(yǎng)硝化除磷能力。

4 結(jié)論

在人工濕地尾水處理系統(tǒng)分離出異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株KL1，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA 基因序列分析，確定為假單胞菌屬。菌株KL1 最適溫度范圍為30～37 ℃，最適pH 范圍為5～7，最佳碳源為丁二酸鈉，最佳C/N 范圍為7～18，最佳C/N/P 范圍為（14∶2∶1）～（7∶1∶4）。以NH4Cl 為唯一氮源時(shí)，對(duì)NH4-N 和TN 去除率高達(dá)92%和81%。以KNO3為唯一氮源時(shí)，對(duì)NO3-N和TN 去除率分別為95%和44%。以NO3-N、NO2-N為唯一氮源時(shí)，對(duì)無機(jī)磷的除磷率分別為29%和26%。在人工濕地養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)中分離的菌株KL1 具有較好的脫氮及反硝化除磷能力，有將來應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的巨大潛力。