劉宏宇，白東清，陳麗如，楊廣

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

鹵蟲（Artemia salina）俗稱豐年蝦，屬節(jié)肢動物門，廣泛分布于國內(nèi)外鹽堿性水體中。鹵蟲是一種濾食性的小型低等甲殼動物，對環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，繁殖周期短，易于人工養(yǎng)殖。而且含有豐富的蛋白質(zhì)（50%～60%）、脂肪和高級不飽和脂肪酸。同時(shí)，鹵蟲蟲體大小適宜（0.4～1.5 cm），能滿足不同口裂大小的水生經(jīng)濟(jì)動物幼體攝食需求。因此，二十世紀(jì)三十年代以來，鹵蟲作為優(yōu)質(zhì)天然餌料被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的種苗培育生產(chǎn)中[1]。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，鹵蟲的需求量越來越大，全世界有85%以上的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動物以鹵蟲作為育苗時(shí)主要的餌料[2]。

鹵蟲在惡劣環(huán)境條件下會產(chǎn)生具有較高抗性的休眠卵，休眠卵易于保存和運(yùn)輸，而鹵蟲作為餌料時(shí)主要是其無節(jié)幼體，在利用鹵蟲時(shí)，需要孵化其休眠卵，因此休眠卵的孵化情況成為影響鹵蟲利用率的關(guān)鍵，鹵蟲休眠卵的孵化率通常作為評判鹵蟲卵質(zhì)量優(yōu)劣的重要指數(shù)。國內(nèi)外相關(guān)研究表明鹵蟲卵的孵化與水體溫度、鹽度、pH 值、溶解氧以及光照條件密切相關(guān)[3-4]，孵化條件影響鹵蟲卵的孵出時(shí)間和孵化率。SORGELOOS 等指出用自來水或海水進(jìn)行水化，可以激活休眠卵，從而結(jié)束休眠狀態(tài)[5]，鹵蟲卵在孵化前期進(jìn)行水化處理，也被認(rèn)為是措施之一，何相燕等（淡水、28 ℃、1 h）[6]、胡志杰等（淡水、溫度未知、1 h）[7]、黃鶴忠（自來水、1 h、溫度未知）[8]、SORGELOOS（自來水、28 ℃、1 h）[9]、BHUVANESHWARI等（去離子水、4 ℃、12 h）[10]、王睿等（3.5°Be’孵化液、溫度未知、1 h）[11]、WHEELER 等（鹽度32 的海水、28 ℃、1 h）[12]、代莉（鹽度25 的海水、4 ℃、過夜）[13]先后對鹵蟲卵進(jìn)行過孵化前的水化處理，鐘其旺也將鹵蟲卵用自來水濕潤[14]。但是，有關(guān)水化溫度和時(shí)間對鹵蟲休眠卵孵化情況的影響鮮有人進(jìn)行過系統(tǒng)研究。

提高鹵蟲卵孵化率，縮短幼體孵出時(shí)間，集中幼體孵出時(shí)段，可以有效提高鹵蟲卵的利用效率。本試驗(yàn)基于傳統(tǒng)孵化方法，探索孵化前不同水化處理?xiàng)l件對渤海灣鹵蟲卵孵化的影響，以期為進(jìn)一步優(yōu)化鹵蟲卵的孵化方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用鹵蟲休眠卵為渤海灣鹵蟲卵（由天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖公司生產(chǎn)），置于-20 ℃冰箱冷凍保存，解凍后4 ℃冰箱中密封暫存待用；試驗(yàn)用海水養(yǎng)殖專用鹽（龍蝦鹽）由江西海鼎科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

配制人工海水：將海水晶溶于已曝氣48 h 的自來水（以下用水相同）中，用鹽度計(jì)調(diào)整鹽度至25，置光照培養(yǎng)箱中，28 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鹵蟲卵水化方法：取4 ℃暫存的鹵蟲卵200～500 枚，置于50 mL 燒杯中（燒杯中預(yù)先盛裝約40 mL 曝氣48 h 自來水，并分別于20、25、30、35、40 ℃（記為T20…T40）恒溫水浴中水化處理，每個(gè)溫度的水化持續(xù)的時(shí)間均分為5 組，分別為1、2、3、4、5 h（記為t1…t5），每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)3 個(gè)平行。

水化后鹵蟲卵的孵化：將水化后的鹵蟲卵，用28 ℃人工海水（鹽度25）中沖洗2～3 次，置于培養(yǎng)皿中，并加入適量人工海水，于28 ℃光照培養(yǎng)箱中孵化（24 h 光照）。對照組不經(jīng)水化處理，其余操作與試驗(yàn)組相同。

孵化效果觀察：孵化初期，每小時(shí)顯微觀察1次，并記錄鹵蟲傘期初次出現(xiàn)時(shí)間，至幼蟲孵出后，每2 h 觀察1 次，同時(shí)吸走幼蟲并計(jì)數(shù)。孵化持續(xù)40 h，結(jié)束時(shí)計(jì)數(shù)鹵蟲卵總數(shù)。

孵化效率計(jì)算：試驗(yàn)孵化效率用孵化率和分時(shí)段孵化率表示，計(jì)算方法如下[15]：

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0 和Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05表示顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 水化條件差異對鹵蟲卵總孵化率的影響

水化時(shí)間和溫度對鹵蟲卵的總孵化率均存在一定影響（見表1）。試驗(yàn)選擇的五個(gè)水化溫度中，最高和最低溫度時(shí)，無論水化時(shí)間長短，其卵的總孵化率均低于對照組，溫度偏低時(shí)（T20），水化時(shí)間對總孵化率影響不大，且均低于對照組（79.57±0.07 %）；而T40時(shí)，總孵化率顯著降低，甚至不及對照組的一半，最高僅為（54.25±0.03）%，水化時(shí)間越長，總孵化率越低。但是，T25～T35時(shí)，隨著水化時(shí)間的延長，總孵化率有不斷提高的趨勢，特別是在t4以后，總孵化率明顯高于對照組，最高時(shí)達(dá)到了（87.35±0.06）%（T35t5）。

2.2 不同水化條件對鹵蟲卵孵化時(shí)傘期和幼蟲初始出現(xiàn)時(shí)間的影響

由表2 可知，T20～T35時(shí)鹵蟲孵化至傘期的時(shí)間隨水化時(shí)間延長而縮短，t1～t5傘期出現(xiàn)的時(shí)間從11 h 縮短至6 h；但在T40時(shí)，呈現(xiàn)相反現(xiàn)象，且傘期出現(xiàn)時(shí)間從11 h 增加至19 h。非最高溫度時(shí)，傘期出現(xiàn)時(shí)間相比對照組有不同程度提前，但是，結(jié)合水化本身所用時(shí)間，發(fā)現(xiàn)所用總時(shí)間與對照組（11 h）基本一致，即同溫度條件下水化不同時(shí)間對出現(xiàn)傘期時(shí)間的影響較小。與傘期類似，T20～T35時(shí)，鹵蟲初始孵出時(shí)間隨水化時(shí)間的增加而逐漸提前，相比于對照組（17 h）均有提前（表2）。而T40時(shí)初始孵出時(shí)間則隨水化時(shí)間的增加而延遲，最終達(dá)到23 h。如果從開始水化計(jì)時(shí)，則除最高溫度外，不同水化處理溫度下，鹵蟲初始孵出時(shí)間均存在不同程度提前（0～4 h）的現(xiàn)象。

表2 不同水化方案處理后鹵蟲卵孵化中傘期和幼蟲期初始出現(xiàn)時(shí)間 h

2.3 鹵蟲卵孵出時(shí)間受水化條件影響的結(jié)果

為了避免個(gè)體差異對鹵幼開始孵出時(shí)間點(diǎn)造成的誤差，將鹵幼孵化過程中幼蟲最初5%孵出的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同時(shí)，將95%幼蟲孵出的時(shí)間確定為絕大部分孵出的時(shí)間（見表3）。從鹵蟲卵進(jìn)入28 ℃正式孵化開始計(jì)算時(shí)間，除最高的試驗(yàn)溫度（40 ℃）外，其余各組中最初5%幼蟲和95%幼蟲孵出的時(shí)間較對照組（19 h、29 h）均有明顯縮短，最短達(dá)到11 h（T30t5）、24 h（T30t5）。但與開始出現(xiàn)傘期的時(shí)間規(guī)律類似，如果將水化時(shí)間與孵化時(shí)間累計(jì)，則水化過程對大部分幼蟲孵出時(shí)間影響較小。采取最高的水化溫度，則顯著延長了大部分幼蟲孵出時(shí)間，最長達(dá)到39 h（t5）。

表3 鹵蟲卵孵化完成5%、95%所用時(shí)間 h

為了更直觀了解鹵幼孵出時(shí)的數(shù)量變化趨勢，將不同觀察時(shí)間段的鹵蟲幼蟲孵出情況用圖1～圖5 表示，試驗(yàn)組和對照組中幼體分時(shí)段孵化率呈類似正態(tài)分布。相較于對照組21 h 達(dá)到峰值（26.33±0.01）%，T20、T25時(shí)，峰值出現(xiàn)時(shí)間逐漸提前（0～3 h），但峰值點(diǎn)的幼體占比呈現(xiàn)先上升，從t2后開始下降的趨勢。T30、T35時(shí)，峰值出現(xiàn)時(shí)間除T30t1外逐漸提前（1～7 h），且峰值孵化率也逐漸提高。較低溫度下各組的最高峰值孵化率均略高于對照組。但是，T40時(shí)，峰值出現(xiàn)時(shí)間逐漸延遲，峰值孵化率也逐漸下降，且均偏低。

圖1 20 ℃下水化不同時(shí)間后分時(shí)段孵化率

圖2 25 ℃下水化不同時(shí)間后分時(shí)段孵化率

圖3 30 ℃下水化不同時(shí)間后分時(shí)段孵化率

圖4 35 ℃下水化不同時(shí)間后分時(shí)段孵化率

圖5 40 ℃下水化不同時(shí)間后分時(shí)段孵化率

3 討論

3.1 鹵蟲卵孵化前進(jìn)行水化處理可以縮短孵出時(shí)間

鹵蟲是變溫動物，其生長和繁殖必然受到外界環(huán)境溫度的影響。與其他變溫生物類似，在一定溫度范圍內(nèi)隨著環(huán)境溫度的升高，鹵蟲的發(fā)育加快，而溫度過高可能對卵內(nèi)的組織造成一定程度的損壞，甚至可能出現(xiàn)死卵現(xiàn)象[16-17]。因此，溫度界限對于人們科學(xué)利用鹵蟲卵孵化出的幼體或成體極為重要。

作者認(rèn)為水化也是孵化過程的一部分（即當(dāng)休眠卵接觸水體開始，就被認(rèn)為孵化啟動），水化溫度也必然與孵化進(jìn)程密切相關(guān)。本試驗(yàn)中當(dāng)水化溫度在30 ℃及以下時(shí)，隨著水化時(shí)間的延長，傘期和幼蟲開始出現(xiàn)的時(shí)間均呈明顯提前的趨勢（孵化時(shí)間均低于對照組）。但35 ℃時(shí)，這種差異并不明顯，水化時(shí)間持續(xù)在5 h 時(shí)，總的孵化時(shí)間與對照組相等（即沒有促進(jìn)作用）；而且，在40 ℃時(shí)甚至出現(xiàn)明顯相反的結(jié)果（表2）。這一現(xiàn)象表明30～35 ℃可能是本試驗(yàn)鹵蟲卵水化處理的分界溫度，當(dāng)處理?xiàng)l件為30 ℃、5 h 時(shí)可以有效縮短孵化時(shí)間。

當(dāng)然，不同品系的鹵蟲，其發(fā)育溫度界限存在差異[18]：賈沁賢認(rèn)為當(dāng)溫度超過30 ℃以上，鹵蟲（山西運(yùn)城）的發(fā)育速度開始減緩[19]。因此，確定孵化溫度時(shí)應(yīng)當(dāng)確認(rèn)其溫度界限。

利用含鹽量極低的自來水進(jìn)行鹵蟲的前期水化處理，可以加速鹵蟲的孵化進(jìn)程，其原因是否與鹵蟲卵在低滲溶液中可以加快水的滲透，促進(jìn)卵殼軟化和有機(jī)物溶解而顯現(xiàn)生物學(xué)活性有關(guān)，尚不得而知。

3.2 水化溫度和時(shí)間的交互作用對鹵蟲孵化率存在一定影響

影響鹵蟲卵孵化的因素眾多，蟲卵質(zhì)量和孵化環(huán)境條件影響最大，當(dāng)然環(huán)境因子亦是通過影響卵發(fā)育來實(shí)現(xiàn)，在合適條件下的孵化過程，鹵蟲發(fā)育正常；而不適的條件則可能導(dǎo)致部分弱勢胚胎發(fā)育停滯，或者影響胚胎發(fā)育過程，延長發(fā)育時(shí)間，也或者直接影響幼體質(zhì)量，導(dǎo)致部分幼體不能破殼，從而改變孵化率。溫度是重要的環(huán)境因子，合適的環(huán)境溫度下，胚胎發(fā)育正常，但當(dāng)溫度較低時(shí)，胚胎發(fā)育時(shí)間延長，內(nèi)營養(yǎng)供應(yīng)有限，制約胚胎發(fā)育進(jìn)程，從而影響胚胎質(zhì)量。

孵化前期的水化過程同樣也對孵化率產(chǎn)生影響。而在本試驗(yàn)中，水化溫度為20 ℃時(shí)，孵化率均低于對照組，但溫度上升至25～35 ℃時(shí)，孵化率不斷上升，最高時(shí)顯著超過對照組。

水化時(shí)間對孵化率的影響也較大。胡志杰等認(rèn)為延長水化時(shí)間一定程度上有助于鹵蟲卵孵化率的提高[7]，楊娜等在用自來水浸泡處理鹵蟲卵時(shí)，發(fā)現(xiàn)25 ℃、3～4 h 的孵化率比短時(shí)間有所提高[20]。本試驗(yàn)中，除最高溫度外，其余溫度水化后的鹵蟲卵孵化率隨時(shí)間延長均有增加的趨勢。

相反，如果環(huán)境溫度過高，細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)圖譜會改變，參與細(xì)胞正常功能的基因表達(dá)可能會受到抑制，對與鹵蟲孵化有關(guān)的酶造成影響，從而使孵化率下降。劉鳳岐等認(rèn)為在高溫水中處理鹵蟲卵，會使卵迅速吸收水分，對卵有一定程度損傷[16]；賈沁賢等也發(fā)現(xiàn)鹵蟲在溫度30 ℃后孵化率下降（從70.5%降至52.0%）[19]。本試驗(yàn)中，當(dāng)水化溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，孵化率顯著降低，甚至不及對照組的一半，最高僅為（54.25±0.03）%，而且水化時(shí)間越長，孵化率越低。

綜合水化溫度和水化時(shí)間兩種因素的影響，在一定溫度范圍內(nèi)，適當(dāng)延長水化時(shí)間可以提高鹵蟲卵的孵化率。根據(jù)本試驗(yàn)的研究結(jié)果，使用曝氣自來水，25 ℃、3 h 的水化方案，可以獲得渤海灣鹵蟲卵較高的孵化率，同時(shí)還能適當(dāng)縮短水化時(shí)間。