易元慧，劉艷軍，許丁帆，冉靜

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392）

珍珠梅（Sorbaria sorbifolia），薔薇科（Rosaceae）珍珠梅屬（Sorbaria）落葉灌木，耐寒、耐半陰、抗修剪，且花期長(zhǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)，是華北地區(qū)重要的夏季觀花灌木之一[1-2]。珍珠梅對(duì)煙塵等有害氣體有不同程度的吸收和抗性，并且其揮發(fā)性物質(zhì)具有顯著的殺菌功能[3-4]。此外，珍珠梅還具有較高的藥用價(jià)值、食品精加工的應(yīng)用價(jià)值以及水土保持等功能，在園林、醫(yī)療、藝術(shù)等產(chǎn)業(yè)均有較高的價(jià)值，市場(chǎng)前景廣闊[5-7]。

目前，珍珠梅苗木生產(chǎn)以播種育苗和扦插育苗為主，也可壓條和分株繁殖[8-9]。在規(guī)模化生產(chǎn)中，常規(guī)的播種和扦插育苗不可控因素較多，易受環(huán)境及自身繁殖率和繁殖速度的影響，繁殖周期長(zhǎng)[10]。利用植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)進(jìn)行苗木生產(chǎn)具有繁殖系數(shù)高、繁殖速度快、后代遺傳穩(wěn)定性高、不受外界環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)[11]，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)苗木，并保存優(yōu)良種質(zhì)資源，還可為遺傳轉(zhuǎn)化、優(yōu)良品種培養(yǎng)等研究搭建技術(shù)平臺(tái)。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于珍珠梅組織培養(yǎng)方面的研究較少，董雅茹等[12]和馬生軍等[13]以珍珠梅帶腋芽莖段建立了離體培養(yǎng)體系；陳偉等[14]以華北珍珠梅帶芽莖段為外植體，篩選出適宜的初代、增殖和生根培養(yǎng)基配方。但這些研究中均未涉及生根植株的煉苗和移栽環(huán)節(jié)。生根后組培苗入地移栽是珍珠梅組培快繁技術(shù)體系的一項(xiàng)重要內(nèi)容。因此，在指導(dǎo)生產(chǎn)應(yīng)用上還存在一定的缺陷。本研究以珍珠梅帶腋芽莖段為外植體，通過(guò)篩選最佳消毒時(shí)間、初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基及煉苗移栽方法，以期建立完整高效的珍珠梅組培快繁體系，為珍珠梅苗木大規(guī)模生產(chǎn)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)良好、生長(zhǎng)健壯的珍珠梅植株，于7 月中下旬剪取帶腋芽的新梢枝條，剪去葉片和頂芽，保留葉柄，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

在超凈工作臺(tái)中，將珍珠梅枝條剪成2～3 cm的帶腋芽莖段，每個(gè)莖段帶1 個(gè)腋芽。將莖段用75%酒精浸泡30 s，再用含有效氯2%次氯酸鈉溶液消毒，消毒時(shí)間分別為4、6、8、10、12 min，消毒時(shí)不斷搖動(dòng)，使溶液充分與枝條表面接觸。消毒后用無(wú)菌水清洗3 次，每次10 min，再用無(wú)菌濾紙吸收干莖段表面水分，并剪去兩端褐化部分，接種至1/2 MS 培養(yǎng)基上。每個(gè)消毒時(shí)間接種30 瓶，每瓶1 個(gè)外植體，試驗(yàn)重復(fù)3 次。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)外植體污染率、死亡率和存活率。

1.2.2 初代培養(yǎng)基的篩選及腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)

將消毒后的莖段，接種至1/2MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d 后，剔除污染的外植體，選擇未污染且生長(zhǎng)情況基本一致的外植體，分別接種到WPM、MS、1/2MS、Anderson、B5 5 種不同的初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中均添加GA3 5 mg/L。每種培養(yǎng)基接種15瓶，每瓶接種2 個(gè)莖段，試驗(yàn)重復(fù)3 次，30 d 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)后的腋芽平均生長(zhǎng)量和外植體生長(zhǎng)情況。

1.2.3 增殖培養(yǎng)

當(dāng)腋芽長(zhǎng)到3.0～3.5 cm 時(shí)，在頂部切約3.0 cm的新梢，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的新梢接種至增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基以MS 為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的BA 和IAA。每試驗(yàn)處理接種20 瓶，每瓶接種2 個(gè)新梢，重復(fù)試驗(yàn)3 次。30 d 后統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的增殖系數(shù)及再生芽生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 生根培養(yǎng)

剪取1.5 cm 以上的再生芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IAA或NAA。每個(gè)試驗(yàn)處理接種15 瓶，每瓶中接種2 個(gè)苗，試驗(yàn)重復(fù)3 次。30 d 后觀察每個(gè)處理的生根情況，統(tǒng)計(jì)生根率、平均每株根條數(shù)。

1.2.5 培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基均添加瓊脂7.0 g/L 初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基添加30 g/L 蔗糖，生根培養(yǎng)基添加20 g/L 蔗糖，滅菌前調(diào)節(jié)pH 為5.8～6.0，在121 ℃、0.1 MPa 下滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，24 h 光照，光照強(qiáng)度為2 000 lx。

1.2.6 組培苗的移栽

選取生長(zhǎng)健壯、根系良好的珍珠梅組培苗，自然光下，放置7 d 后將組培苗用鑷子輕輕取出，自來(lái)水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有混合基質(zhì)的雙色育苗缽中，混合基質(zhì)采用V草炭：V蛭石∶V珍珠巖＝1∶1∶1，用500 mL 燒杯扣置植株保濕，每天移除燒杯30 min，15 d 后轉(zhuǎn)入室內(nèi)自然條件下培養(yǎng)，移栽第30 d 統(tǒng)計(jì)組培苗移栽存活率。

1.3 計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析

污染率（%）＝（被污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

存活率（%）＝（腋芽萌發(fā)未污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

死亡率（%）＝（腋芽不萌發(fā)未污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

平均生長(zhǎng)量/cm＝Σ腋芽生長(zhǎng)量/腋芽總數(shù)

增殖系數(shù)＝有效芽數(shù)/接種新稍數(shù)（有效芽為高度大于1 cm 的芽）

生根率（%）＝（生根苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100

平均每株根條數(shù)＝生根植株的總根數(shù)/生根植株數(shù)

移栽成活率（%）＝（成活苗數(shù)/移栽苗數(shù)）×100

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用excel 2013 統(tǒng)計(jì)，SPSS Statistic 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)莖段消毒的影響

在5 個(gè)處理下外植體污染率隨次氯酸鈉消毒時(shí)間的增加而降低，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，處理1、2、3、4 外植體的污染率顯著下降，處理4，5 污染率無(wú)顯著差異。但處理3（8 min 消毒處理）下腋芽存活率顯著高于其他處理，存活率為72.22%。由此得出本試驗(yàn)用次氯酸鈉作為消毒劑的最佳消毒時(shí)間為8 min，存活率為72.22%（表1）。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)莖段消毒的影響

2.2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)珍珠梅腋芽生長(zhǎng)的影響

將消毒8 min 的珍珠梅莖段外植體接入添加GA3 5 mg/L 的5 種不同基本培養(yǎng)基，30 d 后珍珠梅莖段腋芽全部萌發(fā)。從表2 可見(jiàn)，外植體在5種不同基本培養(yǎng)基中平均生長(zhǎng)量存在顯著差異，最高為6.01 cm，最低為1.62 cm；腋芽萌發(fā)后生長(zhǎng)狀況不一，其中以WPM 培養(yǎng)基最佳，平均生長(zhǎng)量為6.01 cm，生長(zhǎng)狀況好，生長(zhǎng)較快，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，Anderson 培養(yǎng)基次之，為5.49 cm，而MS 培養(yǎng)基和B5 培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況則較差，生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)勢(shì)一般，不適宜于珍珠梅的初代培養(yǎng)。

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)珍珠梅腋芽生長(zhǎng)的影響

2.3 不同植物激素組合對(duì)珍珠梅腋芽增殖培養(yǎng)的影響

從表3 可見(jiàn)，不同BA 和IAA 濃度組合處理對(duì)珍珠梅腋芽的增殖系數(shù)有顯著差異。處理1 中不添加任何植物激素，增殖系數(shù)顯著低于其他處理，再生芽生長(zhǎng)情況較差，莖較粗、生長(zhǎng)勢(shì)一般。在培養(yǎng)基中添加一定濃度的植物激素后，腋芽增殖系數(shù)顯著提高，嫩枝長(zhǎng)勢(shì)有明顯變化。處理4中BA 與IAA 配合使用，外植體上腋芽基本全部萌發(fā)，腋芽增殖系數(shù)顯著高于其他處理，增殖系數(shù)達(dá)到8.13，此時(shí)再生芽形成的嫩枝較粗且生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。因此MS＋BA 0.5 mg/L＋I(xiàn)AA 1.0 mg/L 為理想的珍珠梅增殖培養(yǎng)基。

表3 植物激素組合對(duì)珍珠梅腋芽增殖的影響

2.4 不同種類(lèi)和濃度生長(zhǎng)素對(duì)珍珠梅生根的影響

從表4 可見(jiàn)，在不添加生長(zhǎng)素的試驗(yàn)組中，珍珠梅生根率和平均每株根條數(shù)均顯著低于其他處理，且生根速度慢，根無(wú)分枝。在培養(yǎng)基中添加一定濃度的IAA 或NAA 后，珍珠梅生根率顯著提高。相對(duì)于IAA，NAA 的生根效果更好，使用IAA 進(jìn)行生根時(shí)，其生根速度雖然較快，但根上分枝少。使用NAA 的生根率高，均為100%，且不受生長(zhǎng)素濃度的影響。處理4 使用0.25 mg/L 的NAA 生根效果達(dá)到最佳，生根率為100%，平均每株根條數(shù)顯著高于其他處理，達(dá)到12.5 條，且生根快、須根多。組培苗生長(zhǎng)過(guò)程如圖1 所示。

圖1 珍珠梅組培苗生長(zhǎng)過(guò)程圖

表4 不同種類(lèi)和濃度的生長(zhǎng)素對(duì)珍珠梅生根的影響

2.5 組培苗移栽

將珍珠梅組培苗（生根）經(jīng)過(guò)7 d 馴化煉苗后，移栽到V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖＝1∶1∶1 的消毒基質(zhì)中，30 d 后植株生長(zhǎng)良好，移栽存活率高達(dá)90%以上。

3 討論與結(jié)論

外植體消毒是珍珠梅組培快繁的第一步，消毒效果主要由外植體狀態(tài)及老嫩程度、消毒劑及消毒時(shí)間所決定，外植體以旺盛，健壯生長(zhǎng)的春梢為好[15-16]。馬生軍等[13]以珍珠梅帶芽莖段為外植體，采用HgCl2為消毒劑，污染率低、存活率高。但HgCl2毒性大且使用受到嚴(yán)格管控。本試驗(yàn)以次氯酸鈉為消毒劑，在8 min 消毒處理下腋芽污染率僅1.11%，滅菌效果理想，在低污染率下也保證了存活率且毒性小，使用起來(lái)較環(huán)保。

在初代培養(yǎng)階段，本試驗(yàn)比較了WPM、MS、1/2 MS、B5、Anderson 5 種基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)腋芽生長(zhǎng)的影響，表明WPM 培養(yǎng)基對(duì)初代培養(yǎng)效果最好。而陳偉等[14]研究了WPM、MS、B5、N6 這4 種培養(yǎng)基對(duì)珍珠梅初代培養(yǎng)得出MS 培養(yǎng)基中萌芽率最佳。其差異可能是外植體取材時(shí)間、地方不同所造成，或因培養(yǎng)基中添加物不同造成外植體生長(zhǎng)所需的元素以及滲透壓的需求不同。WPM 培養(yǎng)基是通過(guò)MS 培養(yǎng)基改良而來(lái)的，WPM 成分中使用硫酸鉀代替了硝酸鉀，NH4NO3的含量也降低到了MS 培養(yǎng)基的1/4，氮鹽也主要以硝酸鈣的形式提供，更適宜于培養(yǎng)木本植物。

在增殖培養(yǎng)階段，本試驗(yàn)探討了配合使用BA和IAA 能有效提高腋芽增殖系數(shù)，在BA 0.5 mg/L＋I(xiàn)AA 1.0 mg/L 濃度配比下增值系數(shù)高達(dá)8.13，同時(shí)保證植株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，腋芽正常。陳偉等[14]利用不定芽增殖再生而本試驗(yàn)是利用腋芽的增殖完成珍珠梅的快速繁殖，相較于不定芽而言，腋芽是從葉腋所生出的定芽，它所形成的植株具有遺傳穩(wěn)定、繁殖速度快，植株粗壯等優(yōu)點(diǎn)[17-18]。此外發(fā)現(xiàn)使用IAA 濃度過(guò)高會(huì)使得外植體玻璃化并生根，濃度越高此現(xiàn)象越突出。

生根培養(yǎng)中，馬生軍等[13]、陳偉等[14]的研究中發(fā)現(xiàn)，在生根中NAA 和IAA 與IBA 結(jié)合使用的效果都顯著高于各自單獨(dú)使用。本次試驗(yàn)考慮外植體中自身內(nèi)源激素的作用，單獨(dú)使用NAA 對(duì)珍珠梅的生根效果很好，達(dá)到了預(yù)期最佳狀態(tài)。