周禹辰 潘 飛 趙 昕 徐 威

(1. 沈陽工業(yè)大學 機械工程學院,遼寧 沈陽 110870;2. 遼寧省復雜曲面數(shù)控制造技術(shù)重點實驗室,遼寧 沈陽 110870)

遼東楤木又稱刺嫩芽、虎陽刺等,廣泛分布于我國東北地區(qū),其不僅可以觀賞,在藥用方面也有極其顯著的作用[1]。經(jīng)實驗研究發(fā)現(xiàn),遼東楤木在抗衰老、抗氧化、抗炎、抗癌及保肝等方面都有著顯著作用[2]。

遼東楤木中包含著非常多的活性物質(zhì),其中皂苷類化合物作為遼東楤木的主要活性成分,其營養(yǎng)價值更為顯著。但由于皂苷類物質(zhì)種類復雜多樣,還沒有專門針對遼東楤木總皂苷含量測定的國標方法。皂苷是由苷元以及糖鏈相連接而成的化合物,遼東楤木中皂苷類成分的苷元多為齊墩果酸,可將水解后齊墩果酸的含量作為遼東楤木中總皂苷的含量。以齊墩果酸標準品作為對照制作標準曲線,通過標準曲線計算出遼東楤木中皂苷的含量。

本文對硫酸-甲醇比色法、香草醛-濃硫酸比色法和香草醛-高氯酸比色法進行對比分析研究,為遼東楤木總皂苷含量測定方法提供一定的參考。

1 實驗

1.1 試劑及儀器

主要試劑:香草醛,冰醋酸,濃硫酸,高氯酸,無水乙醇,甲醇, 試劑均購自沈陽化學試劑廠;齊墩果酸標準品(110709—200304),中國藥品生物鑒定所生產(chǎn)。

主要儀器:EST500-2電子天平,沈陽天平儀器有限公司;DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;LG0.2真空冷凍干燥機,沈陽新陽航空設(shè)備制造有限公司;WH-A150高速多功能粉碎機,南京好又多電器有限公司;UV-5100紫外分光光度計,上海譜元儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

1.2 遼東楤木總皂苷的提取

選用遼東楤木嫩芽為原料,挑選外觀完整、沒有霉點、沒有破損的遼東楤木嫩芽,清洗后于60 ℃下進行熱風干燥處理。

取60 ℃熱風干燥處理的遼東楤木嫩芽干粉20 g,加入95%的乙醇溶液,固液比1∶15 g·mL-1,在70 ℃下浸提1 h,提取結(jié)束后抽濾,收集濾液,再將濾渣溶于相應濃度的乙醇提取液中提取,重復2次上述操作,收集濾液。5 000 r·min-1離心5 min。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后于-80 ℃條件下預凍后冷凍干燥,將干燥的總皂苷粉末稱重,并置于密封袋中避光保存。

取適量干燥的總皂苷粉末,用甲醇配置成0.2 mg·mL-1的樣品溶液。

1.3 最大吸收波長的確定

1.3.1 硫酸-甲醇比色法

吸取1 mL 0.2 mg·mL-1樣品溶液于帶塞比色管中,加入2 mL濃硫酸,混勻,60 ℃水浴30 min,隨后立即冰浴,向比色管中加入甲醇至10 mL,充分混勻作為樣品溶液,于200 nm～400 nm處進行全波長掃描。

齊墩果酸標準品操作同樣品操作,通過對比樣品和標準品的最大吸收峰來確定測定波長,在最大吸收波長處測量吸光度,以吸光度對濃度做標準曲線。

1.3.2 香草醛-濃硫酸比色法

吸取1 mL 0.2 mg·mL-1樣品溶液于帶塞比色管中,水浴蒸干其溶劑,加入0.2 mL的5%香草醛-乙醇溶液,5.8 mL的72%硫酸,混勻,60 ℃水浴15 min,隨后立即冰浴,于400～900 nm處進行全波長掃描。

齊墩果酸標準品操作同樣品操作,通過對比樣品和標準品的最大吸收峰來確定測定波長,在最大吸收波長處測量吸光度,以吸光度對濃度做標準曲線。

1.3.3 香草醛-高氯酸比色法

吸取1 mL 0.2 mg·mL-1樣品溶液于帶塞比色管中,水浴蒸干其溶劑,向殘渣中加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液,再加入0.8 mL高氯酸,混合均勻,60 ℃水浴15 min, 隨后立即冰浴,再向比色管中加入冰醋酸5 mL,混勻,靜置20 min,在400～900 nm處進行全波長掃描。

齊墩果酸標準品操作同樣品操作,通過對比樣品和標準品的最大吸收峰來確定測定波長,在最大吸收波長處測量吸光度,以吸光度對濃度做標準曲線。

1.4 方法性能的比較

相對標準偏差(RSD)通常用來表示分析實驗結(jié)果的準確程度,RSD值越小,實驗的準確度就越好。通過測定每種方法的精密度、重復性、穩(wěn)定性的RSD值以及三種方法的平均回收率,以探究不同測定方法的準確程度。

1.4.1 精密度的測定

取1 mL 0.2 mg·mL-1齊墩果酸標準溶液,采用硫酸-甲醇比色法、香草醛-濃硫酸比色法和香草醛-高氯酸比色法三種方法,每種方法測定5次吸光度值并計算平均值和RSD值。

1.4.2 重復性的測定

取同一批次的遼東楤木皂苷5份,分別按照上述三種比色法測定每份樣品的皂苷含量,并計算平均值和RSD值。

1.4.3 穩(wěn)定性的測定

分別在硫酸-甲醇比色法、香草醛-濃硫酸比色法及香草醛-高氯酸比色法處理后得到的顯色溶液中取2 mL,每間隔10 min測定一次溶液的吸光度,測定其在60 min內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.4.4 加標回收率的測定

準確吸取0.2 mg·mL-1遼東楤木皂苷樣品溶液1 mL,加入0.2 mg·mL-1的標準品溶液0.1 mL,分別采用硫酸-甲醇比色法、香草醛-濃硫酸比色法和香草醛-高氯酸比色法三種方法,在各自的檢測波長下測定吸光度,通過各自標準曲線計算總皂苷的含量,進行5次平行測定,計算平均回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

分布均勻且平滑的最大吸收波峰可以作為吸收波長用于測定總皂苷含量[4], 實驗結(jié)果表明,不同比色法具有不同的最大吸收波長。圖1、2為硫酸-甲醇比色法樣品與標準品的波長掃描圖,由圖可知,遼東楤木皂苷樣品與齊墩果酸標準品在291 nm處均有最大吸收峰,因此該方法選擇291 nm作為測定波長。

圖2 硫酸-甲醇比色法齊墩果酸波長掃描圖Fig. 2 Scanning spectrum of oleanolic acid in methanol-sulfuric acid colorimetry method

圖3、4為香草醛-濃硫酸比色法標準品與樣品的波長掃描圖,由圖可知,二者峰型略有不同,但大體相似,且最大吸收波長均為540 nm,因此該方法選擇540 nm作為測定波長。

圖3 香草醛-濃硫酸比色法遼東楤木總皂苷波長掃描圖Fig. 3 Scanning spectrum of Aralia elata in vanillin-concentrated sulfuric acid colorimetry method

圖4 香草醛-濃硫酸比色法齊墩果酸波長掃描圖Fig. 4 Scanning spectrum of oleanolic acid in vanillin-concentrated sulfuric acid colorimetry method

圖5、6為香草醛-高氯酸比色法標準品與樣品的波長掃描圖,由圖可知,遼東楤木皂苷樣品最大吸收波長與齊墩果酸標準品一致,均為550 nm,因此該方法選擇550 nm作為測定波長。

圖5 香草醛-高氯酸比色法遼東楤木總皂苷波長掃描圖Fig. 5 Scanning spectrum of Aralia elata in vanillin-perchloric acid colorimetry method

圖6 香草醛-高氯酸比色法齊墩果酸波長掃描圖Fig. 6 Scanning spectrum of oleanolic acid in vanillin-perchloric acid colorimetry method

2.2 標準曲線的建立

硫酸-甲醇比色法回歸方程為y=0.018 5x+0.053 2,相關(guān)系數(shù)R2為0.998 0,濃度在2～18 μg·mL-1時存在良好的線性關(guān)系。香草醛-濃硫酸比色法回歸方程為y=0.016 4x+0.164 3,相關(guān)系數(shù)R2為0.998 7,濃度在2～18 μg·mL-1時存在良好的線性關(guān)系;香草醛-高氯酸比色法回歸方程為y=0.033 2x+0.002 9,相關(guān)系數(shù)R2為0.997 9,試驗濃度在2～18 μg·mL-1時存在良好的線性關(guān)系。

2.3 三種比色法的方法性能測定

表1為三種比色法精密度比較,表2為三種比色法重復性比較,表3為三種比色法穩(wěn)定性比較,表4為三種比色法平均回收率比較,通過表1、表2、表3、表4分析上述三種方法的性能可以發(fā)現(xiàn),3種比色法中,香草醛-高氯酸比色法重復性較差,而硫酸-甲醇比色法的精密度、重復性及穩(wěn)定性相對較好,且平均回收率達到了99.7%,測量出的數(shù)據(jù)相對準確,分析原因可能因為該顯色反應是香草醛的醛基與皂苷苷元上的羥基反應,形成新的共軛體系從而發(fā)生顯色反應,但皂苷苷元連接的糖可能存在未被完全水解,或水解下來的糖可能影響體系的反應,因此香草醛-高氯酸比色法和香草醛-濃硫酸比色法均缺乏穩(wěn)定性。

表1 三種比色法精密度比較Tab. 1 Comparison of precision among three colorimetric methods

表2 三種比色法重復性比較Tab. 2 Comparison of repeatability of three colorimetric methods

表3 三種比色法穩(wěn)定性比較Tab. 3 Comparison of stability among three colorimetric methods

表4 三種比色法平均回收率比較Tab. 4 Comparison of average recovery rates among three colorimetric methods

利用濃硫酸作為顯色劑則是利用皂苷的糖基與濃硫酸反應形成糠醛衍生物從而發(fā)生顯色反應,該方法受其他因素影響較小,該方法的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性都優(yōu)于其他方法,因此可選用硫酸-甲醇比色法測定遼東楤木總皂苷的含量。

3 結(jié)論

實驗得出硫酸-甲醇比色法、香草醛-濃硫酸比色法、香草醛-高氯酸比色法的最大吸收波長分別為291 nm、540 nm、550 nm,對比三種比色法的方法性能可知,硫酸-甲醇比色法的精密度、重復性及穩(wěn)定性相對較好,且平均回收率高,該方法可為遼東楤木皂苷的測定提供參考。