張 昭,金琪凡,史彥欣,段曉桐,閆慧芳*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,山東 青島 266109;2.黃河三角洲草地資源與生態(tài)國家林業(yè)和草原局重點實驗室,山東 青島 266109;3.青島市灘涂鹽堿地特色植物種質(zhì)創(chuàng)制與利用重點實驗室,山東 青島 266109)

種子萌發(fā)是植物整個生命周期中最關(guān)鍵的階段,也是對環(huán)境因子響應最敏感的時期[1]。作為種子萌發(fā)過程的重要環(huán)境因子,溫度影響了大部分的種子萌發(fā)相關(guān)生理生化反應事件[2-3]。低溫冷害是常見于晚秋或早春的主要農(nóng)業(yè)氣象災害[4],也是植物生命周期中極易遭受的非生物脅迫因子,嚴重限制了植物的地理分布、生長發(fā)育和產(chǎn)量[5-6]。當溫度低于種子萌發(fā)適宜溫度時,種子萌發(fā)受到抑制,萌發(fā)速率減慢,種子活力和幼苗生長特性均受到一定程度影響[7]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上栽培歷史最悠久、種植面積最大的重要豆科牧草,具有適應范圍廣,產(chǎn)草量高,蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)豐富等特性[8]。在我國,紫花苜蓿主要栽培區(qū)域集中在北方地區(qū),且通常于晚秋或早春季節(jié)播種,但由于溫度低及倒春寒現(xiàn)象,致使其因種子萌發(fā)緩慢、出苗率低而制約田間成功建植,進而影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。此外,不同品種紫花苜蓿種子的萌發(fā)特性及萌發(fā)期對低溫的抵抗能力也存在差異[10]。近年來,盡管紫花苜蓿種子的低溫萌發(fā)和幼苗生長特性已被研究報道[7-13],但關(guān)于不同品種種子對低溫脅迫萌發(fā)響應的差異比較與綜合評價還較少。因此,深入探究紫花苜蓿種子在低溫條件下的萌發(fā)和幼苗生長特性,據(jù)此綜合比較并評價不同品種種子的耐低溫萌發(fā)能力,對其田間播種、成功建植、栽培生產(chǎn)十分重要,也對其適應性品種篩選、推廣及人工草地擴大種植具有重要指導意義。

本研究以22個品種紫花苜蓿種子為試驗材料,通過測定各品種在標準發(fā)芽溫度(20℃)和低溫(10℃)下的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、苗長、根長等9個種子萌發(fā)和幼苗生長特性相關(guān)指標,分析比較不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長對低溫脅迫的響應差異,并對不同品種種子萌發(fā)期的耐低溫性進行綜合評價,以期為紫花苜蓿耐低溫種質(zhì)篩選、低溫響應基因挖掘以及耐低溫新品種培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紫花苜蓿種子材料包括22個品種,于2020年收獲后均保存于—20℃冰箱內(nèi)備用(表1)。本試驗于2022年11月—2023年2月在青島農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院實驗室進行。

表1 22個供試紫花苜蓿品種基本信息Table 1 Basic information of the 22 tested alfalfa varieties

1.2 試驗設計與方法

本試驗設置標準發(fā)芽溫度(20℃,即對照CK)和低溫脅迫(10℃)兩種處理對上述22個品種的紫花苜蓿種子進行萌發(fā)試驗與幼苗生長特性測定。挑選均勻飽滿、大小一致的紫花苜蓿種子50粒,將其均勻放置于鋪有3層濾紙的11 cm×11 cm有蓋培養(yǎng)皿中,濾紙用10 mL蒸餾水潤濕,每個處理設3次重復。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱(GXZ-380B)中,分別在20℃和10℃、光照8 h/黑暗16 h條件下培養(yǎng)10 d。種子萌發(fā)期間,每天觀察統(tǒng)計種子發(fā)芽和幼苗生長情況,并定時補充蒸發(fā)散失的水分,以維持種子萌發(fā)和幼苗生長所需。

1.3 指標測定

以胚根突破種皮至少2 mm作為種子萌發(fā)標準,以正常種苗形態(tài)建成作為成苗標準,每天觀察統(tǒng)計種子萌發(fā)和成苗情況。根據(jù)每天種子萌發(fā)和成苗統(tǒng)計,分別于第4 d計算種子發(fā)芽勢(Germination energy,GE)、第10 d計算種子發(fā)芽率(Germination percentage,GP)和成苗率(Seedling percentage,SP)。待第10 d發(fā)芽結(jié)束后,每個培養(yǎng)皿隨機選取10株正常種苗,用刻度尺測定苗長(Shoot length,SL)和根長(Root length,RL),并用天平稱量幼苗鮮重(Seedling fresh weight,SFW)。此外,計算種子發(fā)芽指數(shù)(Germination index,GI)、種子活力指數(shù)(Vigor index,VI)和幼苗活力指數(shù)(Seedling vigor index,SVI)。

發(fā)芽勢(GE)=(N4/N)×100%

發(fā)芽率(GP)=(N10/N)×100%

成苗率(SP)=(G10/N)×100%

種子發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Nt/Dt)

種子活力指數(shù)(VI)=(∑Nt/Dt)×SFW

幼苗活力指數(shù)(SVI)=(SL+RL)×SP

上述公式中,N4和N10分別為第4 d和第10 d統(tǒng)計時的萌發(fā)種子數(shù),G10為第10 d統(tǒng)計時的正常種苗數(shù),N為供試種子總數(shù),Nt為第td統(tǒng)計時的萌發(fā)種子數(shù),Dt為萌發(fā)天數(shù)。

1.4 耐低溫性綜合評價

采用耐冷系數(shù)(Cold tolerance coefficient,CTC)、綜合耐冷系數(shù)(Comprehensive cold tolerance coefficient,CCTC)、隸屬函數(shù)、系統(tǒng)聚類分析的綜合評價方法[14]對22個供試品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性進行評價。

耐冷系數(shù)(CTC)=低溫脅迫條件的指標平均值/常溫條件的指標平均值

參考韓瑞宏等[15]的方法,以供試品種各指標測定值為依據(jù),采用隸屬函數(shù)法對22個品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性進行綜合評價。同時,基于綜合耐冷系數(shù)和隸屬函數(shù)值,采用歐氏距離中的組間連接法進行系統(tǒng)聚類分析。

μ(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin),i=1,2,3……n

式中,μ(Xi)為某一測定指標的模糊隸屬函數(shù)值平均值;當指標與種子萌發(fā)耐低溫性成負相關(guān)時用1-μ(Xi)表示;X為某一測定指標平均值;Xmax和Xmin分別為某一測定指標的最大值和最小值。再將各品種種子的各測定指標隸屬函數(shù)值累加,求隸屬函數(shù)平均值,值越大表示紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性越強。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2021軟件進行數(shù)據(jù)整理,SPSS 25.0軟件進行顯著性統(tǒng)計分析與聚類分析。所有數(shù)值均以3個重復的“平均值±標準誤”(Mean±SE)表示,并用單因素方差分析(ANOVA)檢驗計算相關(guān)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性的差異比較分析

相比于CK,低溫脅迫后各項測定指標的平均值均有所下降,且在不同品種間存在明顯差異,達到極顯著水平(P<0.01),說明低溫脅迫對紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長特性所有測定指標影響顯著。

標準萌發(fā)溫度下各測定指標的變異系數(shù)范圍為2.16%～19.49%,而低溫脅迫下各測定指標的變異系數(shù)范圍為2.38%～20.72%,表明不同測定指標所受低溫脅迫的抑制程度存在差異。低溫脅迫下,紫花苜蓿種子活力指數(shù)與幼苗活力指數(shù)所受影響較大,下降幅度分別為69.05%和63.55%,而種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率所受影響較小,下降幅度分別為4.15%和1.08%(表2)?；诖?不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的耐低溫性存在差異,可進一步利用其他統(tǒng)計分析方法對其進行分析與綜合評價。

表2 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標相關(guān)統(tǒng)計參數(shù)Table 2 Statistical parameters related to various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.2 不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期測定指標的耐冷系數(shù)分析

根據(jù)CK和低溫脅迫條件下各測定指標值,計算各品種測定指標的耐冷系數(shù)和綜合耐冷系數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),各品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期對低溫脅迫的耐受程度不同,其中‘賽迪10號’的綜合耐冷系數(shù)最大,為0.683;而‘英斯特’的綜合耐冷系數(shù)最小,為0.523,且各項測定指標的耐冷系數(shù)值也均小于‘賽迪10號’,表明‘賽迪10號’種子萌發(fā)期耐低溫性最強,而‘英斯特’種子萌發(fā)期耐低溫性最弱(表3)。

表3 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標的耐冷系數(shù)Table 3 Cold tolerance coefficient of various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.3 不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期測定指標的隸屬函數(shù)分析

以供試品種各指標測定值為依據(jù),計算各品種測定指標的隸屬函數(shù),以比較22個品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的耐低溫性差異。其中,隸屬函數(shù)平均值越大,說明種子萌發(fā)期的耐低溫性越強。結(jié)果發(fā)現(xiàn),低溫脅迫后,‘賽迪10號’各測定指標的隸屬函數(shù)平均值最大,為0.789,而‘英斯特’‘金皇后’‘巨能401’各測定指標的隸屬函數(shù)平均值最小,分別為0.318,0.313,0.313,表明‘賽迪10號’種子萌發(fā)期耐低溫性最強,而‘英斯特’‘金皇后’‘巨能401’種子萌發(fā)期耐低溫性較弱(表4)。

表4 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標的隸屬函數(shù)Table 4 Membership functions of various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.4 紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性綜合評價

根據(jù)綜合耐冷系數(shù),通過系統(tǒng)聚類分析將22個供試品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性劃分為4個類型,其中,強耐低溫性品種1個,占供試品種的4.55%,為‘賽迪10號’;中耐低溫性品種11個,占供試品種的50.00%;弱耐低溫性品種7個,占供試品種的31.82%;低溫敏感性品種3個,占供試品種的13.64%,為‘金皇后’‘巨能995’和‘英斯特’(圖1A)。

根據(jù)隸屬函數(shù),通過系統(tǒng)聚類分析將22個供試品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性劃分為4個類型,其中,強耐低溫性品種1個,占供試品種的4.55%,為‘賽迪10號’;中耐低溫性品種6個,占供試品種的27.27%;弱耐低溫性品種11個,占供試品種的50.00%;低溫敏感性品種4個,占供試品種的18.18%,為‘巨能995’‘金皇后’‘巨能401’和‘英斯特’(圖1B)。

圖1 基于綜合耐冷系數(shù)(A)與隸屬函數(shù)(B)的系統(tǒng)聚類分析Fig.1 Cluster analysis based on comprehensive cold tolerance coefficient (Panel A) and membership function (Panel B)注：類型Ⅰ,強耐低溫性;類型Ⅱ,中耐低溫性;類型Ⅲ,弱耐低溫性;類型Ⅳ,低溫敏感性Note：Type Ⅰ,strong low temperature tolerance;Type Ⅱ,medium low temperature tolerance;Type Ⅲ,weak low temperature tolerance;Type Ⅳ,low temperature sensitivity

因此,根據(jù)各品種測定指標的綜合耐冷系數(shù)(表3)和隸屬函數(shù)(表4),結(jié)合聚類分析結(jié)果,將供試紫花苜蓿種子萌發(fā)期相對耐低溫等級劃分為4類,分別為強耐低溫性、中耐低溫性、弱耐低溫性和低溫敏感性(表5)。

表5 供試紫花苜蓿種子萌發(fā)期相對耐低溫等級劃分Table 5 Classification of relative low temperature tolerance of different varieties of tested alfalfa during seed germination

基于綜合耐冷系數(shù)與隸屬函數(shù)兩種評價方法,以結(jié)果中重復出現(xiàn)(即在兩種評價方法中均被鑒定到)為依據(jù)進行綜合評價,篩選出強耐低溫性品種1個,為‘賽迪10號’;低溫敏感性品種3個,為‘金皇后’‘巨能995’和‘英斯特’。然而,進一步分析發(fā)現(xiàn),低溫敏感性品種中,‘英斯特’的綜合耐冷系數(shù)值最低(為0.523),且其種子萌發(fā)與幼苗生長特性各項指標的隸屬函數(shù)平均值與‘巨能995’‘金皇后’相差不大,因此,確定紫花苜蓿種子萌發(fā)期的低溫敏感性品種為‘英斯特’。

3 討論

種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的起始階段,也是整個生命周期中最關(guān)鍵的時期[16]。種子萌發(fā)不僅與種子本身的生物學特性有關(guān),還與周圍環(huán)境(如水分、氧氣和溫度等)密切相關(guān)。溫度是影響種子萌發(fā)的關(guān)鍵環(huán)境因素,適宜溫度下,種子吸脹速率和萌發(fā)進程較快,而溫度過低則會導致種子吸脹速率減慢,萌發(fā)進程受阻[17]。研究表明,發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、簡化活力指數(shù)、根長、苗長、可溶性糖、淀粉等指標可以反映紫花苜蓿種子在低溫脅迫下的種子活力和幼苗生長特性[10-11,18-19]。本研究利用發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)、成苗率、苗長、根長、幼苗鮮重和幼苗活力指數(shù)9個指標進行紫花苜蓿種子萌發(fā)期耐低溫性綜合評價,結(jié)果發(fā)現(xiàn),各項測定指標的平均值在低溫脅迫下均有所下降,且在不同品種間的差異均達到極顯著水平(表2),表明這些指標能夠全面地反映不同品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期對低溫脅迫的耐受性差異,可以提高鑒定結(jié)果的可靠性。

研究表明,低溫脅迫導致紫花苜蓿種子發(fā)芽率顯著降低,發(fā)芽時間延長,幼苗生長緩慢,細胞生理代謝受阻[20-22]。向上等[23]研究20個品種紫花苜蓿種子在4℃和8℃低溫脅迫下的萌發(fā)特性也發(fā)現(xiàn),各品種種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及苗長均顯著降低,發(fā)芽時間延長。本研究中,低溫脅迫下22個品種紫花苜蓿種子各項萌發(fā)相關(guān)測定指標的平均值均低于CK的平均值,且在品種間的下降程度不同,其中種子活力指數(shù)和幼苗活力指數(shù)變化較大,而發(fā)芽勢與發(fā)芽率變化較小,這可能是因為低溫下種子生理代謝活動受到抑制,正常幼苗形態(tài)建成受阻,說明低溫脅迫對不同品種種子的萌發(fā)和幼苗生長相關(guān)指標的抑制作用存在差異(表2)。此外,種子發(fā)芽勢的高低表征了種子萌發(fā)過程中發(fā)芽種子數(shù)達到高峰的快慢。本研究中,低溫脅迫導致不同品種紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢明顯降低,表明發(fā)芽高峰期隨溫度降低而延后。王曉龍等[10]研究發(fā)現(xiàn),紫花苜蓿種子萌發(fā)時對低溫脅迫具有一定耐受作用,且6℃為其種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)折點,溫度過低可能會因種子呼吸作用、貯藏物質(zhì)分解代謝等生理活動減弱而抑制種子萌發(fā)[12]。盡管前人研究曾采用4℃或10℃作為紫花苜蓿種子萌發(fā)的低溫脅迫處理溫度[11-12,18,20,23-24],但事實上,在4℃溫度條件下種子僅能露白萌發(fā),而不能完成正常幼苗的形態(tài)建成(預試驗結(jié)果,未發(fā)表)。因此,本研究選用10℃作為紫花苜蓿種子響應低溫脅迫的處理溫度,且該溫度對不同品種的成苗率和幼苗活力指數(shù)影響較大,植株生長較弱,這與高茜等[20]研究結(jié)果相一致。

種子萌發(fā)期對低溫脅迫的響應受多種因素影響,單一指標難以真實地反映出種子的耐低溫萌發(fā)能力,因此,需采用適宜的測定指標和多元評價方法進行綜合分析,以提高結(jié)果準確性[11]。賈祥等[18]利用隸屬函數(shù)法綜合評價了4種豆科牧草種子萌發(fā)期對低溫脅迫的響應,向上等[23]利用打分法對低溫脅迫下20個品種紫花苜蓿種子的發(fā)芽特征進行綜合評價,而侯龍魚等[12]則采用主成分分析法對6個品種紫花苜蓿種子的耐低溫萌發(fā)能力進行評價與篩選。本研究基于綜合耐冷系數(shù)和隸屬函數(shù)方法對22個品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的耐低溫性進行了綜合評價,初步確定‘賽迪10號’為強耐低溫性品種、‘英斯特’為低溫敏感性品種。實際生產(chǎn)中,仍需進一步在晚秋或早春季節(jié)對篩選的品種進行田間播種以驗證并加以利用。此外,針對強耐低溫性品種和低溫敏感性品種紫花苜蓿種子萌發(fā)期的不同階段進行測序分析,挖掘耐低溫關(guān)鍵候選基因,為紫花苜蓿種質(zhì)遺傳改良與耐低溫新品種培育提供理論基礎。

4 結(jié)論

低溫脅迫下,22個供試紫花苜蓿品種的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)、成苗率、苗長、根長、苗鮮重、幼苗活力指數(shù)均呈下降趨勢,其中種子活力指數(shù)和幼苗活力指數(shù)所受影響較大,而發(fā)芽勢和發(fā)芽率所受影響較小?；诰C合耐冷系數(shù)與隸屬函數(shù)進行系統(tǒng)聚類分析,將22個品種紫花苜蓿劃分為4個不同耐低溫類型,并篩選出強耐低溫性品種為‘賽迪10號’、低溫敏感性品種為‘英斯特’。