宋志鋼,劉 穎,劉 瑞,盧少云*

(1.華南農業(yè)大學生命科學學院,廣東 廣州 510642;2.青海大學農牧學院,青海 西寧 810016)

植物在生長發(fā)育過程中會受到各種不利的環(huán)境脅迫,如高鹽、干旱、寒冷和病原體等。為了應對環(huán)境的波動以完成完整的生命周期,植物進化出了復雜的信號轉導途徑。鈣是植物細胞信號轉導中重要的第二信使,能夠將外界信號轉化為胞內信息,從而對特定的環(huán)境刺激做出相應的反應[1]。當植物遭受到環(huán)境脅迫后,以游離Ca2+的瞬時變化作為信號將外界環(huán)境信息傳遞到植物細胞內。這種Ca2+信號首先被鈣離子感受器感知解碼,再將信號向下游傳遞。高等植物的鈣感受器已知有三類：鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)、鈣調素(Calmodulins,CaMs)/類鈣調素蛋白(Calmodulin-like proteins,CMLs)、類鈣調磷酸酶B蛋白(Calcineurin B-like proteins,CBLs)[2-3]。CBL是一類獨特的鈣感受器,CBLs自身沒有酶活性,因此在它結合Ca2+后,還需要與其下游互作蛋白CIPKs(CBL-interacting protein kinases)結合才能發(fā)揮應有的生物學功能[4]。CBLs和CIPKs共同形成了以Ca2+介導的CBL-CIPK網(wǎng)絡,這是近十幾年來植物逆境信號轉導的研究熱點之一[5]。

CIPKs蛋白主要包含兩個結構域：N端激酶結構域(Kinase domain)和C端調節(jié)結構域(NAF domain)。N端激酶結構域內有一個激活環(huán)(Activation loop),磷酸化激活環(huán)可激活蛋白激酶的活性。C端調節(jié)結構域內有一個保守的NAF結構域,NAF結構域既與CIPK分子內部的自我抑制相關,又可以與CBL特異性結合[6-7]。在NAF鄰近位置有一個相對保守的PPI基序(Protein phosphatase interaction motif)能夠與2C型蛋白磷酸酶(Protein phoshphatase 2C)之間發(fā)生蛋白互作[8]。

作為植物特有的Ca2+信號傳導網(wǎng)絡,CBL-CIPK信號網(wǎng)絡在植物的生長發(fā)育、生殖及逆境響應等方面都發(fā)揮著極其重要的作用。許多CBL或CIPK通過調控植物體內Na+/K+和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)平衡,參與植物對鹽脅迫的響應,例如玉米(Zeamays)ZmCIPK21[9]、小麥(Triticumaestivum)TaCIPK24[10]、大豆(Glycinemax)GmCIPK10[11]等均參與了對鹽脅迫的響應。隨著對CBL-CIPK信號系統(tǒng)研究的深入,發(fā)現(xiàn)了越來越多的CBL和CIPK蛋白參與調控植物對各種逆境脅迫的響應。除鹽脅迫以外,CBL、CIPK也參與對其它逆境的響應。擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCBL1-AtCIPK7,水稻(Oryzasativa)OsCIPK1和OsCIPK3參與植物對冷脅迫的響應[12-13],番茄(Solanumlycopersicum)SlCBL10-SlCIPK6參與植物對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)病原的免疫反應[14]。同一個CBL或CIPK蛋白可以參與植物不同逆境的響應,比如過表達MdCIPK6L同時增強了轉基因植株的耐鹽性、耐旱性和抗冷性[15],OsCIPK15同時參與植物對鹽、低氧脅迫和微生物病原的響應[16]。過表達水稻OsCIPK3提升植株對冷的耐受力,但會導致轉基因植株對鹽敏感[12,17]。大量的研究結果證明了CBL-CIPK具有多種多樣的抗逆功能,對CBL-CIPK信號成分的挖掘和鑒定,不僅有助于解析植物在逆境脅迫應答的分子機制,同時為基因工程改良作物的抗逆性提供了基因資源。

鹽生植物海雀稗(Paspalumsvaginatium)是禾本科(Gramineae)黍族(Paniceae)雀稗屬(Paspalum)的一種多年生草本植物[18]。海雀稗兼具多種優(yōu)良特性,如耐鹽、耐澇、耐踐踏和耐修剪等,對極端酸性土壤、堿性土壤等非生物脅迫也具有較高的耐性[18]。目前對海雀稗的研究主要集中在種間或品種間的耐逆性評價[19-20],在海雀稗關鍵耐鹽基因的克隆和功能研究方面較少[21],因此挖掘海雀稗的耐鹽基因資源,揭示海雀稗耐鹽分子機制迫在眉睫。

實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在海雀稗鹽脅迫轉錄組數(shù)據(jù)中,PvCIPK9基因可能參與響應鹽脅迫。為了深入研究PvCIPK9基因,克隆得到了PvCIPK9序列全長,并對其蛋白理化性質、結構特點等進行了分析和預測。為驗證PvCIPK9基因在抗逆中的作用,本研究構建了過表達載體并轉化擬南芥,獲得了過表達PvCIPK9擬南芥植株,驗證了過表達PvCIPK9對擬南芥耐鹽性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海雀稗(PaspalumvaginatumO.Swartz)品種‘Sea Spray’植株及擬南芥野生型(Col-0)種子為本實驗室保存。

1.2 海雀稗PvCIPK9基因克隆與生物信息學分析

本研究以海雀稗的轉錄組數(shù)據(jù)庫的序列為參考序列,設計特異性引物,以海雀稗cDNA為模板,利用PCR擴增PvCIPK9基因CDS序列。采用生物信息學網(wǎng)站(https：//web.expasy.org/protparam/)分析該蛋白的理化性質。根據(jù)在線網(wǎng)站SignalP-4.1(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)對PvCIPK9進行信號肽結構預測,使用在線網(wǎng)站TMHMM-2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測PvCIPK9蛋白的跨膜結構域。利用在線軟件SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)進行同源建模。使用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行保守結構域預測。從NCBI網(wǎng)站獲取模式植物擬南芥和水稻的CIPK家族蛋白序列,使用軟件MEGA7.0構建系統(tǒng)進化樹,構建方法使用鄰接法。

1.3 啟動子元件分析

通過植物基因組網(wǎng)站(https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/)獲取PvCIPK9基因上游約1 500 bp序列,利用PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對PvCIPK9基因啟動子序列進行分析。

1.4 PvCIPK9基因表達模式分析

參照Zhang等[22]的方法,構建PvCIPK9與GFP融合表達載體,以mCherry作為Marker蛋白,同時轉化水稻原生質體,28℃黑暗條件下培養(yǎng)20～24 h后,利用熒光顯微鏡下觀察GFP和mCherry熒光。其中GFP的激發(fā)光和發(fā)射光分別為488 nm和507 nm,mCherry的激發(fā)光和發(fā)射光分別為587 nm和610 nm。

取長勢良好且一致的海雀稗幼苗,洗凈根部泥土,置于1/2霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)一周左右。使用含200 mmol·L-1NaCl的營養(yǎng)液中進行鹽處理,以不含NaCl的營養(yǎng)液為對照,在處理2,6,12,24 h時分別對根和葉進行取樣,液氮速凍后于-80℃冰箱中保存,待提RNA。

選取生長健壯的海雀稗精心培養(yǎng)至抽穗開花,對海雀稗的根、莖、葉、小穗進行取樣,液氮速凍后保存在-80℃冰箱中,待提RNA。

使用RNA提取試劑盒RNAiso plus(9109,Takara)進行植物總RNA的提取。使用反轉錄試劑盒(RR047A,Takara)進行反應,獲得第一鏈cDNA。以cDNA為模板,參照qRT-PCR試劑盒Tli RNaseH Plus(RR820A,Takara)使用說明書,將反應組分離心混勻后使用熒光定量PCR儀進行擴增,反應程序為：95℃ 3 min;95℃ 5 s,55℃ 30 s,進行39個循環(huán);插入熔解曲線65℃ 5 s,95℃ 5 s。反應結束后確認擴增曲線和熔解曲線,以海雀稗Actin作為內參基因計算基因的相對表達量,數(shù)據(jù)由軟件Bio-Rad CFX Manager(Version3.0)分析并收集。

1.5 植物表達載體構建及擬南芥轉化

設計含有Xba I和Bamh I酶切位點的引物(表1),擴增PvCIPK9基因CDS序列,得到帶有酶切位點的目的基因片段。用Xba I和Bamh I雙酶切該基因片段和pCAMBIA3301質粒載體,經T4 DNA連接酶連接,將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,經PCR驗證,挑選陽性克隆送生物公司測序,將測序正確的pCAMBIA3301重組質粒轉化農桿菌感受態(tài)EHA105。用花序侵染法轉化野生型擬南芥,在含有Basta的培養(yǎng)基篩選轉基因抗性植株,使用CTAB抽提法提取DNA,通過PCR法鑒定轉基因植株陽性苗。再經過自交和篩選后得到T3代轉基因擬南芥,用于后續(xù)試驗。

1.6 轉基因擬南芥的耐鹽性分析

挑選籽粒飽滿、大小均勻的擬南芥種子,放于2 mL離心管內。在超凈工作臺內,加入75%乙醇消毒5 min,滅菌水清洗。加入15%次氯酸鈉溶液消毒15 min期間須多次振蕩。使用無菌水沖洗6～8次。將消毒后的種子均勻的點在1/2 MS培養(yǎng)基上,放于4℃冰箱春化處理2～3 d。將培養(yǎng)皿置于溫度25℃,光暗周期為16 h∶8 h,光照為200 μmol·m-2·s-1的人工智能培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d的幼苗,選擇長勢一致的幼苗轉至土壤中培養(yǎng)。將生長三周左右的幼苗進行鹽處理,先用50 mmol·L-1NaCl澆灌4天,再把處理濃度提高至100 mmol·L-1NaCl,觀察擬南芥生長表型。

1.6.1種子萌發(fā)率 取野生型和2個轉基因株系,消毒處理后,無菌水清洗種子,分別播種于1/2 MS培養(yǎng)基(對照)和含有100 mmol·L-1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基(鹽脅迫),每皿播種40粒種子,三次重復。春化三天后,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察并統(tǒng)計種子萌發(fā)情況,連續(xù)統(tǒng)計5天,計算萌發(fā)率。以種子萌發(fā)突破種皮露白5 mm視為萌發(fā)。

1.6.2相對生長量 取WT和2個轉基因株系進行消毒,無菌水清洗種子,然后播種于1/2 MS培養(yǎng)基上。播種7天后,取長勢一致的幼苗移到培養(yǎng)瓶中,內含等量的1/2MS培養(yǎng)基(分別含有0,100,150 mmol·L-1NaCl),每瓶放5株,光下生長20 d后,分別稱根系鮮重和地上部鮮重,計算整株鮮重、相對生長量。

1.6.3抗氧化酶活性 粗酶液提?。喝?.1 g擬南芥葉片,加入2 mL的緩沖液(SOD、CAT緩沖液(50 mM PBS含1%的PVP,pH7.8)、APX緩沖液(50 mmol·L-1PBS含15 mmol·L-1AsA,0.1 mmol·L-1EDTA,1%的PVP,pH值7.0)),冰上研磨成勻漿,4℃,12 000 r·min-1離心10 min,上清液即為酶的粗提液。參照Chen和Zhuo的方法[23-24]進行超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),過氧化氫酶(Catalase,CAT),抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性的測定。采用考馬斯亮藍G-250測定酶粗提液的蛋白質含量[25]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均進行三次重復,利用IBM SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析,采用方差分析差異顯著性,計算各指標的平均值和標準誤,數(shù)據(jù)均采用3個獨立樣本的平均值和標準誤表示,采用Excel作圖,Word制表。不同小寫字母表示差異顯著性(P<0.05)。實驗中用到的所有引物用Primer Premier 5.0軟件設計,引物序列見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer used in the study

2 結果與分析

2.1 海雀稗PvCIPK9基因的克隆及生物信息學分析

通過克隆獲得海雀稗PvCIPK9基因的CDS全長序列(圖1a),PvCIPK9基因的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)全長為1 332 bp,編碼443個氨基酸,蛋白分子量為49.87 KDa,理論等電點為8.02,不穩(wěn)定指數(shù)36.34,屬于穩(wěn)定蛋白,親水性總平均值(GRAVY)為-0.412,屬于親水性蛋白(圖1b)。PvCIPK9蛋白沒有信號肽結構(圖1c),預測該蛋白在第197～216個氨基酸間存在一個跨膜結構域(圖1d)。該蛋白具有典型的激酶結構域和NAF結構域(圖1f)。

圖1 PvCIPK9的生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of PvCIPK9注：(a)克隆PvCIPK9基因(b)海雀稗PvCIPK9蛋白親水性分析;(c)海雀稗PvCIPK9蛋白信號肽預測;(d)海雀稗PvCIPK9蛋白跨膜結構域預測;(e)海雀稗PvCIPK9蛋白三級結構模型;(f)海雀稗PvCIPK9蛋白保守結構域預測Note：(a)Clone PvCIPK9 gene;(b)Analysis of hydrophilicity of PvCIPK9 protein in P.vaginatum;(c)Prediction of PvCIPK9 protein signal peptide in P.vaginatum;(d)Prediction of transmembrane domain of PvCIPK9 protein in P.vaginatum;(e)Tertiary structure model of PvCIPK9 protein in P.vaginatum;(f)Prediction of the conserved domain of PvCIPK9 protein in P.vaginatum

將PvCIPK9分別與擬南芥26個CIPKs以及水稻33個CIPKs家族成員構建進化樹。進化分析結果顯示,PvCIPK9分別與擬南芥AtCIPK9(圖2a)和水稻OsCIPK9親緣關系最近(圖2b)。

圖2 PvCIPK9與擬南芥和水稻CIPKs的進化分析Fig.2 Evolutionary Analysis of PvCIPK9 and Arabidopsis CIPKs and Rice CIPKs注：(a)PvCIPK9與AtCIPKs的進化分析;(b)PvCIPK9與OsCIPKs的進化分析Note：(a)Evolutionary Analysis of PvCIPK9 and AtCIPKs;(b)Evolutionary Analysis of PvCIPK9 and OsCIPKs

2.2 啟動子分析

在海雀稗基因組數(shù)據(jù)中獲取PvCIPK9基因上游基因約1 500 bp序列,利用plantCARE對海雀稗PvCIPK9基因啟動子元件進行分析,發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)包含多個參與光反應的元件如G-Box,ARE等;多種激素響應元件如生長素反應元件TGA-element,脫落酸響應元件ABRE,水楊酸響應元件TCA-element,茉莉酸響應元件TGACG-motif,CGTCA-motif;逆境脅迫響應元件如LTR,ABRE等。

圖3 海雀稗PvCIPK9基因啟動子元件分析Fig.3 Gene promoter element analysis of PvCIPK9

2.3 PvCIPK9的表達模式分析

2.3.1PvCIPK9的亞細胞定位 將融合載體和mCherry共轉化水稻原生質體,以GFP和mCherry共轉為對照,通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光信號出現(xiàn)部位。結果顯示,PvCIPK9-GFP熒光信號與mCherry熒光信號明顯重疊在細胞核(圖4),表明PvCIPK9主要存在于細胞核中。

2.3.2PvCIPK9的組織特異性表達分析 利用RT-qPCR檢測海雀稗不同器官組織中的PvCIPK9基因表達量,結果表明,正常生長條件下,PvCIPK9基因在根、莖、葉、穗中均有不同程度的表達,在葉中的表達量最高且顯著高于其他組織(圖5)。

2.3.3海雀稗PvCIPK9鹽脅迫響應分析 以野生型海雀稗作為材料,通過qRT-PCR分析200 mmol·L-1NaCl鹽脅迫不同時間對葉片和根系中PvCIPK9基因表達的影響。結果顯示,與正常生長條件下的海雀稗相比較,鹽處理后,海雀稗葉片中的PvCIPK9基因表達量呈上升趨勢,在根中,PvCIPK9的基因表達量在2,6,24 h時顯著上升(P<0.05),在12 h時無顯著差異(圖6)。

圖5 PvCIPK9的組織特異性表達分析Fig.5 Analysis of tissue specific expression of PvCIPK9

圖6 海雀稗PvCIPK9鹽響應脅迫分析Fig.6 Analysis of salt response of Paspalums vaginatium PvCIPK9注：海雀稗葉片(a)和根(b)中PvCIPK9的基因表達分析。不同小寫字母表示處理組與對照組差異顯著(P<0.05)Note：Analysis of gene expression of PvCIPK9 in leaves (a) and roots (b) of Paspalums vaginatium. Different minuscule indicate significant difference between treatment group and control group (P<0.05)

2.4 過表達PvCIPK9遺傳材料的表型鑒定

2.4.1過表達PvCIPK9擬南芥植株的獲得 用花序侵染法轉化野生型擬南芥,在含有Basta的培養(yǎng)基上篩選得到兩個株系。以轉基因擬南芥DNA為模板,采用引物Bar-F和Bar-R進行PCR檢測鑒定,檢測結果符合Bar基因的片段大小(圖7a)。進一步采用引物擴增載體上啟動子部分片段和目的片段全長,擴增長度1 756 bp,電泳結果符合預期(圖7b)。通過實時熒光定量PCR鑒定轉入基因的表達情況,結果顯示,過表達株系的目的基因表達量均顯著高于野生型擬南芥(圖7c)。為方便我們把PvCIPK9-1和PvCIPK9-8轉基因株系分別命名為OE1和OE8。

圖7 轉基因擬南芥的檢測鑒定Fig.7 Detection and Identification of Transgenic Arabidopsis注：(a)PCR檢測Bar基因(b)PCR檢測PvCIPK9基因(c)定量PCR檢測PvCIPK9基因表達量。M,DL2000 Marker;—,野生型;+,pCAMBIA3301-PvCIPK9質粒;1,8,過表達轉基因擬南芥株系Note：(a) PCR for Bar gene (b) PCR for PvCIPK9 gene (c) PvCIPK9 gene expression by qPCR.M,DL2000 Marker;—,Wild type;+,pCAMBIA3301-PvCIPK9 vector;1,8,Overexpression of transgenic Arabidopsis lines

2.4.2鹽脅迫對轉基因擬南芥種子萌發(fā)率的影響 連續(xù)統(tǒng)計5天的種子萌發(fā)率(圖8a),不含NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上,轉基因和野生型擬南芥均在第2天開始萌發(fā),第4天時轉基因株系和野生型株系的萌發(fā)率分別為87%,94%和82%,且無顯著性差異(圖8a)。在含100 mmol·L-1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上,所有株系在第3天開始萌發(fā),第 4天時,野生型株系的萌發(fā)率僅有8%～10%,而過表達株系的萌發(fā)率分別為40%～64%,60%～73%,顯著高于野生型(圖8b)。說明鹽處理對過表達PvCIPK9擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用顯著小于野生型。

2.4.3鹽脅迫對轉基因擬南芥相對生長量的影響 正常條件下,過表達PvCIPK9轉基因株系的整株、地上部和根的鮮重略低于野生型,但差異不顯著。在含鹽培養(yǎng)基上,轉基因株系的整株、地上部和根的鮮重顯著高于野生型(圖9a,9b,9c)。進一步計算相對生長量,發(fā)現(xiàn)過表達株系的整株,地上部及根的相對生長量均顯著高于野生型。以上結果說明過表達PvCIPK9提高了轉基因擬南芥的耐鹽性。

圖9 鹽脅迫處理對野生型與過表達PvCIPK9擬南芥的生長影響Fig.9 Effect of salt stress treatment on the growth of PvCIPK9 transgenic Arabidopsis and WT注：鹽處理后整株(A)、地上部(B)和根(C)的鮮重;(D)將7天齡的幼苗分別在含0,100,150 mmol·L-1 NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上生長18 d后的生長狀況Note：After salt treatment,fresh weight of whole plant (A),shoot (B) and root (C);(D) The growth status of 7-day-old seedlings after growing on 1/2 MS medium containing 0,100 and 150 mmol·L-1 NaCl for 18 days

2.4.4鹽脅迫對轉基因擬南芥抗氧化酶活性的影響 正常條件下,轉基因株系和野生型株系的SOD酶活性沒有顯著性差異。鹽處理后,與WT相比,過表達PvCIPK9株系的SOD酶活性顯著提高(圖10a);在正常條件下,過表達株系的CAT活性與野生型無顯著差異,鹽處理后,過表達株系的CAT活性顯著高于野生型(圖10b);無論是在正常生長條件還是鹽脅迫條件下,所有株系間的APX活性均無顯著性差異(圖10c)。上述結果說明過表達PvCIPK9提高了鹽脅迫下轉基因擬南芥SOD和CAT的活性,對APX的活性無影響。

圖10 鹽脅迫對轉基因擬南芥抗氧化酶活性的影響Fig.10 Effect of the antioxidant enzyme activity of transgenic Arabidopsis under salt stress注：鹽處理14天后,測定擬南芥的SOD(A)、CAT(B)和APX(C)的活性Note：After 14 days of salt treatment,the activities of SOD (A),CAT (B) and APX (C) were measured in Arabidopsis

2.4.5鹽脅迫下轉基因擬南芥的表型觀察 通過土壤栽培,觀察自然環(huán)境下轉基因材料對鹽脅迫的耐受性,由圖11所示,鹽脅迫條件下,野生型植株葉片稀疏,葉面細小,受到明顯的傷害,而轉基因株系的葉片較大且數(shù)量多,長勢更好,鹽處理對過表達PvCIPK9擬南芥植株的傷害較小,表明過表達PvCIPK9基因能夠提高擬南芥的耐鹽性。

3 討論

海雀稗作為具有極強耐鹽性的鹽生植物之一,在鹽堿地改良與修復上有著巨大的應用潛力[21]。但是關于海雀稗耐逆性,特別是耐鹽性的機制研究報道甚少。作為植物特有的蛋白激酶,CIPKs(CBL相互作用蛋白激酶)家族在解碼和轉導脅迫產生的Ca2+信號中發(fā)揮著重要作用[26]。本文從鹽生植物海雀稗中克隆得到一個CIPKs家族的新成員—PvCIPK9。該基因與水稻和擬南芥中的OsCIPK9和AtCIPK9同源關系較近。進一步分析發(fā)現(xiàn)PvCIPK9在海雀稗根、莖、葉和小穗中均有表達,廣泛的空間分布表明PvCIPK9可能參與了多種生理響應過程,其中葉中表達量最高,這與AtCIPK9主要在根中表達不同[27],這可能與海雀稗作為鹽生植物獨有的鹽腺有關[28]。分析PvCIPK9在鹽脅迫下的表達水平,結果表明根系和葉片中PvCIPK9的轉錄水平均隨著鹽脅迫的誘導而上調,與擬南芥AtCIPK9和水稻OsCIPK9受鹽脅迫誘導上調的結果一致[27,29]。

不同基因的啟動子區(qū)含有不同功能的順式作用元件,植物響應環(huán)境脅迫與這些順式作用元件有關[30]。進一步分析PvCIPK9上游1 500 bp左右的啟動子元件,發(fā)現(xiàn)海雀稗PvCIPK9的啟動子區(qū)含有多種順式作用元件,包括多種光反應響應元件、激素響應元件、逆境脅迫響應元件等,但并未發(fā)現(xiàn)僅對鹽脅迫有響應的順式作用元件,如GT-1。同一順式作用元件也不只對同一種環(huán)境脅迫做出響應,如ABRE不僅對ABA有響應,還響應干旱和鹽,DRE不只響應干旱,也對ABA、低溫、高鹽有響應[31]。本文中海雀稗PvCIPK9雖不含特定的鹽響應元件,但可能會通過其他順式作用元件對鹽脅迫作出響應。

一般認為CIPK的亞細胞定位取決于CBL-CIPK復合體中CBL的亞細胞定位[32]。同一個CIPK與不同的CBL相互作用,有著不同的亞細胞定位,從而發(fā)揮不同的功能[33]。當CIPK單獨存在時,一般在細胞核、細胞質和質膜上廣泛分布,CIPK在細胞內的廣泛分布有利于其與不同的CBL結合發(fā)揮不同的功能,與大多數(shù)CIPK不同的是,PvCIPK9的亞細胞定位僅定位于細胞核中,推測PvCIPK9可能會與同樣定位于核中的某一個或幾個CBLs特異性結合發(fā)揮特定的功能。

為進一步探究PvCIPK9的耐鹽性功能,將PvCIPK9過表達轉化擬南芥,對獲得轉基因擬南芥植株進行鹽脅迫下的耐受性分析。結果表明,鹽脅迫下,與野生型WT相比,過表達PvCIPK9轉基因擬南芥株系葉片更大,且數(shù)量較多,受到的傷害更小。進一步測定種子萌發(fā)率和相對生長量也發(fā)現(xiàn)轉基因株系有著更高的萌發(fā)率和相對生長量,表明過表達PvCIPK9能夠提高轉基因擬南芥對鹽脅迫的耐受性,有研究表明白刺(Nitrariatangutorum)NtCIPK9與植物耐鹽性有關,過表達NtCIPK9擬南芥株系在鹽脅迫下表現(xiàn)出更高的種子萌發(fā)率以及更長的根長[34]。此外,擬南芥AtCIPK9參與K+穩(wěn)態(tài),且AtCIPK9與VDAC3互作調節(jié)擬南芥的氧化應激反應[35],還有報道油菜(Brassicanapus)BnCIPK9在介導葡萄糖轉化和ABA信號轉導之間的相互作用以調節(jié)油菜籽中的油代謝中發(fā)揮著重要作用[36],這些與PvCIPK9同源關系較近的基因報道的各種基因功能,為研究PvCIPK9除鹽脅迫耐受性以外的功能提供了借鑒,說明PvCIPK9具有潛在的功能多樣性,為后續(xù)探索PvCIPK9的其他功能提供了理論基礎。

逆境脅迫下,植物自身可以通過一系列復雜的抗氧化防御體系來減輕和修復因逆境產生的活性氧造成的傷害[37]。在本研究中對過表達PvCIPK9擬南芥進行鹽脅迫處理,發(fā)現(xiàn)過表達PvCIPK9擬南芥的SOD,CAT酶活性顯著高于野生型,這說明在鹽脅迫條件下轉基因擬南芥具有更強的活性氧清除能力,可以減輕鹽脅迫對擬南芥的傷害。有研究表明番茄中過表達SOD基因能顯著提高轉基因番茄的耐鹽性[38],在鹽脅迫條件下,與鹽敏感的黃瓜(Cucumissativus)植株相比,耐鹽黃瓜的抗氧化酶活性顯著提高[39],說明植株的高耐鹽性與較強的抗氧化酶活性的有關。綜上,可推測提高抗氧化酶活性是PvCIPK9提高植物耐鹽性的一種途徑。

鹽超敏感(Salt overly sensitive,SOS)途徑是植物中最先被發(fā)現(xiàn)的CBL-CIPK通路,參與植物對鹽脅迫的響應,該通路的作用機制主要是通過排出細胞內多余的Na+,從而維持體內的Na+/K+平衡,提高耐鹽性[40-41]。AtCIPK9已經被證實是低K+脅迫相關的調節(jié)因子[42],后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),AtCIPK9可靶向下游的VDAC3,AP2C1或HAK5等調節(jié)K+穩(wěn)態(tài)[35,43-44],根據(jù)進化分析的結果,PvCIPK9與AtCIPK9同源性較高,作為同源基因,PvCIPK9可能具有同樣的功能,即通過調節(jié)K+穩(wěn)態(tài)來維持Na+/K+平衡,進而提高植物耐鹽性,這為進一步探究PvCIPK9具體的分子調控機制提供了方向。

4 結論

本研究通過前期海雀稗鹽脅迫條件下轉錄組測序篩選出對鹽脅迫有響應的PvCIPK9基因,對該基因進行了生物信息學和表達模式等分析,發(fā)現(xiàn)該基因編碼穩(wěn)定的親水性蛋白,無信號肽結構,存在一個跨膜結構域;PvCIPK9定位于細胞核中;PvCIPK9在海雀稗的根、莖、葉和穗均有表達,在葉中的基因表達量最高;鹽脅迫下PvCIPK9在根和葉中表達均上調。對轉基因擬南芥進行鹽脅迫處理,測定轉基因擬南芥在鹽脅迫條件下的種子萌發(fā)率、相對生長量、抗氧化酶酶活性等生理指標,結果表明轉基因擬南芥的耐鹽性明顯優(yōu)于野生型擬南芥,說明過表達PvCIPK9提高了擬南芥的耐鹽性,這為揭示海雀稗耐鹽機制及挖掘新的耐鹽基因資源奠定了基礎。