盧棟宇,王 雪,蔣 旭,張?jiān)菩?張麗麗,栗亞靜,康俊梅

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

開花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過(guò)渡的轉(zhuǎn)折點(diǎn),是高等植物繁衍后代,延續(xù)物種的重要生理過(guò)程[1]。開花時(shí)間是由植物內(nèi)源信號(hào)與外界環(huán)境因子共同精細(xì)地調(diào)控[2]。開花時(shí)間的早晚對(duì)飼草作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有重要的影響。開花前植物處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期,光合產(chǎn)物主要用于營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng);開花后光合產(chǎn)物發(fā)生重新分配從營(yíng)養(yǎng)器官轉(zhuǎn)向了繁殖器官,并伴隨著木質(zhì)化程度的增加,導(dǎo)致飼草品質(zhì)顯著下降[3]。因此,花期調(diào)控的分子機(jī)制一直是植物發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜精確的調(diào)節(jié)機(jī)制,通過(guò)響應(yīng)內(nèi)源信號(hào)和環(huán)境變化來(lái)調(diào)節(jié)開花時(shí)間[4]。通過(guò)對(duì)模式植物擬南芥開花發(fā)育及遺傳學(xué)分析表明,開花調(diào)控主要有6條途徑,分別為光周期途徑、赤霉素途徑、春化途徑、溫度途徑、年齡途徑和自主途徑[5-6]。其中光周期是影響植物開花的重要因素之一。研究表明,CONSTANS-Like(COL)基因家族成員具有保守的B-box和CCT結(jié)構(gòu)域[7],在光周期開花誘導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用[8],在不同物種中COL的功能復(fù)雜多樣[9-12]。在擬南芥中,CO在長(zhǎng)日照條件下作為正調(diào)控因子促進(jìn)開花[13];過(guò)量表達(dá)COL5可以誘導(dǎo)短日照條件下擬南芥的開花[14]。對(duì)COL1和COL2的研究表明,它們對(duì)擬南芥的開花時(shí)間幾乎沒(méi)有影響,但過(guò)量表達(dá)COL1能夠縮短晝夜節(jié)律的周期[15]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)COL8和COL9導(dǎo)致晚花表型[16-17]。COL開花的功能在其他物種中也有研究。水稻中的Headingdate1(Hd1),與擬南芥CO同源,在短日照條件下誘導(dǎo)開花,在長(zhǎng)日照(LD)條件下則會(huì)抑制開花[18]。大豆中GmCOL1a和GmCOL1b在長(zhǎng)日照條件下起到抑制開花作用[19]。大麥中CO的同源蛋白HvCO9有助于延遲大麥的開花[20]。在楊樹中,CO1和CO2在楊樹CO同系物中與擬南芥CO的序列相似性最高,但對(duì)開花時(shí)間沒(méi)有明顯的調(diào)節(jié)作用[21]。芒果中MiCOL1A和MiCOL1B在LD條件下抑制開花[22]。雖然在擬南芥、水稻、大豆等植物中開展了對(duì)COL的功能研究,但在紫花苜蓿中未見相關(guān)報(bào)道。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草,其產(chǎn)草量高、蛋白質(zhì)含量豐富,對(duì)奶業(yè)等草牧業(yè)的健康發(fā)展具有不可替代的作用[23]。紫花苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)與開花時(shí)間密切相關(guān),其最佳刈割期是現(xiàn)蕾期和初花期,此時(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)均為最佳。收割的時(shí)間過(guò)早,苜蓿的產(chǎn)量會(huì)受到影響,收割時(shí)間過(guò)晚會(huì)導(dǎo)致苜蓿的品質(zhì)下降。而苜蓿產(chǎn)量的增加,主要以增加營(yíng)養(yǎng)體的產(chǎn)量為目標(biāo),如果延遲開花,就可以延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)的時(shí)間,從而達(dá)到提高產(chǎn)量和品質(zhì)的目標(biāo)。因此,晚花苜蓿品種的培育可以為苜蓿生產(chǎn)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)效益,具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究克隆了紫花苜蓿MsCOL2基因,分析了其在不同組織與花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異以及不同誘導(dǎo)條件下MsCOL2的表達(dá)模式;通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)MsCOL2轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿株系開花表型的觀測(cè),揭示了MsCOL2調(diào)控開花的功能,本研究為解析MsCOL2調(diào)控紫花苜蓿開花的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于表達(dá)模式分析和遺傳轉(zhuǎn)化的材料為‘中苜1號(hào)’紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Zhongmu No.1’),由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成并保存。

實(shí)驗(yàn)用載體：植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-MsCOL2,大腸桿菌感受態(tài)DH5α,農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1苜蓿培養(yǎng)與處理 挑選飽滿大小均勻一致的紫花苜蓿種子,置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽7 d,待子葉展開后移栽到1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中,置于植物培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗,溫度 24℃,濕度 60%～70%),每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液,培養(yǎng)3周后進(jìn)行光周期和激素處理。長(zhǎng)日照處理為16 h光照/8 h黑暗,短日照處理為8 h光照/16 h黑暗,分別在0,4,8,12,16,20,24 h共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集幼苗葉片部分;激素處理分別用50 μmol·L-1赤霉素(Gibberellic acid,GA3)和100 μmol·L-1水楊酸(Salicylic acid,SA)處理,分別在0,1,3,6,12 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集幼苗葉組織。不同組織及花發(fā)育時(shí)期目標(biāo)基因的表達(dá)分析所用材料為‘中苜1號(hào)’扦插苗,連續(xù)刈割兩次挑選生長(zhǎng)狀態(tài)一致的植株,分別取葉、莖和花,其中葉、莖組織取樣時(shí)期為花芽分化期,花組織分別取花芽分化期的花苞、初花期尚未開放的花蕾和盛花期開放的花朵。所取試驗(yàn)材料置于液氮中冷凍,保存于-80℃冰箱備用。測(cè)試材料均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2植物總RNA的提取及cDNA合成 植物總RNA的提取利用RNA提取試劑盒(Promega,上海普洛麥格生物技術(shù)有限公司),詳細(xì)步驟參照試劑盒說(shuō)明書。RNA完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)檢測(cè)RNA的濃度。cDNA的反轉(zhuǎn)錄,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京金沙生物科技有限公司),實(shí)驗(yàn)過(guò)程詳見試劑盒說(shuō)明書。

1.2.3MsCOL2的克隆 利用紫花苜蓿MsCOL2全長(zhǎng)CDS序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1),以紫花苜蓿cDNA為模板,利用ExTagDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為50 μL：cDNA 2 μL,TakaRa EX Taq 0.5 μL,10×EX Taq Buffer 5 μL,dNTP Mixure 4 μL,MsCOL2引物各2.5 μL,去離子水33.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min;95℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 1 min 20 s,25個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后純化。

1.2.4組織差異性及不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)模式分析 利用qRT-PCR檢測(cè)MsCOL2的表達(dá)水平,以紫花苜蓿Actin為內(nèi)參。將cDNA稀釋20倍備用,實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系為20 μL,反應(yīng)體系如下：10 μL 2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix;0.4 μL qCOL2-F;0.4 μL qCOL2-R;2 μL cDNA;7.2 μL去離子水。引物序列見表1。

表1 基因克隆及載體構(gòu)建引物序列Table 1 Primer sequences for gene cloning and vector construction

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI的ORF finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)最大開放閱讀框;通過(guò)DNAMAN進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì);MEGA11.0軟件使用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹,Bootstrap設(shè)置為1 000次[24];利用Protscale(https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域;利用ExASy(https：//web.expasy.org/cgi-bin/computepi)預(yù)測(cè)MsCOL2蛋白分子量大小、理論等電點(diǎn)和親水性;利用Plantcare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子區(qū)域(起始密碼ATG上游2 kb)順式作用元件。利用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用Cell-PLoc 2.0(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析。以上軟件均使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析。

1.4 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

利用測(cè)序正確的pTOPO-MsCOL2質(zhì)粒擴(kuò)增帶有同源臂的PCR產(chǎn)物,將帶有同源臂的擴(kuò)增產(chǎn)物與pCAMBIA3301載體進(jìn)行同源重組。

將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌中,采用根癌農(nóng)桿菌侵染法[25],以紫花苜蓿葉片為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的外植體在無(wú)抗性SH3a培養(yǎng)基上共培養(yǎng)24～48 h,移入SH3a(2 mg·L-1草銨膦、400 mg·L-1頭孢霉素)培養(yǎng)基中,置于人工培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)6～8周。將愈傷組織轉(zhuǎn)入MSBK培養(yǎng)基(2 mg·L-1草銨膦、400 mg·L-1頭孢霉素)中,進(jìn)行光照培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗,溫度22℃,濕度60%),誘導(dǎo)叢生芽生長(zhǎng)。2～3周后將含有叢生芽的愈傷組織轉(zhuǎn)入SH9a培養(yǎng)基(2 mg·L-1草銨膦、400 mg·L-1頭孢霉素)中誘導(dǎo)根芽分化,直至長(zhǎng)出幼苗和強(qiáng)壯的根系,移入土壤生長(zhǎng)(營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=1∶1),置于人工氣候室培養(yǎng)(條件同上)。

1.5 紫花苜蓿陽(yáng)性苗鑒定及MsCOL2的表達(dá)分析

遺傳轉(zhuǎn)化的紫花苜蓿再生植株提取基因組DNA采用快檢法：剪取20 mg葉片放入200 μL DNA提取液中研磨,研磨完全后13 000 r·min-1離心15 min,隨后吸取160 μL上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5 mL離心管中,加入160 μL異丙醇吸打混勻,將混合液13 000 r·min-1離心15 min,棄上清液,將離心管倒置30 min,倒置結(jié)束后向離心管中加入20 μL滅菌水懸浮,所得DNA溶液,保存在-20℃冰箱。以提取的DNA為模板,利用通用引物35S-F/GUS-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系如下：5 μL 2×taq PCR Mix,0.5 μL 35S-F,0.5 μL GUS-R,1 μLDNA,3 μL去離子水。用移液槍輕輕吹打混勻,瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR擴(kuò)增體系為：95℃ 5 min,95℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,25 cycles,72℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 開花相關(guān)基因的表達(dá)分析

開花相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)植物的開花有重要影響。為探究過(guò)量表達(dá)MsCOL2對(duì)紫花苜蓿開花相關(guān)基因表達(dá)的影響,選取2個(gè)MsCOL2表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行功能驗(yàn)證分析。本研究挑選了已報(bào)道的12個(gè)開花相關(guān)的基因,其中促進(jìn)開花基因?yàn)镸sPHYA,MsGI,MsFKF1,MsFTa1,MsSOCa1,MsSPL13,MsCO和MsLFY,抑制開花相關(guān)基因?yàn)镸sSVP,MsTOCa1,MsELF4和MsEFM(引物序列見表2)。

表2 研究所用的定量引物序列Table 2 Sequences of the quantitative primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 MsCOL2的克隆與生物信息學(xué)分析

以紫花苜蓿cDNA為模板克隆了MsCOL2,CDS序列長(zhǎng)度為1 206 bp,編碼401個(gè)氨基酸。Blast結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,該基因編碼蛋白的氨基酸序列與豆科模式植物蒺藜苜蓿的COL親緣關(guān)系最近,相似度為95.28%,故命名為MsCOL2(圖1,2)。

通過(guò)同源氨基酸多重序列比對(duì)分析和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),MsCOL2基因編碼的氨基酸序列含有兩段由44個(gè)氨基酸組成的典型BBox保守區(qū)和一段由43個(gè)氨基酸組成的典型CCT保守結(jié)構(gòu)域(圖1)。為了預(yù)測(cè)MsCOL2的功能,利用PlantCARE軟件預(yù)測(cè)該基因的順式作用元件,結(jié)果顯示,該基因啟動(dòng)子包含多個(gè)順式作用元件,其中包括GT1,G-box等一系列光響應(yīng)元件,還包含有GARE-motif和P-box等赤霉素和水楊酸響應(yīng)元件(表3)。

ExPASy在線預(yù)測(cè)MsCOL2蛋白分子量為43.96 kDa,理論等電點(diǎn)為5.00;MsCOL2全部氨基酸的平均親水系數(shù)為-0.527,表明其為親水性蛋白質(zhì)(圖3A)。對(duì)MsCOL2蛋白分析結(jié)果顯示,該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主,占總體的57.11%,α-螺旋占29.43%,β-折疊占2%,轉(zhuǎn)角為11.47%(圖3C);TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3B);通過(guò)Cell-PLoc 2.0軟件預(yù)測(cè),該蛋白定位在細(xì)胞核上(圖3D)。

圖1 MsCOL2與其他物種的多序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of MsCOL2 with other species注：方框內(nèi)為BBox結(jié)構(gòu)域,下劃線為CCTmotif。Gm為大豆;Mt為蒺藜苜蓿;At為擬南芥;Zm為玉米;Os為水稻;Ta為小麥Note：The BBox domain is inside the box and underlined is CCTmotif.Gm stands for Glycine max;Mt stands for Medicago truncatula;At stands for Arabidopsis thaliana;Zm stands for Zea mays;Os stands for Oryza sativa;Ta stands for Triticum aestivum

圖3 MsCOL2生物信息學(xué)分析Fig.3 Bioinformatics analysis of MsCOL2注：A為MsCOL2的親水性;B為MsCOL2無(wú)跨膜結(jié)構(gòu);C為MsCOL2的二級(jí)結(jié)構(gòu);D為MsCOL2的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Note：A stands for Hydrophilicity of MsCOL2 protein predicted by Protscale;B stands for Non-transmamrane domain for MsCOL2 protein predicted by TMHMM;C stands for Secondary structure of MsCOL2 predicted by SOPMA;D stands for Prediction of MsCOL2 subcellular localization by Cell-Ploc

表3 啟動(dòng)子作用元件分析Table 3 Predictive analysis of promoter acting elements

2.2 MsCOL2表達(dá)模式分析

2.2.1MsCOL2組織特異性及花的不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析 為了明確MsCOL2基因在不同組織中的表達(dá)特性,利用qRT-PCR 分析了該基因在花、莖、葉以及花芽分化期、初花期、盛花期的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,MsCOL2在花、莖、葉中均有表達(dá),且在花中表達(dá)量最高,是莖中的3倍(圖4A)。花不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析結(jié)果表明,MsCOL2在花芽分化期表達(dá)量最高,為初花期的1.6倍,為盛花期的2.7倍(圖4B)。

2.2.2光周期和外源激素誘導(dǎo)下MsCOL2的表達(dá)分析 光周期是影響植物開花的重要因素之一。為了明確MsCOL2對(duì)光周期誘導(dǎo)的表達(dá)模式,采用3周齡的紫花苜蓿分別進(jìn)行了長(zhǎng)日照(LD)和短日照(SD)處理。qRT-PCR結(jié)果分析顯示,在LD條件下,MsCOL2表達(dá)量峰值出現(xiàn)在光照后8 h和12 h(圖5A);而SD條件下,隨著黑暗時(shí)間的增加,MsCOL2表達(dá)量逐步上升,且在24 h達(dá)到一個(gè)高峰(圖5B)。在長(zhǎng)、短日照條件下,該基因在轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)24小時(shí)一個(gè)周期性的變化,說(shuō)明MsCOL2與COL家族其他成員類似,能夠響應(yīng)光周期,暗示MsCOL2可能在光周期開花調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

圖4 MsCOL2在不同組織與花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of MsCOL2 at different tissues and flower developmental stages注：A為組織特異性表達(dá);B為花發(fā)育的3個(gè)時(shí)期差異表達(dá)。Bar表示標(biāo)準(zhǔn)差“*”和“**”分別代表t檢驗(yàn)P<0.05 和<0.01。下同Note：A：Tissue specific expressions;B：Differential expressions at three flower developmental stages.Error bars represent the standard error of the mean,“*”or “**”on behalf of P value<0.05 or <0.01 by student t test analysis.The same as below

激素在植物的開花途徑中起重要的調(diào)節(jié)作用。為了揭示施加外源激素對(duì)MsCOL2表達(dá)的影響,分析了50 μmol·L-1GA3和100 μmol·L-1SA誘導(dǎo)下的表達(dá)特性。研究結(jié)果表明,在GA3誘導(dǎo)下,MsCOL2表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化趨勢(shì),24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高水平,為對(duì)照的1.7倍(圖5C);SA誘導(dǎo)12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高水平,為對(duì)照的25倍(圖5D)。上述研究結(jié)果表明,MsCOL2受激素GA3和SA誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 過(guò)表達(dá)MsCOL2紫花苜蓿鑒定及開花相關(guān)基因表達(dá)分析

2.3.1過(guò)表達(dá)MsCOL2紫花苜蓿鑒定及表型分析 以pCAMBIA3301作為表達(dá)載體,通過(guò)無(wú)縫克隆構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,用W-MsCOL2-F和GUS-R引物對(duì)含有3301-35S-MsCOL2質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落進(jìn)行陽(yáng)性鑒定,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè),出現(xiàn)單一條帶,大小約為1 200 bp左右,表明MsCOL2基因成功導(dǎo)入苜?；蚪M(圖6)。通過(guò)陽(yáng)性鑒定共獲得8株35S：MsCOL2過(guò)表達(dá)株系,qRT-PCR分析轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿與對(duì)照組MsCOL2的表達(dá)水平,其中,OE#1的表達(dá)量為對(duì)照的5.8倍,OE#6的表達(dá)量為對(duì)照的4.7倍。選擇上述2株轉(zhuǎn)基因植株開展后續(xù)功能驗(yàn)證研究(圖7)。開花表型初步觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照在刈割后37天開花,而過(guò)表達(dá)MsCOL2紫花苜蓿植株在刈割后的45天開花,開花時(shí)間比對(duì)照延遲9天。

2.3.2過(guò)表達(dá)MsCOL2紫花苜蓿中開花相關(guān)基因的表達(dá)分析 為了分析過(guò)量表達(dá)MsCOL2對(duì)開花調(diào)控途徑中與開花相關(guān)基因表達(dá)水平的影響,利用qRT-PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因株系中促進(jìn)開花相關(guān)基因MsPHYA,MsGI,MsFKF1,MsFTa1,MsSOC1,MsSPL13,MsCO,MsTGA1,MsSARD1,MsSLY1和MsFLD的表達(dá)水平,以及抑制開花相關(guān)基因MsSVP,MsTOC1,MsELF4和MsEFM的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示,促進(jìn)開花的相關(guān)基因MsPHYA,MsSPL13,MsFTa1,MsCO,MsTGA1,MsSARD1,MsSLY1,MsFLD和MsLFY的表達(dá)水平均下調(diào),其中成花素基因MsFTa1的表達(dá)顯著下調(diào),其表達(dá)量?jī)H是對(duì)照的0.07%,MsSPL13的表達(dá)量是對(duì)照的24.4%,MsPHYA的表達(dá)量是對(duì)照的33%。本研究結(jié)果顯示抑制開花相關(guān)基因MsSVP,MsTOCa1,MsELF4和MsEFM的表達(dá)水平均上調(diào),其中OE#1中MsELF4表達(dá)量比對(duì)照提高了30.9倍。上述結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)MsCOL2可能抑制促進(jìn)開花基因的表達(dá),而促進(jìn)抑制開花基因的表達(dá)(圖8)。

圖6 過(guò)表達(dá)MsCOL2紫花苜蓿的鑒定Fig.6 Positive identification of MsCOL2-overexpression alfalfa

圖7 轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿MsCOL2表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of MsCOL2-overexpression alfalfa注：WT為野生型植株;OE#1-OE#8為過(guò)表達(dá)紫花苜蓿植株Note：WT：Wild-type plants;OE#1-OE#8：Overexpressing alfalfa plants

圖8 過(guò)表達(dá)MsCOL2紫花苜蓿開花相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of flowering-related genes under overexpressed MsCOL2 alfalfa注：A-L為促進(jìn)開花相關(guān)基因;M-P為抑制開花相關(guān)基因Note：A-L stands for Flowering promoting genes;M-P stands for Flower inhibiting genes

3 討論

3.1 MsCOL2組織特異性及花的發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析

開花是影響植物繁殖和提高作物產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一[26]。為了明確MsCOL2基因在不同組織中的表達(dá)特性,利用qRT-PCR進(jìn)行了組織特異性表達(dá)檢測(cè),結(jié)果顯示,MsCOL2在花中表達(dá)量最高,預(yù)測(cè)該基因可能參與苜蓿的花期調(diào)控。本研究對(duì)花芽分化期、初花期、盛花期3個(gè)不同花發(fā)育時(shí)期的MsCOL2表達(dá)量分析表明,在花芽分化期相對(duì)表達(dá)量最高。已有研究表明花芽分化是積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及激素調(diào)節(jié)物質(zhì)、遺傳物質(zhì)等共同協(xié)調(diào)作用的過(guò)程,是花器官形成的基礎(chǔ),并控制開花時(shí)間[27]。推測(cè)該基因在成花初期表達(dá)水平高,可能在花蕾形成和花發(fā)育中可能發(fā)揮功能。

3.2 光周期和外源激素誘導(dǎo)MsCOL2的表達(dá)

光周期是影響植物開花的重要因素之一。光響應(yīng)元件能夠感知光信號(hào),不同光照能夠調(diào)控基因表達(dá)。研究報(bào)道,在LD條件下擬南芥中AtCO的表達(dá)水平在黃昏時(shí)達(dá)到峰值,而SD條件下在夜間達(dá)到峰值。春蘭在LD條件下CgCOL的表達(dá)水平光照期間高于黑暗期間,在SD條件下,在光照下CgCOL的表達(dá)水平低于黑暗[28-31]。水稻中OsCOL16的表達(dá)水平先降低后增加,在黃昏后6 h或14 h達(dá)到峰值[32]。本研究MsCOL2在長(zhǎng)日照和短日照條件下,表現(xiàn)出不同的晝夜表達(dá)模式,暗示MsCOL2可能在光周期開花調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

激素在植物的開花調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用,GA3,SA均參與植物的開花調(diào)控[33-34]。赤霉素可以使SOC1基因的表達(dá)水平上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)花分生組織基因LEAFY的表達(dá)上調(diào),從而促進(jìn)植物開花[35]。水楊酸可以誘導(dǎo)植物的花芽分化[36]。在苜蓿生殖生長(zhǎng)的不同時(shí)期葉面噴施GA3后,會(huì)直接影響花莢激素含量的變化,從而間接影響苜蓿產(chǎn)量構(gòu)成因子與種子產(chǎn)量[37-38]。對(duì)紫花苜蓿分別施加50 μmol·L-1GA3和100 μmol·L-1SA兩種激素,MsCOL2表達(dá)量上調(diào),說(shuō)明MsCOL2受到2種激素的誘導(dǎo),但是施加2種激素對(duì)紫花苜蓿開花的影響,以及如何通過(guò)MsCOL2調(diào)控開花還有待于進(jìn)一步研究。

3.3 MsCOL2參與紫花苜蓿開花基因表達(dá)調(diào)控

為了探究過(guò)表達(dá)MsCOL2對(duì)紫花苜蓿開花花期調(diào)控途徑中開花相關(guān)基因的影響。挑選已報(bào)道的與促進(jìn)開花相關(guān)的基因MsPHYA,MsGI,MsFKF1,MsSOC1,MsSPL13,MsCO,MsLFY,MsFTa1,MsTGA1,MsSARD1,MsSLY1,MsFLD和抑制開花相關(guān)基因MsSVP,MsTOC1,MsELF4,MsEFM進(jìn)行定量表達(dá)分析;結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,過(guò)表達(dá)MsCOL2材料中促進(jìn)開花基因MsFTa1和MsPHYA的表達(dá)水平顯著下調(diào)。研究表明,成花素基因FT是植物開花網(wǎng)絡(luò)的中心調(diào)控因子,在紫花苜蓿中沉默F(xiàn)Ta1具有延遲開花的作用[39];PHYA作為光敏因子,主要感受遠(yuǎn)紅光,參與到光周期開花調(diào)節(jié)途徑中[40],這些促進(jìn)開花基因在過(guò)表達(dá)紫花苜蓿中的表達(dá)量均有所下調(diào),暗示MsCOL2在紫花苜蓿開花調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。GI是一種植物特有的核蛋白,具有調(diào)控開花時(shí)間、晝夜節(jié)律和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用,擬南芥gi突變體能夠延遲開花[41];然而,長(zhǎng)日照條件下過(guò)表達(dá)OsGI水稻出現(xiàn)開花延遲[42]。本研究中過(guò)表達(dá)MsCOL2植株中MsGI基因表達(dá)量上調(diào),可能與水稻開花調(diào)控的機(jī)制相似。CO結(jié)合在SOC1的啟動(dòng)子上正調(diào)控其表達(dá)[43],擬南芥中過(guò)表達(dá)水稻OsSOC1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)早花表型[44],而草莓中過(guò)表達(dá)FvSOC1卻抑制開花[45]。本研究分析顯示,過(guò)表達(dá)MsCOL2植株中SOC1表達(dá)量上調(diào),表明COL對(duì)SOC1的表達(dá)有促進(jìn)作用。本研究分析結(jié)果顯示,在過(guò)表達(dá)MsCOL2材料中,抑制開花基因MsTOC1和MsSVP的表達(dá)量分別上調(diào)了4.5倍和1.5倍。TOC1通過(guò)光周期調(diào)節(jié)途徑調(diào)控?cái)M南芥對(duì)光照的響應(yīng),toc1突變會(huì)導(dǎo)致擬南芥的晝夜節(jié)律縮短[46-47]。SVP通過(guò)結(jié)合FT的啟動(dòng)子區(qū)域,抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)從而調(diào)控開花,在擬南芥中過(guò)表達(dá)SVP具有延遲開花的作用[48-50]。以上抑制開花基因在過(guò)表達(dá)MsCOL2紫花苜蓿中表達(dá)均上調(diào)。綜上,MsCOL2可能在紫花苜蓿開花途徑中發(fā)揮上調(diào)抑制開花基因表達(dá)水平的作用,從而導(dǎo)致開花延遲。

4 結(jié)論

MsCOL2受光周期和外源激素GA3和SA的誘導(dǎo)表達(dá),暗示在光周期和激素開花調(diào)節(jié)途徑中發(fā)揮作用。MsCOL2能夠上調(diào)抑制開花基因的表達(dá)水平,下調(diào)促進(jìn)開花基因表達(dá)水平。表型觀察顯示紫花苜蓿開花延遲,表明MsCOL2在延遲苜蓿開花的調(diào)控機(jī)制有重要的作用。