羅廣科， 穆榕博， 薛冰， 張樺， 任燕萍， 麻浩，4

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學干旱區(qū)荒漠研究所，烏魯木齊 830052；3.新疆農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，烏魯木齊 830052； 4.南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，南京 210095）

轉錄因子（transcription factors，TFs）是一種通過與DNA 或其他蛋白質復合物的特定序列結合來調(diào)控基因表達的蛋白質[1]。轉錄因子與脅迫應答基因上游的順式作用元件相結合從而激活或者抑制基因的表達[2]。NAC 類轉錄因子是植物所特有的轉錄因子家族之一，并且已經(jīng)在多個植物中被鑒定及研究[3]。

NAC 轉錄因子廣泛參與植物的生長發(fā)育、脅迫響應以及調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成等過程。擬南芥NAC1基因受生長素的誘導，主要在根尖和側根生長原基表達，在擬南芥中過表達NAC1基因能促進側根的發(fā)育[4]。小麥TaRNAC1是根中特異表達的NAC 轉錄因子，TaRNAC1在小麥根系中過表達可增加轉基因小麥的根長、生物量和耐旱性[5]。荔枝果實中NAC 轉錄因子LcNAC1的表達量在荔枝果皮和果肉的衰老過程中會增加，表明它可能會促進荔枝果實的衰老[6]。在水稻中過表達OsNAC2能夠加速葉片衰老，而敲除OsNAC2則能夠延緩葉片衰老，表明OsNAC2參與了水稻葉片的衰老過程[7]。小麥TaNAC1在其對條銹病的響應途徑中起負調(diào)控因子作用。當TaNAC1基因沉默時，轉基因擬南芥對于條銹病的抗性增強[8]。水稻轉錄因子ONAC066的表達量受稻瘟病菌影響顯著，且過表達ONAC066增強了水稻對稻瘟病和白葉枯病的抗性[9]。Chen 等[10]發(fā)現(xiàn)大麥轉錄因子HvNAC6可以增強大麥對白粉病的抗性。研究表明，將鷹嘴豆脅迫響應基因CarNAC5轉入擬南芥，增強了擬南芥對干旱脅迫的耐受性[11]；HaNAC2基因提高了煙草在干旱和高溫環(huán)境中的耐受性[12]；將山葡萄VaNAC26基因在擬南芥中異源表達發(fā)現(xiàn)，VaNAC26可以上調(diào)茉莉酸合成基因和茉莉酸信號通路中的基因表達，提高擬南芥體內(nèi)的茉莉酸含量，增強其對干旱的耐受力[13]。

梭梭[Haloxylon ammodendron(C.A.Mey.)Bunge]是我國西北干旱半干旱地區(qū)荒漠主要的建群種之一，在荒漠草地生態(tài)系統(tǒng)的防風固沙、維持生物多樣性、改善沙區(qū)小氣候等方面發(fā)揮了巨大作用。梭梭對干旱、高溫、鹽堿、風蝕等極端逆境具有很高的耐受能力，這是因為梭梭在長期的進化過程中對其所遭受的各種逆境脅迫形成了一系列獨特的適應機制。因此，利用分子生物學手段深入研究梭梭抵抗逆境脅迫的分子機制，一方面可以為干旱地區(qū)的生態(tài)保護與恢復重建提供理論支撐；另一方面可挖掘優(yōu)質抗逆基因資源，對培育具有優(yōu)良抗逆性的糧食作物、經(jīng)濟作物等具有十分重要的意義。

研究表明，NAC 轉錄因子在改良作物品質，提高植物的抗逆性等方面發(fā)揮了重要的作用，繼續(xù)深入研究NAC 轉錄因子的分子機制對于植物品種的改良具有重大意義。本實驗室前期對梭梭轉錄組測序，篩選得到1個NAC基因，將其命名為HaNAC38（登錄號為KU845322）。劉豪等[14]分析表明，經(jīng)干旱、高鹽、高溫脅迫處理后其表達量明顯上調(diào)，推測HaNAC38基因在梭梭響應逆境脅迫中起重要作用；姜子焱[15]通過農(nóng)桿菌介導的浸花法獲得了過表達HaNAC38轉基因擬南芥T1代種子。本研究在此基礎上對過表達HaNAC38轉基因擬南芥進行陽性純合株系鑒定和篩選，并對篩選得到的3個HaNAC38表達量較高的純合轉基因擬南芥株系進行模擬干旱和鹽脅迫，分析過表達HaNAC38轉基因擬南芥的抗逆性，并對HaNAC38轉錄因子的DNA 結合活性進行分析，為進一步了解梭梭NAC 轉錄因子在抵御逆境脅迫的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗所用過表達HaNAC38轉基因擬南芥T1代種子和野生型擬南芥（Col-0）種子為本實驗室留存。

1.1.2 菌種和質粒HaNAC38-pCambia3301克隆菌液、pGADT7、pHIS2 載體 、Y187 酵母菌株均為本實驗室保存。

1.1.4 引物設計與合成 根據(jù)HaNAC38基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設計用于在分子水平鑒定轉基因擬南芥陽性植株的HaNAC38-F/R 引物和載體通用PPT-F/R 引物、半定量篩選HaNAC38表達量的HaNAC38BDL-F/R 引物和內(nèi)參基因Actin-F/R 引物、驗證HaNAC38 與DNA 核心序列結合活性分析的HaNAC38-pGADT7-F/R引物和Core-pHIS2-F/R核心序列以及mCore-pHIS2-F/R引物（表1）。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in experiment

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料準備 挑取籽粒飽滿、大小相近的過表達HaNAC38轉基因擬南芥T1代種子和野生型（wild type，WT）擬南芥種子，首先用75%（體積分數(shù)）乙醇消毒3 min；然后用1%（體積分數(shù)）次氯酸鈉溶液消毒3 min；最后用無菌水反復清洗7～8 次后，種在MS 培養(yǎng)基上。于溫度22 ℃、光照/黑暗16 h/8 h、濕度75%～80%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 純合轉基因擬南芥株系的鑒定與篩選 轉基因擬南芥純合株系的篩選與鑒定方法參照顧進寶等[16]的方法，參照徐洪偉等[17]、許峰等[18]的半定量PCR 方法檢測HaNAC38基因在擬南芥中的相對表達量。

1.2.3 發(fā)芽試驗 利用含有300 mmol·L-1甘露醇的MS 培養(yǎng)基模擬干旱脅迫，含有150 mmol·L-1NaCl 的MS 培養(yǎng)基模擬鹽脅迫，以MS 培養(yǎng)基作為對照（CK）。將野生型擬南芥株系（WT）和過表達擬南芥株系（38-1、38-2和38-3）分別點種在培養(yǎng)基中。種子處理和統(tǒng)計參照楊迪等[19]方法。

1.2.4 生理指標測定 選取4 周齡長勢良好、形態(tài)均一的過表達擬南芥幼苗和野生型擬南芥幼苗，進行干旱和鹽脅迫處理。

干旱脅迫處理：在幼苗澆足水后進行自然干旱處理，在自然干旱處理第10 天采集葉片。對照組每隔3 d正常澆灌一次清水，每次澆灌500 mL。

鹽 脅 迫 處 理：每 隔3 d 澆 灌200 mmol·L-1NaCl 溶液1 次，每次澆灌500 mL，在鹽脅迫的第7 天時采集葉片。對照組澆灌清水，每隔3 d 澆灌1次，每次澆灌500 mL。

擬南芥葉片的丙二醛（MDA）含量測定利用丙二醛測定試劑盒，脯氨酸含量測定利用脯氨酸（Pro）測定試劑盒，過氧化氫含量測定利用過氧化氫測定試劑盒，過氧化氫酶活性測定利用過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒。

“先生自己也念書。后來，我們的聲音便低下去，靜下去了，只有他還大聲朗讀著：‘鐵如意，指揮倜儻，一坐皆驚呢；金叵羅，顛倒淋漓噫，千杯未醉嗬……’

1.2.5 擬南芥離體葉片失水率測定 取正常生長20~30 d的擬南芥植株，用剪刀從每株同樣部位剪取葉片，置于濾紙上立即稱鮮重（w0）；然后將載有離體葉片的吸水濾紙置于25 ℃室溫正常光照條件下使其慢慢失水，分別在離體后30、60、90、120、180 min時稱重，分別記錄為w30、w60、w90、w120、w180，3 次重復。根據(jù)以下公式計算每個時間點（n）的失水率（Ln）。

1.2.6 HaNAC38 蛋白DNA 結合活性分析 將實驗室留存的HaNAC38基因克隆菌液劃線活化，挑取單菌落擴大培養(yǎng)提取質粒送測序，將測序結果正確的質粒作為模板，用HaNAC38-pGADT7-F/R的引物進行PCR克隆，PCR的反應體系為上下游引物各2 μL，質粒4 μL，10×TransStart?TaqBuffer 5 μL，dNTPs 4 μL，TransStart?TaqDNA Polymerase 1 μL，ddH2O 34 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 35個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物使用1%（質量體積分數(shù)）瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對條帶大小符合預期的產(chǎn)物純化回收，同時雙酶切線性化pGADT7 載體，根據(jù)ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit 所附說明書將HaNAC38構建至pGADT7載體上。

將核心DNA 結合引物Core、mCore及其互補序列在PCR 儀中合成，PCR 反應體系為上下游引物各10 μL，10×H Buffer 5 μL，ddH2O 25 μL；PCR程序為94 ℃ 30 s，25 ℃ 3 min。形成帶有酶切位點的雙鏈DNA。雙酶切線性化雙鏈DNA 及pHIS2 載體同樣根據(jù)ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit 說明書將設計的Core、mCore序列構建到pHIS2載體上。

根據(jù)Frozen-EZ Yeast Transformation ITM 試劑盒說明書培養(yǎng)制備Y187酵母感受態(tài)細胞，將構建好的HaNAC38-pGADT7 和Core-pHIS2 載體共轉化酵母感受態(tài)細胞，觀察其在缺陷型培養(yǎng)基中的生長狀況并進行X-Gal染色分析[20]。

利用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析、獨立樣本t檢驗分析各株系間的差異；數(shù)據(jù)可視化在Origin 2021下完成。

2 結果與分析

2.1 過表達HaNAC38轉基因擬南芥純合株系的鑒定與篩選

對實驗室鑒定得到的T3代純合轉基因擬南芥進行HaNAC38基因的熒光定量檢測，篩選出了3 個表達量相對較高的株系38-1、38-2 和38-3，用于后續(xù)功能驗證。

2.2 HaNAC38參與種子萌發(fā)過程

在模擬干旱和鹽脅迫條件下，過表達HaNAC38基因擬南芥3個株系的發(fā)芽率均顯著高于野生型擬南芥（圖1）。

圖1 HaNAC38轉基因擬南芥及野生型擬南芥發(fā)芽率Fig. 1 Germination rates of HaNAC38 transgenic plant and wild type of Arabidopsis thaliana

2.3 HaNAC38參與干旱脅迫響應過程

2.3.1HaNAC38改善擬南芥在干旱脅迫下的生長狀況 在自然干旱脅迫第5 天，野生型擬南芥與HaNAC38基因過表達3個株系的生長狀況無明顯差異；在自然干旱第10 天，野生型出現(xiàn)明顯全株枯黃萎蔫現(xiàn)象，而過表達株系僅部分葉片出現(xiàn)發(fā)枯發(fā)黃現(xiàn)象，癥狀明顯輕于野生型（圖2）。

圖2 干旱脅迫條件下擬南芥各株系生長狀況Fig. 2 Growth status of Arabidopsisthaliana under drought stress

2.3.2HaNAC38提高擬南芥抗旱性 干旱脅迫后，野生型與過表達株系葉片的丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、過氧化氫（H2O2）含量及過氧化氫酶（CAT）活性與未脅迫的對照組相比均極顯著升高（圖3）。其中過表達株系的丙二醛和過氧化氫含量均顯著低于野生型；脯氨酸含量和過氧化氫酶活性均顯著高于野生型。由此表明，在擬南芥中過表達梭梭HaNAC38基因可以顯著降低植株在干旱脅迫后體內(nèi)有害物質的積累，提高擬南芥葉片內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質含量和抗氧化酶活性。

圖3 干旱脅迫條件下擬南芥葉片生理指標Fig. 3 Physiological indices of Arabidopsis thaliana leaves under drought stress

2.3.3HaNAC38調(diào)控擬南芥葉片失水率 測定擬南芥各株系葉片的離體失水率，結果（圖4）表明，葉片離體30 min開始，轉基因過表達株系的葉片失水率顯著低于野生型；離體180 min 后，野生型植株的葉片失水率約為過表達株系的2倍。

圖4 擬南芥葉片離體失水率Fig. 4 Ex vivo water loss rate of Arabidopsis thaliana leaves

2.4 HaNAC38參與鹽脅迫響應過程

2.4.1HaNAC38改善擬南芥在鹽脅迫下的生長狀況 在鹽脅迫第5 天，野生型植株的葉片邊緣出現(xiàn)部分發(fā)黃現(xiàn)象；轉基因株系的葉片未出現(xiàn)發(fā)黃現(xiàn)象。在鹽脅迫第7 天，野生型植株葉片大面積發(fā)黃，且出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象；過表達株系葉片僅邊緣出現(xiàn)輕微發(fā)黃現(xiàn)象。在鹽脅迫第10 天，野生型植株出現(xiàn)葉片干枯、植株枯死現(xiàn)象；過表達株系的葉片發(fā)黃面積增加，小部分葉片出現(xiàn)干枯現(xiàn)象，但植株仍能保持繼續(xù)生長的能力（圖5）。

圖5 鹽脅迫條件下擬南芥各株系生長狀況Fig. 5 Growth status of Arabidopsis thaliana under salt stress

2.4.2HaNAC38提高擬南芥抗鹽性 鹽脅迫處理后，野生型植株和過表達株系葉片的丙二醛、脯氨酸、過氧化氫含量及過氧化氫酶活性均較未脅迫對照極顯著增加，其中，38-3葉片的丙二醛含量顯著低于野生型；38-2 和38-3 葉片的過氧化氫含量均顯著低于野生型；3 個轉基因株系的脯氨酸含量均顯著高于野生型；38-1 和38-3 葉片的過氧化氫酶活性顯著高于野生型（圖6）。

圖6 鹽脅迫條件下擬南芥葉片生理指標Fig. 6 Physiological indices of Arabidopsis thaliana leaves under salt stress

2.5 HaNAC38能與DNA核心序列結合

對構建的重組載體進行PCR 鑒定，用限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ、Xho Ⅰ對HaNAC38-pGADT7 重組載體進行雙酶切鑒定，用EcoRⅠ對mCore-pHIS2和Core-pHIS2 進行酶切，得到預期大小的條帶并送測序，測序結果與理論序列一致地說明表達載體構建成功。

將構建成功的HaNAC38-pGADT7 載體和含有核心序列的Core-pHIS2 載體共轉化至Y187 酵母細胞中，觀察其在缺陷培養(yǎng)基中的生長狀況，結果（圖7）表明，HaNAC38 轉錄因子可以與TTGCGT核心序列的3個串聯(lián)（5’-CGGAATTCTTTTTGCGTTTGTTGCGTTTTTTGCGTTGAGCTCG-3’，GAATTC 為EcoRⅠ酶切位點，GAGCTC 為SacⅠ酶切位點）在酵母體內(nèi)結合，并激活下游報告基因的表達，且HaNAC38 不能與TTGCGT 核心序列的突變序列TTGAGT結合。

圖7 HaNAC38與DNA核心序列在酵母體內(nèi)的結合Fig. 7 Binding of HaNAC38 to the DNA core sequence in yeast

3 討論

在正常的培養(yǎng)狀態(tài)下，轉入了梭梭HaNAC38基因的擬南芥株系種子發(fā)芽率顯著低于野生型擬南芥株系的發(fā)芽率。目前已有多個研究報道表明，NAC 轉錄因子基因可能會延遲或降低種子的萌發(fā)。彭輝[21]在擬南芥體內(nèi)過表達CarNAC2基因發(fā)現(xiàn)轉CarNAC2基因擬南芥種子萌芽延遲，發(fā)芽勢較低。李志強[22]構建梭梭NAC 蛋白家族系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)梭梭HaNAC38所屬的SENU5亞家族與鷹嘴豆CarNAC2所屬的XND1 亞家族親緣關系最近，推測梭梭HaNAC38可能與CarNAC2具有相似的生物學功能。張翔[23]在日本晴品種水稻中超表達OsNAC45基因發(fā)現(xiàn)超表達轉基因種子的發(fā)芽與野生型日本晴水稻相比稍有延遲，總發(fā)芽率基本一致。且在含有ABA 的情況下，OsNAC45超表達植株的發(fā)芽以及發(fā)芽后生長相較于野生型日本晴均受到更為嚴重的抑制。劉豪等[14]對梭梭HaNAC38基因的表達模式進行熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)HaNAC38在ABA的誘導后表達量最高達處理前的50倍，推測梭梭HaNAC38在種子發(fā)芽中參與ABA 信號傳導的過程可能與OsNAC45具有相似性。

本研究表明，在干旱和鹽脅迫下，過表達HaNAC38擬南芥的生長狀況顯著優(yōu)于野生型，HaNAC38基因的過表達顯著降低擬南芥植株在脅迫后的MDA 含量，減輕了細胞的損傷，增強了擬南芥的耐受能力。在干旱和鹽脅迫后，過表達HaNAC38擬南芥體內(nèi)的H2O2含量顯著低于野生型，CAT 活性顯著高于野生型。據(jù)此推測梭梭HaNAC38基因可能通過調(diào)控活性氧清除系統(tǒng)相關基因來提高植株的抗逆能力。

大量的研究表明NAC 轉錄因子提高了植物對于非生物脅迫的耐受能力。劉豪等[14]通過構建HaNAC38系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，梭梭HaNAC38與AtNAC3親緣關系較近。有研究發(fā)現(xiàn)在番茄中過表達2 個AtNAC3相關基因可以提高番茄的耐鹽和抗旱性[24]。在擬南芥中過表達來自多枝檉柳的ThNAC7基因，降低了擬南芥在干旱和鹽脅迫下的H2O2含量，增強了擬南芥的耐鹽、抗旱能力[25]。SNAC3基因在水稻中過量表達，能夠調(diào)節(jié)轉基因水稻的ROS 清除能力，從而增加其對于高溫、干旱和氧化的耐受能力[26]。這些研究表明，NAC 轉錄因子基因能夠通過增強 ROS 清除能力來提高植株非生物脅迫耐受性。這與本研究中過表達HaNAC38基因能夠提高擬南芥抗旱和耐鹽能力的結果相一致。

NAC 轉錄因子家族的基本特點是具有1個髙度保守的N 端結構域，該結構域可以影響轉錄因子與DNA 序列的結合情況。NAC 轉錄因子家族具有相對保守的N 端結構域說明不同植物中的NAC 轉錄因子可能具有相同的可以結合的DNA核心元件。目前已有研究證實，擬南芥的NAC 轉錄因子ANAC019、ANAC055、ANAC072 都能夠與干旱誘導基因ERDⅠ啟動子中的核心DNA 結合元 件CACG 特 異 結 合[27]；AtNAM 和NAC1 可 以 和35S 啟動子中包含CGTA 基序的核心序列結合[28]。而核心元件的側翼序列則影響了NAC 轉錄因子與核心元件的結合。本研究對HaNAC38轉錄因子可能特異性結合的核心序列進行篩選及鑒定，發(fā)現(xiàn)HaNAC38轉錄因子可以在酵母體內(nèi)特異性結合與脅迫應答相關的TTGCGT 核心序列，但這種結合是否可以在梭梭體內(nèi)或者其他植物中發(fā)生還需要進一步的驗證。下一步將從啟動子中的脅迫應答元件出發(fā)，尋找梭梭HaNAC38轉錄因子可能結合的DNA核心序列，對于研究梭梭NAC38轉錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡體系具有重要意義。